Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Авторами проекта ранее была показана возможность предложенной ими технологии ЛИМС значительно расширить список культивируемых микроорганизмов по сравнению с традиционными методами культивирования. Принцип действия ЛИМС основан на переносе микроскопического количества гелевого субстрата с микроорганизмами с донорной пластины на акцепторную вследствие нагрева наносекундным лазерным импульсом поглощающей плёнки донорной пластинки, на которой находится тонкий слой геля. Ее отличительная особенность состоит в сохранении естественного окружения микроорганизма, а также в стимулирующем воздействии сопровождающих физических факторов, таких как импульс давления, ускорение, фотооблучение. За первый год выполнения проекта было создано четыре специальные стенда, выполненные в конфигурации ЛИМС, с помощью которых удалось решить несколько физических, технологических, биофизических и микробиологических задач. Среди успешно решенных физических и технологических задач можно выделить следующие: 1) Методами оптоакустики получены экспериментальные оценки возникающих импульсных давлений и температур в области лазерного воздействия. Показано, что при используемых в технологии ЛИМС параметрах лазерного воздействия вблизи поглощающего покрытия на короткое время (4,5 нс при энергии лазерных импульсов 65 мкДж) вода переходит в сверхкритическое состояние. 2) С помощью скоростной видеосъемки для подложек с покрытиями из Au и Cr толщиной 50 нм получены экспериментальные оценки динамических нагрузок в процессе лазерной печати. Исследован широкий диапазон параметров лазерного воздействия, использованы различные типы гелей на основе альгината, гиалуроновой кислоты и метилцеллюлозы. Определены параметры лазерных импульсов (флюенсы и длительности), обеспечивающие различные режимы печати в технологии ЛИМС: допороговый; однокапельного переноса; высокоскоростной; турбулентный и факельный. Установлено, что при оптимальных флюенсах (1-4 Дж/см2) и длительности 8 нс скорость микроструи составляет 20-50 м/с, а динамические нагрузки - 100-1000 км/с2. 3) Показана возможность реализации метода ЛИМС без поглощающего металлического слоя с использованием лазерного импульсного источника с длиной волны 3 мкм. В качестве источника использовался лазер, выдающий последовательности наносекундных импульсов с энергией 1 мкДж и частотой 10 МГц, в качестве донорной подложки - пластинка сапфира толщиной 1 мм. 4) Разработан протокол стерилизации гиалуроновой кислоты, используемой в технологии ЛИМС, и оптимизированы параметры лазерного переноса клеточных суспензий, в частности, энергия лазерного излучения, молекулярная масса и концентрация гиалуроновой кислоты. Установлено, что оптимальным режимом стерилизации гиалуроновой кислоты является автоклавирование при 121°С в течение 15 минут. Показано, что наилучшие результаты при лазерном переносе демонстрирует гель на основе 1,5% среднемолекулярной гиалуроновой кислоты, при этом оптимальная энергия лазерных импульсов лежит в диапазоне 22-24 мкДж. Среди успешно решенных биофизических и микробиологических задач можно выделить следующие: 1) Показано, что выделенный из почвы с помощью технологии ЛИМС штамм Nonomuraea sp. 3-1Str относится к ранее не описанному виду бактерий, а ближайшим описанным видом (по 16S рРНК) является N. indica (сходство 99.1%). Исследованы его физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики. Установлено, что штамм отличается от ближайшего описанного вида по ряду признаков, в том числе температуры роста, уреазная и целлюлазная активность, разжижение желатина, гидролиз тирозина, продукция H2S, использование сорбита, маннита, инозита, арабинозы, маннозы, ксилозы и цитрата в качестве единственных источников углерода, и др. По данным полногеномного секвенирования уровень ДНК-ДНК гибридизации Nonomuraea sp. 3-1Str. N. indica равен 28%, что соответствует новому виду бактерий. Определена последовательность полного гена 16S рРНК. Установлена оптимальная среда культивирования - SNY. Показано, что оптимальная температура культивирования составляет 37°С, а температурные границы роста - 10-37°С. В геноме исследованного штамма обнаружено более 30 генов, кодирующих синтез различных антибиотиков, в связи с чем в дальнейшем планируется тестирование антагонистической активности штамма. 2) Методом ЛИМС получены четыре штамма экстремофильных прокариот: штамм анаэробной ацидофильной и экстремально термофильной археи Caldisphaera lagunensis 3828-KZ1, штамм аэробной термофильной бактерии Thermus sp. 3726 и два штамма аэробной бактерии с пока неопределенной таксономией (3753F-33А и 3753F-32В). Оба, предположительно, являются представителями глубокой линии OPB56. Показано, что ЛИМС может подходить для работы с анаэробными микроорганизмами даже без создания строго анаэробных условий, что может существенно расширить применимость технологии. 3) Показано, что при культивировании эукариотических клеток (дрожжей), перенесенных методом ЛИМС, в сравнении с традиционными методами посева наблюдается достоверно более высокая численность колоний. Выдвинута гипотеза, о том, что наблюдаемое повышение эффективности колониеобразования связано с лучшим пространственным разделением клеток при ЛИМС. 4) Исследовано влияние лазерного импульсного излучения (одного из физических факторов воздействия в технологии ЛИМС) на клетки бактерий Escherichia coli и Micrococcus luteus. Установлено, что такое излучение с длиной волны 1064 нм длительностью импульсов 8 нс при плотности энергии 0,2-0,6 Дж/см2 не оказывает достоверного влияния на их размножение in vitro. Таким образом, за первый год выполнения проекта все поставленные задачи были выполнены полностью и были получены значимые научные результаты. По результатам работы в научные журналы отправлено пять статей (одна из них опубликована, еще три, из которых одна в журнале Q1, приняты к печати). Результаты первого года полностью подтвердили предположение о том, что технология ЛИМС имеет значительный потенциал для практических приложений, а также представляет интерес с точки зрения фундаментальной науки о биотах.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Работы, выполненные по проекту в 2021 году, были направлены на 1) изучение возможностей предложенной авторами технологии лазерной инженерии микробиологических систем (ЛИМС), 2) получение новых научных знаний о физических факторах, действующих на живые системы при лазерном переносе, и 3) совершенствование технологии ЛИМС. Принцип действия технологии ЛИМС основан на переносе микроскопического количества гелевого субстрата с микробиологическими системами с донорной пластины на акцепторную вследствие нагрева наносекундным лазерным импульсом поглощающей плёнки донорной пластинки, на которой находится тонкий слой геля. Ее отличительная особенность состоит в сохранении естественного окружения микроорганизма, обеспечении более "мягких" условий по сравнению с традиционными технологиями биопринтинга, а также в стимулирующем воздействии сопровождающих физических факторов, таких как импульс давления, ускорение, фотооблучение. За второй год выполнения проекта было создано три специальных стенда, выполненные в конфигурации ЛИМС, с помощью которых удалось решить несколько физических, технологических, биофизических и микробиологических задач. В текущем 2021 г: 1) Создан лабораторный стенд для лазерного выделения (скрининга) чистых микробных культур с прозрачным пластиковым боксом для создания специфической среды обитания микроорганизмов. 2) С помощью стробоскопической видеосъемки с импульсной лазерной подсветкой проведены экспериментальные оценки динамических нагрузок в процессе лазерной печати. 3) Проведены теоретическая и экспериментальная оценки интенсивности и дозы лазерного излучения, которым подвергаются микробиологические объекты в процессе лазерной печати. Осуществлены подбор и подготовка тест-культур экстремофильных прокариот и подготовка оптимальных для роста этих культур сред. Выполнена оценка воздействия лазерного излучения на жизнеспособность аэробных экстремофильных прокариот, находящихся в коллекции лаборатории метаболизма экстремофильных прокариот ФИЦ Биотехнологии РАН. 4) Построена модель формирования струи и микрокапель при реализации ЛИМС с подложкой без поглощающего покрытия. Создан экспериментальный стенд для исследования возможности реализации метода ЛИМС при воздействии на поверхность жидкости лазерным импульсом с длиной волны 3 мкм. 5) Проводилось исследование расширения возможностей метода ЛИМС при сочетании его с посевом на наборы моносубстратных жидких сред, помещенных в микропланшеты МСТ с выявлением факторов для дополнительной селекции чистых культур. 6) Проведены исследование биоразнообразия почв и почвоподобных субстратов экстремальных местообитаний и исследование применимости ЛИМС для выделения продуцентов антибиотиков из различных природных субстратов. 7) Продолжены работы по характеризации ранее не описанного вида бактерий рода Nonomuraea, полученного с помощью ЛИМС. 8) Проведены экспериментальные исследования, направленные на определение количества металлических наночастиц, образующихся в процессе лазерной биопечати (метод ЛИМС) и переносимых на акцепторную среду с микрокаплями геля. 9) Проведено исследование динамики разрушения пленки золота донорной пластинки толщиной 50 nm при лазерном переносе по методу ЛИМС. 10) Создана и протестирована экспериментальная установка ЛИМС, позволяющая задавать форму интенсивности пучка наносекундного лазера на поглощающей пленке донорной пластинки. Среди полученных научных результатов и успешно решенных биофизических и микробиологических задач можно выделить следующие: 1) Впервые установлено, что в рабочем диапазоне энергий лазера для технологии ЛИМС вблизи поглощающей пленки Ti донорной пластины могут возникать ударные волны. При этом скачки давления достигают 30 МПа, а эффективность преобразования энергии лазерного импульса в механические постэффекты достигает 10%. 2) Сформулирована гипотеза: Успешное выделение представителя симбиотической группы с помощью технологии ЛИМС происходит только в случае реализации им стратегии выживания, приводящей, например, как и в случае с новым штаммом T. bonchosmolovskayae к образованию скоплений. 3) Показано, что ЛИМС оказывает достоверное воздействие на характер роста дрожжей Candida albicans, Lipomyces lipofer и Saitozyma podzolica. При этом может значительно возрасти разнообразие потребляемых микроорганизмами субстратов. 4) Выдвинутая ранее гипотеза о том, что выявленные различия в результатах влияния лазерного переноса на характер роста дрожжей для разных видов обусловлены наличием или отсутствием полисахаридных капсул не подтвердилась. Установлено, что для некоторых штаммов при посеве традиционными методами наблюдалось снижение числа колоний при добавлении используемого в ЛИМС геля гиалуроновой кислоты. 5) Построена модель формирования струи и микрокапель при реализации ЛИМС без подложки с поглощающим покрытием с использованием лазерного излучения, хорошо поглощающегося в воде. Показана возможность реализации метода ЛИМС при воздействии на поверхность воды лазерным импульсом с длиной волны 3 мкм. 6) Получены дополнительные данные о некоторых физиолого-биохимических характеристиках ранее не описанного вида бактерий рода Nonomuraea, выделенного из почвы методом ЛИМС. Показано, что для исследуемого штамма температурные границы роста составляют +10 ºС и +40 ºС, а оптимальное значение рН составляет 7. Анализ роста бактерии на различных средах показал, что на ксантине, гипоксантине и эскулине рост штамма не происходит. В результате более детального анализа данных последовательностей генов 16S рРНК показано, что исследуемый штамм не относится к виду N. muscovyensis. 7) Экспериментально обнаружено, что практически все наночастицы металлической пленки Ti донорной подложки, образующиеся в результате лазерного воздействия при переносе гелевых капель, остаются в слое гидрогеля на этой подложке, и лишь небольшая их часть (от 0,5 до 2,5% для рабочего диапазона установок ЛИМС) переносится с микрокаплей на акцепторную поверхность. 9) Впервые исследована динамика разрушения пленки золота толщиной 50 нм донорной подложки в результате воздействия наносекундного лазерного импульса при биопечати. Показано, что при превышении порога разрушения пленки первоначально происходит отслоение золотой пленки от стеклянной подложки, а дальнейшее увеличение плотности лазерной энергии приводит к образованию в пленке отверстия. Таким образом, за второй год реализации проекта были полностью выполнены все поставленные задачи, проведены дополнительные важные исследования и получены значимые научные результаты. По результатам работы за время выполнения проекта опубликовано семь статей (из них две в журналах первого квартиля WoS). Результаты полностью подтвердили предположение о том, что технология ЛИМС имеет значительный потенциал для практических приложений, а также представляет интерес с точки зрения фундаментальной науки о биотах.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 г. были выполненные следующие работы: 1) С использованием методик СЭМ и АСМ получены данные о распределении по размерам и формам наночастиц Ti и Au, возникающих в процессе лазерного переноса. 2) Завершены исследования эффективности применения ЛИМС для переноса дрожжей различного аффинитета и образующих/не образующих полисахаридные капсулы. 3) С использованием клеток дикого типа и панели штаммов дрожжей и метода проточной цитометрии изучены уровни теплового и окислительного стрессов на перенесенные клетки, а также влияние ЛИМС на проницаемость клеточных мембран. 4) Проведены исследования, направленные на оптимизацию режимов лазерного переноса с помощью 3 мкм лазера без поглощающего покрытия. 5) Выполнены работы по описанию ранее не описанного вида бактерий рода Nonomuraea, выделенного с помощью ЛИМС. Проведено депонирование штамма Nonomuraea sp. 3-1 Str во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов. 6) Опробована технология ЛИМС для печати биоплёнок анаэробных электрогенных микроорганизмов на миниатюрных чипах для оперативной характеризации их электрокаталитических свойств. 7) Определено влияние ЛИМС на спектры потребления субстратов микроорганизмами Escherichia coli и Bacillus subtilis. 8) Проведено исследование применимости ЛИМС для выделения ассоциативных и/или симбиотических микроорганизмов. Объектами исследования являлись клубеньки бобовых растений (гуар и остролодочник; проанализировано 10 образцов клубеньков). 9) Проведено исследование применимости ЛИМС для выделения галотолерантных микроорганизмов. Объектом исследования являлась почва пустыни Негев (Израиль). 10) Проведены исследования по выделению микроорганизмов из слюны с применением технологии ЛИМС. 11) Проведены исследования, направленные на создание лазерной технологии оперативного тестирования жидких сред на наличие микровключений и технологии ЛИМС, основанной на использовании непрерывного лазерного излучения. 13) Оценено пространственно-временное распределение температуры в слое геля на донорной подложке при лазерном переносе. 14) Проведены прямые измерения уровня энергии лазерного импульса, воздействующего на микробиологические системы в слое геля на донорной подложке. Изучено влияние такого излучения на дрожжевые клетки.