КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-14-00328

НазваниеИзменение мультиома опухолевой линии клеток печени при генном нокауте

РуководительПономаренко Елена Александровна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2020 г. - 2022 г. 

Конкурс№45 - Конкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словатранскриптомика, протеомика, метаболомика, опухолевая линия клеток печени, генное редактирование, нокаут гена, CRISPR/Cas9, секвенирование, масс-спектрометрия, интерактомика, системная биология

Код ГРНТИ76.03.31

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Развитие технологий молекулярного анализа в сторону высокопроизводительного секвенирования, протеомного и метаболомного анализа позволило получить множество данных, расширив представление о возможностях реализации генома. В частных случаях это уже позволило создать как биомаркеры, так и лекарства. Тем не менее, на сегодняшний день остается много «пробелов», не позволяющих описать полные пути экспрессии и трансляции генов, их взаимосвязи и функции. Иллюстративным примером необходимости полной карты реализации генетической информации является область онкологических заболеваний. Опухоли одной локализации и морфологии могут кардинально различаться молекулярно в силу нарушений в клеточных процессах. Множество путей развития даже одного типа рака представляет собой критическую проблему, с которой сталкиваются не только исследователи, но и врачи. Подбор терапии в каждом случае должен учитывать путь патологического процесса, метастатический потенциал клеток, их агрессивность и чувствительность к терапии. Отсутствие полной расшифровки генома (т.е. путей реализации генома в фенотип) является не только фундаментальной, но и прикладной проблемой. Развитие медицины невозможно без целостного представления о функционировании организма, органов и тканей, клеток, т.е., без детального описания взаимосвязей генов, кодируемых им продуктов и протекающих процессов. Таким образом, разработка биомаркеров, выявление мишеней действия лекарств, а также побочных эффектов использования данных лекарств непосредственно связаны с увеличением знаний в области системной биологии. После секвенирования генома, технология нокаута отдельных генов (подавления экспрессии) стала одной из основных при изучении функций генов в различных биологических процессах как in vivo, так и in vitro. В области функциональной протеомики нокаут применяют для изучения роли некоторых генов в различных ситуациях, что позволяет получить детальное понимание биологических процессов и механизмов заболеваний. В перспективе нокаут рассматривают в качестве возможного терапевтического средства, блокирующего отдельные гены при различных патологических состояниях, таких как раковые, нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания.

Ожидаемые результаты
Аспекты реализации геномной информации и регуляции клеточных процессов являются ключевым вопросом системной биологии, непосредственно связанным с развитием медицины. Известно, что в каждом типе биологического материала экспрессируется около половины генома, при этом количество реализуемых белков остается неизвестным на сегодняшний момент. С одной стороны, выявить закономерности и взаимосвязи между различными уровнями реализации генетической информации возможно путем создания минимального генома, обеспечивающего функционирование клетки. Другим методом является изменение регуляции экспрессии генов с последующим молекулярным профилированием. В большинстве исследований анализируют только один уровень реализации генома, преимущественно транскриптомный. В данном проекте предлагается использовать мультиомное профилирование в панорамном режиме, т.е. оценить изменения, возникающие в ответ на нокаут гена, на транскриптом, протеомном и метаболомном уровнях. Результатом проекта будут новые знания о геноме человека, в частности, о «потерях» при экспрессии за счет метилирования и при трансляции за счет РНК-интерференции, взаимосвязях между кодируемыми одним геном транскриптами и белками, метаболитами. Текущие исследования вопроса соответствия транскриптома и протеома показали отсутствие прямой корреляции между этими типами данных, что не позволяет предсказывать наличие и уровень экспрессии белка (даже без учета аберрантных протеоформ). Выявление изменений на «мультиомном» уровне через выключение экспрессии ключевых генов позволит определить взаимосвязи между транскриптомом и протеомом. В частности, сведения о качественном и количественном изменении транскриптома, протеома и метаболома опухолевой линии клеток печени впоследствии могут быть использованы при моделировании для прогнозирования уровня трансляции белка по количественному составу транскриптома того же образца. Определение изменений на разных уровнях реализации генома путем нокаута сначала одного целевого гена, а затем потенциально взаимосвязанного с этим геном партнера позволит расширить представления о взаимодействии между генами, а также регуляции этого взаимодействия, выявить альтернативные пути в клеточных процессах, а также функции отдельных генов. Для получения полной картины функционирования клетки в проекте предлагается использовать несколько временных точек для мультиомного профилирования.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Первый отчетный год реализации проекта, направленного на изучение согласованности транскриптопротеома на примере опухолевой клеточной линии HepG2 с использованием технологии генного нокаута, заключался в получении и описании омикс-данных (геномных, метиломных, транскриптомных, эпитранскриптомных, протеомных, метаболомных и липидомных данных) для одного образца клеточной линии HepG2, и выборе на их основании целевого гена для дальнейшего нокаута. Проведены клеточные работы по подготовке и сохранению единства клеток HepG2 (SCC249, Sigma-Aldrich) для всех запланированных в период реализации гранта работ. Полученные образцы анализировали с использованием высокопроизводительных методов секвенирования (Illumina NovaSeq 6000 и Oxford Nanopore), протеомного (Orbitrap Fusion), метаболомного (LECO Pegasus 4DBT) и липидомного (Maxis Impact qTOF) анализа. Выявлена экспрессия свыше 13 тыс. генов, подтверждена трансляция для 1,3 тыс. генов, детектировано 155 метаболитов и 1 086 уникальных низкомолекулярных соединений в липидной фракции для HepG2. Показано, что 98% вариантов однонуклеотидных замен, найденных в результате транскриптомного анализа, подтверждаются по данным полногеномного секвенирования. Из общих 1602 общих вариантов 1128 являлись гетерозиготами и 474 представляли собой гомозиготы. На протеомном уровне было идентифицировано 25 мутаций, из которых 18 представлены гомозиготами, а 7 – гетерогизотами. Для корректного выбора гена для нокаута было проведено цитогенетическое исследование клеток HepG2, направленное на описание кариотипа, которое в совокупности с результатами обработки результатов полногеномного секвенирования позволили наиболее полно описать характерные для используемых клеток HepG2 хромосомные аберрации. Проведенный мета-анализ полученных и опубликованных данных для клеточной линии HepG2, а также соответствующих данных для гепатоцитов, в соответствии с накопленной информаций о генах человека, позволил определить наилучших кандидатов для дальнейшего нокаута - SUB1 (Positive cofactor 4) и HNRNPA2B1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1).

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Задачей второго года реализации проекта стало получение нокаутной по гену SUB1 (Positive cofactor 4) клеточной линии HepG2 и ее омикс-профилировании (получение экзомных, транскриптомных, протеомных и метаболомных данных) во времени. В результате выполнения работ по нокауту генов были получены не только клетки, нокаутированные по гену SUB1, но и три клона клеток с нокаутированным геном TOMM34 (Mitochondrial import receptor subunit TOMM34). Такое изменение планов обосновано необходимостью учета клеточной гетерогенности при финальном моделировании согласованности транскриптопротеома, для чего требуется минимально три клона, которые не удалось вовремя получить в случае гена SUB1. Для всех полученных нокаутных клеток было выполнено омикс-профилирование в соответствии с параметрами проведенных экспериментов в первом отчетном году. В результате выявлены изменения в биологических процессах, связанных с биосинтезом аминокислот, для клеток, нокаутированных по гену SUB1, а также изменения в процессах гликолиза для клеток, нокаутированных по гену TOMM34. В обоих случаях наблюдались изменения процессов метаболизма липидов, организации митохондрий и процессов иммунного ответа. Дополнительно проведены исследования по молекулярной «стабильности» клеточной линии HepG2 на транскриптомном и метаболомном уровнях. Анализ опубликованных транскриптомных профилей показал хорошую корреляцию по данным экспрессии для клеток HepG2. Выполненное метаболомное профилирование клеток в пяти временных точках инкубации, определенных согласно времени удвоения клеток, показало превалирование различных процессов в разное время, при этом все наблюдаемые изменения характерны для опухолевых процессов в клетках печени.

 

Публикации

1. Дейниченко К.А., Краснов Г.С., Радько С.П., Птицын К.Г., Шаповалова В.В., HUMAN CHR18: “STAKHANOVITE” GENES, MISSING AND UPE1 PROTEINS IN LIVER TISSUE AND HEPG2 CELLS Biomedical Chemistry: Research and Methods, 4(1), e00144 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.18097/BMCRM00144

2. Краснов Г., Шкригунов Т., Радько С., Птицын К., Шаповалова В., Тимошнко О., Хмелева С., Курбатов Л., Киселева Я., Ильгисонис Е., Киселева О., Вахрушев И., Цветкова А., Буромский И., Маркин С., Арчаков А., Лисица А., Пономаренко Е. Human Chr18 transcriptome dataset combined from the Illumina HiSeq, ONT MinION, and qPCR data Data in Brief, 12, 36, 107130 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.dib.2021.107130

3. Пятницкий М.А., Арзуманян В.А., Радько С.П., Птицын К.Г., Вахрушев И.В., Поверенная Е.В. и Пономаренко Е.А. Oxford Nanopore MinION Direct RNA-Seq for Systems Biology Biology, 10(11):1131 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biology10111131

4. Арзуманян В.А., Киселева О.И., Поверенная Е.В. The Curious Case of the HepG2 Cell Line: 40 Years of Expertise International Journal of Molecular Science, 22(23), 13135 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms222313135

5. - Сюжет Первого канала о женщинах-ученых (видео) РНФ, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На третьем году реализации проекта решались задачи по оценке изменений, происходящих с клетками с нокаутом по гену SUB1 (SUB1 Regulator Of Transcription) и по гену TOMM34 (Translocase Of Outer Mitochondrial Membrane 34) при продолжительном культивировании. Для каждого типа клеток с нокаутом было выполнено омикс-профилирование (анализ транскриптома, протеома и метаболома) аналогично проведенным ранее омиксным исследованиям дикого типа клеточной линии HepG2. Согласно полученным данным, при продолжительном культивировании клеток с нокаутом по гену ТОММ34, в этих клетках происходит изменение процессов в сторону восстановления функционирования митохондрий, а также увеличения уровня метаболизма пуринов. Клетки с нокаутированным SUB1, несмотря на слабое влияние нокаута на баланс клеточных процессов, при продолжительном культивировании демонстрируют развитие нарушений адаптации и поддержания метаболизма на достаточном уровне. По результатам проведенной работы нами были охарактеризованы общие и частные черты изменения клеточных процессов при нокауте генов TOMM34 и SUB1 в клеточной линии HepG2. При анализе корреляций между различными уровнями организации молекулярных процессов, включая копийность генов, их экспрессию, уровень метилирования, а также мутационной нагрузки, нами не были выявлены выраженные паттерны, которые позволили бы объединить полученную информацию в единую модель взаимосвязей.

 

Публикации

1. О.И. Киселева, И.Ю. Курбатов, В.А. Арзуманян, Е.В. Ильгисонис, И.В. Вахрешев, А.Ю. Лупатов, Е.А. Пономаренко и Е.В. Поверенная Exploring Dynamic Metabolome of the HepG2 Cell Line: Rise and Fall Cells MDPI, 10; 11(22):3548 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/cells11223548

2. Поверенная Е.В., Киселева О.И., Арзуманян В.А., Пятницкий М.А., Вахрушев И.В., Пономаренко Е.А. Несинонимичные однонуклеотидные замены и инделы: вклад в молекулярный постгеномный портрет клеточной линии HEPG2 Успехи современной биологии, - (год публикации - 2023)

3. Поверенная Е.В., Пятницкий М.А., Долгалев Г.В., Арзуманян В.А., Киселева О.И., Курбатов И.Ю., Курбатов Л.К., Вахрушев И.В., Ромашин Д.Д., Ким Я.С., Пономаренко Е.А Exploiting Multi-Omics Profiling and Systems Biology to Investigate Functions of TOMM34 Biology, 12(2):198 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/biology12020198

Возможность практического использования результатов
Несмотря на то, что срок жизни линий раковых клеток в принципе бесконечен, чрезмерное культивирование предположительно приводит к потере клеточной идентичности. Мы подчеркнули, как важно распознать "небезопасный момент", когда клеточная линия перестает поддерживать свои ключевые макро- и микро-характеристики. Наше исследование показало критическую значимость декларирования пассажа клеточной линии при публикации результатов — с одной стороны, и учета его в мета-анализе или тестировании препаратов и оценке их токсичности — с другой. С популяризацией мультиомных исследований (сосредоточенных в руках одной исследовательской группы или подразумевающих анализ метаданных, размещенных в публичных репозиториях) все более очевидной становится важность согласованности и синхронности получаемых результатов. Проведенный комплексный анализ позволил идентифицировать консервативные омикс-паттерны клеток HepG2 (дикого типа и подвергнутых нокауту по генам TOMM34 и SUB1), которые имеют тенденцию к колебаниям. Обозначенные заметные, хоть и не всегда систематические сдвиги в получаемых результатах относительно клеток дикого типа должны быть взяты в рассмотрение при интерпретации экспериментальных данных. Для онко-ассоциированных генов SUB1 (SUB1 Regulator Of Transcription) и TOMM34 (Translocase Of Outer Mitochondrial Membrane 34) получены новые сведения об их функциях, что, безусловно, расширяет возможности исследователей в расшифровке онкологических процессов и дальнейшему созданию биомаркеров и лекарств. В частности, хотя о функционировании гена TOMM34 известно немного, тем не менее, на основе пептидов кодируемого им белка создана противораковая вакцина, для которой сейчас проходит вторая стадия клинических испытаний.