Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В прошлом году нами было показано, что наличие пространственной структуры в 5’-нетранслируемой области мРНК может влиять на эффективность трансляции этой мРНК. Для уточнения роли пространственных структур, расположенных в относительной близости к стартовому кодону, была разработана схема, включающая как модельные, так и природные мРНК-конструкты. Было показано, что мРНК-конструкты, содержащие вторичные шпилечные структуры в 5’-области относительно последовательности Шайна-Дальгарно, обладают более высокой аффинностью к 30S инициаторным комплексам (IC) по сравнению с линейной мРНК и демонстрируют высокую эффективность в образовании дипептида. Наименьшей прочностью связывания с 30S IC и низким уровнем синтеза дипептида характеризовались конструкты со шпилечными структурами с высокой свободной энергией укладки включавшими последовательность Шайна-Дальгарно и стартовый кодон. При этом снижение прочности шпилечной структуры приводило к увеличению количества синтезируемого дипептида, несмотря на относительно невысокую аффинность взаимодействия мРНК с 30S IC. Была проведена характеристика образования 30S IC с использованием таких антибиотиков, как стрептомицин, спектиномицин и виомицин. В присутствии антибиотиков 30S IC образовывался с большей эффективностью, чем в свободной системе. Наибольший эффект был обнаружен для стрептомицина. При этом было показано, что в присутствии стрептомицина мРНК с корректным кодоном в Р сайте связывается более прочно, что, вероятно, и является причиной более эффективного образования 30S IC. Однако, присутствие некорректного кодона в Р сайте приводит к снижению прочности связывания. Эти данные могут означать, что стрептомицин не индуцирует ошибочное прочтение в Р сайте, в отличие от действия данного антибиотика на А сайт. В ходе реализации проекта было проведено криоЭМ исследование инициаторного комплекса, содержащего пространственную структуру в 5’-нетранслируемой области (mTufA). Было идентифицировано 5 классов комплексов с разными вариантами упаковки мРНК, однако структуры, которая была бы схожей с данными моделирования, обнаружить не удалось. Были получены новые структурные данные для 30S инициаторных комплексов. Трехмерная реконструкция и классификация комплексов позволили получить 14 различных структур в диапазоне разрешений от 3.2Å до 5.7Å. Анализ демонстрирует наличие 30S IC на разных этапах инициации, а также высокую конформационную лабильность инициаторных факторов. Удалось разделить три существенно различающихся положения IF3 на рибосоме. При этом С-терминальный домен IF3 находился в одном положении в непосредственной близости от кодона мРНК в Р сайте, тогда как N-концевой домен совершал поступательное движение вслед за тРНК. В полученной нами структуре удалось визуализировать компактный N-концевой домен IF2, что, как правило, не удается в криоЭМ исследованиях инициаторных комплексов. N-концевой домен IF2 соединен линкером с G-доменом IF2 и взаимодействует со спиралью h16 30S субъединицы. В относительной близости от N-концевого домена также оказывается белок S12, который вовлечен в процесс декодирования. Детальный анализ структурных перестроек аккомодационного комплекса в зависимости от прохождения пептидилтрансферазной реакции показал, что образование пептидной связи, возникающее сразу после аккомодации аминоацил-тРНК в А сайте, вызывает масштабное перемещение А-сайтового пальца на 10 Å для образования контакта с А-сайтовой тРНК и головой 30S субъединицы для того, чтобы осуществлять координацию и сопровождение дальнейшего движения тРНК из А в Р сайт во время транслокации.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В этом году была проделана работа по изучению конформационной динамики инициаторного фактора IF3 в составе 30S инициаторного комплекса. Для изучения предстационарной кинетики была создана модифицированная версия IF3, содержащая 2 флуорофора. Набор функциональных тестов показал, что данная версия белка полностью функциональна как на этапе образования 70S инициаторного комплекса, так и на этапе элонгации. В частности, рибосомный инициаторный комплекс, сформированный с участием меченного IF3, был эффективен в пептидилтрансферазной реакции, что говорит о корректном положении иинициаторной тРНК в Р сайте рибосомы и способности данного комплекса акцептировать и аккомодировать поступающую аминоацилированную тРНК в А сайт. Использование флуориметрии остановленного потока позволило показать, что для выполнения своей функции домены IF3 меняют свое положение. Так, было определено, что IF3 участвует в распознавании инициаторной fMet-tRNAfMet, причем распознавание идет не только на уровне самой тРНК (дискриминируется элонгаторная тРНК в пользу инициаторной), но также учитывается и наличие формильной группы на остатке метионина инициаторной тРНК. При этом происходит раскрытие IF3 с отдалением доменов друг от друга. Далее происходит взаимодействие с мРНК для оценки корректности инициаторного кодона, при этом наблюдается переориентация доменов. Также была произведена оценка конформационной динамики доменов IF3 при взаимодействии IF1 и IF2 с рибосомным комплексом, что позволило составить полную картину конформационной подвижности IF3 на рибосоме, связанную с выполнением основных функций этого белка. В этом году было показано, что реакции в А-сайте рибосомы во многом зависят от элонгационного фактора EF-Tu, его взаимодействия с аа-тРНК, а также с рибосомным комплексом. Проводилось изучение эффективности А-сайтовых реакций с использованием гетерологичного элонгационного фактора EF-Tu из Thermus thermophilus в системе in vitro трансляции, все остальные компоненты которой принадлежали E. coli. Подобная замена оправдана, так как аминокислотные последовательности этих белков идентичны на 71%, а структурные и функциональные свойства схожи. Использование 2 разных флуоресцентных репортера показало, что EF-Tu из Thermus thermophilus способен эффективно доставлять аа-тРНК в А сайт рибосомы, однако скорость доставки снижается на порядок по сравнению с гомологичным белком. Причем снижение скоростей сохранялось как при 20, так и при 37 ºС. Мы сравнили эффективность транслокации, катализируемой мезофильным и термофильным элонгационным фактором EF-G. Практически во всем диапазоне температур (от 15 до 50 ºС) скорость транслокации была одинаковой для обоих используемых факторов. Значительные отличия в скорости транслокации были детектированы только для температуры 50 ºС, что, скорее всего, было обусловлено частичной температурной денатурацией EF-G из E. coli. Таким образом, можно сделать вывод о том, что элонгационные факторы термофильного организма могут эффективно поддерживать трансляцию в реконструированной in vitro системе трансляции E. coli. При этом скорость А-сайтовых реакций снижается приблизительно в 10 раз, вероятнее всего, из-за того, что превалирующую роль в этих реакциях играет EF-Tu и его замена на гетерологичный приводит к нарушению части контактов с тРНК и/или рибосомой. Участие гетерологичного EF-G не приводит к изменению скорости транслокации, несмотря на всего лишь 60% идентичность аминокислотной последовательности EF-G из E. coli и T. thermophilus. Наши данные указывают на то, что EF-G лишь создает необходимые условия для протекания реакции, тогда как сама реакция обусловлена в большей степени взаимодействием тРНК и рибосомы. Дополнительно можно отметить, что в основе реакции транслокации лежит разрыв кодон-антикодонового взаимодействия в Р сайте и термофильный EF-G, адаптированный для осуществления этого процесса в термофильной рибосоме, которая по определению обладает повышенной структурной жесткостью, может эффективно справляться с этой задачей в более лабильном мезофильном рибосомном комплексе. В этом году было показано, что антибиотик мадумицин, который связывается в пептидилтрансферазном центре большой рибосомной субъединицы, не влияет на формирование инициаторного комплекса. Однако, наличие мадумицина приводит к снижению эффективности связывания аа-тРНК в А сайт рибосомы. При этом наличие мадумицина в А-сайтовой щели, в которой должен располагаться акцепторный конец аа-тРНК после аккомодации, препятствует не только корректному расположению аминокислотного остатка аа-тРНК и ее ССА-конца, но также дестабилизирует тРНК в А сайте и повышает вероятность ее диссоциации.