КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-14-00220

НазваниеОдин на всех и все на одного: регуляция взаимодействий партнеров в симбиотических системах между инфузориями и бактериями

РуководительПотехин Алексей Анатольевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2020 - 2022 

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словасимбиоз, инфузории, Paramecium, симбиотические бактерии, Holosporales, Rickettsiales, генетика симбиоза, сравнительная геномика, транскриптомика, бактериальные инфекции, молекулярные взаимодействия между партнерами по симбиозу, регуляторные малые РНК

Код ГРНТИ34.27.21, 34.27.23, 34.15.23


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на исследование генетических и молекулярных механизмов взаимодействия партнеров по симбиозам между инфузориями и бактериями. В природе трудно найти более многоликое, чем симбиоз, явление. Как стало ясно в последние годы, нет ни одного живого организма, который не имел бы собственных симбионтов. Множество глобальных проблем биологии симбиозов могут быть решены только путем накопления и сравнительного анализа данных о разных симбиотических системах. Важным направлением исследований является изучение симбиозов между протистами и бактериями, так как у одноклеточных эукариот любые нарушения тонких взаимодействий между партнерами, приводящие к гибели клетки, приводят одновременно к гибели симбиотической системы и собственно клетки-хозяина. Инфузории, одна из самых разнообразных и распространенных групп протистов, часто выступают хозяевами для широкого круга бактерий. Некоторые из них обладают инфекционностью; в то же время большинство способно только к передаче в популяции хозяев «по вертикали». Геномы симбионтов инфузорий демонстрируют выраженную тенденцию к редукции, и, вероятно, многие функции симбионта обеспечивает хозяин, но для большинства симбиозов между инфузориями и бактериями функциональные взаимоотношения партнеров остаются неизвестными. Симбиозы между инфузориями и бактериями являются перспективными моделями для изучения механизмов бактериальных инфекций, регуляции взаимодействий между эукариотами и прокариотами, адаптации партнеров к симбиозу в результате потери генов и возникновения функциональных зависимостей, коэволюции партнеров по симбиозу. Многие бактериальные симбионты инфузорий близкородственны внутриклеточным симбионтам и патогенам животных и человека, что делает изучение этих бактерий и практически важным. Объектом исследований станут инфузории Paramecium, которые служат хозяевами для широкого круга бактерий. Геномы ряда видов Paramecium и многих симбиотических бактерий из порядков Rickettsiales и Holosporales были секвенированы в последние годы или будут секвенированы в рамках проекта. Наличие хорошо поддерживающихся в лаборатории сложных симбиотических систем, в которых для обоих партнеров секвенирован геном, создает необходимые предпосылки для перехода на следующий уровень изучения взаимодействий партнеров - анализ транскриптомов. Исследование транскриптомов позволит выявить дифференциально экспрессирующиеся на каждой стадии развития и поддержания симбиоза гены инфузории и бактерий. Дальнейшее определение функции этих генов позволит приблизиться к расшифровке молекулярных взаимодействий партнеров. Большой интерес представляют исследования некодирующих малых РНК, продуцируемых партнерами по симбиозу, чью роль в регуляции взаимодействий инфузорий с бактериями еще предстоит до конца оценить.

Ожидаемые результаты
Цели проекта соответствуют вызовам текущего момента в биологии симбиозов протистов с бактериями, а его реализация позволит сделать важный вклад в исследования взаимодействия бактерий с эукариотными клетками в целом. Как ни странно, не так много симбиотических систем с участием бактерий пока могут считаться моделями для изучения молекулярных взаимодействий партнеров при колонизации клетки-хозяина. Результаты запланированных исследований симбиоза между инфузориями Paramecium и инфекционными бактериями Holospora и Preeria на уровне геномов и транскриптомов партнеров позволят расширить представления о механизмах захвата внутриклеточными бактериями эукариот-хозяев. Будут обнаружены гены хозяина, отвечающие за резистентность к инфекции, и гены бактерий, вовлеченные в регуляцию процесса инфекции; вероятно, будут найдены новые бактериальные белки-эффекторы. Будут выявлены также генетические и молекулярные основы взаимодействия инфузории с неинфекционными бактериями Megaira, Trichorickettsia и Caedimonas в стабильных симбиотических ассоциациях, в том числе будут исследованы механизмы регуляции численности бактерий в клетке хозяина и способы попадания в клетку таких неинфекционных симбионтов. Отметим, что симбионты инфузорий, представляющие семейство Rickettsiaceae, которые будут исследованы в рамках проекта, являются достаточно близкими родственниками бактерий, патогенных для человека и животных, что позволяет думать о возможности экстраполяции сведений об их взаимодействии с хозяевами на актуальные бактериальные инфекции. В последние годы накопилось достаточно косвенных подтверждений того, что в регуляции отношений между хозяином и симбиотическими бактериями могут участвовать регуляторные РНК, синтезируемые обоими партнерами. Инфузории продуцируют большое разнообразие регуляторных малых РНК, в том числе, как было недавно показано, особые РНК синтезируются и у инфузорий, поддерживающих в цитоплазме симбиотические бактерии. Однако роль таких синтезируемых хозяином малых интерферирующих РНК во взаимодействиях между эукариотной клеткой и внутриклеточными бактериями пока неизвестна. Регуляторными РНК бактериального происхождения в симбиозах бактерий с протистами ранее вообще не занимались. Результатом работ по проекту станет проверка гипотезы о регуляторной роли некодирующих РНК в симбиозах инфузорий с бактериями и в противобактериальном ответе. Наконец, отдельное внимание будет уделено механизмам дифференцировки симбиотических бактерий из одной формы в другую по ходу жизненного цикла; специфичности симбиотических взаимодействий на уровне генотипов партнеров; раскрытию механизма киллер-эффекта, как правило, ассоциированного с генами вирусного происхождения, в популяциях инфузорий, часть которых заражена симбиотическими бактериями Caedimonas и вследствие этого приобретает киллер-свойства. Таким образом, задачи проекта касаются целого ряда фундаментальных биологических механизмов и процессов, в то же время фокусируясь на генетической и молекулярной регуляции взаимодействий партнеров в симбиотических системах между инфузориями и бактериями, а результаты его выполнения будут новы и востребованы в разных областях биологии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Обнаружены несколько новых изолятов ранее известных видов и новых видов бактерий-симбионтов инфузорий Paramecium. Все виды, к которым принадлежат новые находки, относятся к двум сестринским порядкам филы Alphaproteobacteria, Rickettsiales и Holosporales. Отдельно стоит отметить вторую в истории находку Paraholospora nucleivisitans (представитель семейства Holosporaceae, который может мигрировать между макронуклеусом и цитоплазмой хозяина). Интересна находка внутриядерных Trichorickettsia mobilis (Rickettsiaceae) в клетках Paramecium multimicronucleatum и симбионтов этого же вида, населяющих цитоплазму Paramecium putrinum. Особенно важны для дальнейшей работы найденные представители ключевых для проекта родов Caedimonas и Preeria (семейство Holosporaceae). Симбионты Caedimonas sp., найденные в цитоплазме клеток клона Paramecium tetraurelia, характеризуются уникальным для одноклеточных организмов "mate-killer" эффектом (зараженные ими инфузории убивают бессимбионтных партнеров при половом процессе) и дают оптимальную возможность для изучения генетики симбиоза Paramecium – Caedimonas, так как P. tetraurelia являются модельным объектом генетики инфузорий. Обнаружение внутриядерных инфекционных бактерий Preeria sp. в клонах Paramecium polycaryum расширяет возможности для проведения сравнительного геномного анализа внутри рода Preeria. Пока нами секвенированы геномы трех изолятов этих внутриядерных бактерий: два ранее изученных изолята были обнаружены в клонах двух видов комплекса Paramecium aurelia, а третий, геном которого секвенирован в отчетном году – у Paramecium caudatum. Еще несколько новых симбионтов из семейств Holosporaceae и Rickettsiaceae пока ожидают точной идентификации. В ходе исследований инфузорий-хозяев симбиотических бактерий был проведен сравнительный морфологический и молекулярно-филогенетический анализ более чем сорока клонов, изначально определенных как представители вида Paramecium multimicronucleatum. В результате открыто два новых вида - самостоятельный морфологический вид Paramecium lynni sp. n. и криптический вид Paramecium fokini sp. n. Пересмотрены представления о видовых морфологических признаках у Paramecium. При поддержке гранта завершены совместные с итальянскими коллегами работы по описанию Sarmatiella mevalonica (семейство Rickettsiaceae), цитоплазматических симбионтов инфузорий Paramecium tredecaurelia. Сотни бактерий населяют цитоплазму клетки-хозяина, не окружены мембраной, хотя иногда обнаруживаются и в вакуолях (вероятно, автофагических). Геном Sarmatiella размером ~ 1270 т.п.н. содержит более 1200 генов и множество инсерционных последовательностей. Для представителя Rickettsiaceae этот геном достаточно невелик. Уникальной особенностью этих бактерий является наличие у них генов, кодирующих мевалонатный путь синтеза изопреноидов. Этот путь обычен для эукариот, но очень редко встречается у бактерий, и присутствие этих генов в бактериальных геномах всегда связывают с горизонтальным переносом. Наличие этих генов расширяет метаболические возможности симбионта. Есть основания предполагать, что у Sarmatiella обратные реакции этого пути могут приводить к синтезу ацетил-коА, необходимого для синтеза фосфолипидов. Также у этой бактерии обнаружены система секреции IV типа и гены, кодирующие компоненты жгутикового аппарата, из которых также может быть собрана система секреции III типа. Симбиоз облигатен для бактерии, но не является необходимым для инфузории-хозяина. Обнаружение Sarmatiella расширяет представления об эволюции внутриклеточного паразитизма у Rickettsiaceae, высокоспециализированной группы бактерий. Впервые получены данные о геномах нескольких бактерий-симбионтов инфузорий. Геном Trichorickettsia mobilis из макронуклеуса P. multimicronucleatum составляет примерно 2000 т.п.н., включая в себя одну кольцевую хромосому и две плазмиды. Геном Megaira venefica из цитоплазмы Paramecium nephridiatum имеет размер чуть менее 2000 т.п.н., и также включает в себя плазмиды. Геном другого вида того же рода, Megaira polyxenophila (хозяин – Paramecium caudatum) пока не собран достаточно качественно, его размер находится в пределах 1500-2000 т.п.н., и он также содержит плазмиды. В отчетном году нами успешно осуществлена комбинированная сборка генома внутриядерной симбиотической бактерии Preeria caryophila из данных, полученных в результате парноконцевого (Illumina) и нанопорового (Oxford Nanopore Technologies) секвенирования. Ранее, до начала настоящего проекта, были собраны геномы двух изолятов этого вида. При сборке генома из парноконцевых библиотек (короткие прочтения) было получено 108 контигов, а размер генома составил примерно 990 т.п.н. Геном из «mate-pair»-библиотек (более длинные прочтения) был собран в 16 больших (>1000 п.н.) скэффолдов, в общей сложности их протяженность составила примерно 910 т.п.н. При сборке прочтений нанопорового секвенирования генома был получен единственный контиг длиной 831190 п.н. При этом число открытых рамок считывания оказалось даже немного больше, то есть при комбинированной сборке не было ничего потеряно, а размер генома «уменьшился» почти на 80 т.п.н. Это еще раз иллюстрирует основную проблему анализа геномов представителей Holosporaceae и Rickettsiaceae – огромное число повторов и высокое содержание АТ-пар, что сильно препятствует точной сборке из недостаточно длинных прочтений. В отчетном году мы начали анализ пулов малых РНК, синтезируемых инфузориями в ответ на развитие бактериальной инфекции Preeria caryophila. По предварительным данным, при попадании бактерий Preeria в клетку Paramecium в первые 6 часов после начала инфекции инфузория не производит большого числа некодирующих малых РНК, имеющих гомологию с бактериальными последовательностями. Следовательно, система интерференции РНК инфузории, по всей видимости, не блокирует напрямую транскрипты бактериального происхождения. Основным направлением дальнейшей работы станет сравнительный анализ полных транскриптомов и пулов малых РНК хозяина на разных этапах становления симбиоза Paramecium-Preeria.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном году проект развивался в трех направлениях: мы искали подходы к анализу транскриптомов партнеров по симбиозам между инфузориями и бактериями и продолжали исследования роли малых РНК в регуляции симбиоза; мы проводили сравнительный анализ геномов нескольких групп бактерий-внутриклеточных симбионтов Paramecium; мы изучали новые виды симбиотических бактерий, в том числе проверяли их способность к активной инфекции, а также исследовали возможность передачи симбиотических бактерий между инфузориями при половом процессе хозяев. Мы получили первое свидетельство того, что малые РНК могут быть вовлечены в ответ парамеций на бактериальную инфекцию. При экспериментальном заражении клонов Paramecium tetraurelia и P. biaurelia инфекционными внутриядерными симбионтами Preeria caryophila через 2-6 часов после начала инфекции у инфузорий было выявлено множество экспрессирующихся кластеров некодирующих малых РНК, при этом экспрессия большинства этих кластеров была активирована в ходе экспериментального заражения. В основном малые РНК синтезировались с кодирующих последовательностей генома парамеций. Функция подавляющего большинства кодирующих регионов генома инфузорий, с которых экспрессировались кластеры малых РНК, остается неизвестной и требует дальнейшего анализа, в том числе совместного анализа транскриптома мРНК и синтезирующихся siРНК. В любом случае, активация большого числа локусов в геноме обоих клонов инфузорий в ответ на появление в клетке инфекционных бактерий не кажется случайной. В отчетном году завершено и опубликовано описание нового рода бактерий – симбионтов цитоплазмы Paramecium polycaryum. Эти бактерии, получившие название Gromoviella agglomerans, относятся к семейству Holosporaceae, причем по молекулярной филогении они попадают не в кластер инфекционных внутриядерных Holosporaceae, к которому относятся рода Holospora, Preeria и Gortzia, а в группу неинфекционных цитоплазматических симбионтов Paramecium. Характерной особенностью симбионтов этой группы является способностью формировать прочные агрегаты в цитоплазме клетки-хозяина, которые не дезинтегрируют даже при разрушении инфузории. При делении инфузории крупные агрегаты могут даже мешать процессу цитокинеза. Анализ генома Gromoviella показал, что эта бактерия не имеет генов, отвечающих за синтез LPS, с чем, возможно, может быть связана способность к образованию агломератов. Второй важной обнаруженной нами особенностью этих бактерий оказалась их способность (пусть и достаточно слабая) заражать другие клетки парамеций при фагоцитозе. Способность бактерий Gromoviella к активной инфекции новых хозяев - принципиально новый факт, так как ранее считалось, что инфекционными являются лишь те представители Holosporaceae, для которых характерен двухфазный жизненный цикл с расселительной (инфекционной) стадией и репродуктивной стадией. На завершающей стадии описания находятся еще два ранее неизвестных рода цитоплазматических симбионтов из той же группы Holosporaceae. Нам удалось экспериментально обнаружить перенос симбиотических бактерий между инфузориями при половом процессе – конъюгации. При конъюгации клетки-партнеры обмениваются гаплоидными пронуклеусами, которые переходят из одной клетки в другую по цитоплазматическому мостику. Гипотеза состояла в том, что по этому же мостику с током цитоплазмы могут перемещаться и симбионты. В двух комбинациях клонов P. tetraurelia (в одной из этих пар один из клонов содержал бактерий Caedibacter taeniospiralis, в другой один из клонов был заражен Caedimonas varicaedens) нам удалось зарегистрировать перенос симбиотических бактерий из зараженного партнера в незараженного. C помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) мы достоверно детектировали бактерий в цитоплазме клеток бессимбионтного клона-реципиента как после нескольких делений эксконъюгантной клетки, так и непосредственно в момент переноса симбионтов из клетки в клетку в конъюгирующей паре через 3-4 часа после начала конъюгации. Частота, с которой это происходит, составляла не более чем 7-10% от общего числа конъюгирующих пар. Обнаружение таких «передающихся половым путем» бактериальных инфекций у инфузорий дает ответ на вопрос о способах расселения неинфекционных бактерий в популяциях инфузорий-хозяев, ранее остававшихся абсолютно неизвестными. Исследования геномов симбионтов нескольких родов из семейств Rickettsiaceae и Holosporaceae принесли много интересных результатов. Для каждого вида изучаемых бактерий мы при возможности стремились секвенировать геномы нескольких изолятов и провести их сравнение. Геномы представителей Rickettsiaceae в целом достаточно большие: так, у Trichorickettsia mobilis из цитоплазмы P. putrinum размер генома составил 1,943 млн.п.н., у Trichorickettsia mobilis из макронуклеуса P. multimicronucleatum – 1,966 млн. п.н.; у Megaira polyxenophila из цитоплазмы P. tetraurelia – 1,6 млн.п.н. Геномы Megaira и Trichorickettsia содержат целый ряд характерных для риккетсий белок-кодирующих генов, отвечающих за патогенность и вирулентность, а также за синтез токсинов и антитоксинов. Оба вида также имеют плазмиды, содержащие гены, потенциально играющие роль в вирулентности. Геномы симбионтов парамеций из семейства Holosporaceae оказались удивительно пластичными по ряду характеристик. Мы секвенировали геном Paraholospora nucleivisitans, бактерий из цитоплазмы P. sexaurelia, и сравнили его с геномом Gromoviella agglomerans – представителем той же филогенетической группы бактерий. Геномы Paraholospora (533 т.п.н.) и Gromoviella (590 т.п.н.) оказались самыми маленькими из пока секвенированных геномов Holosporaceae. При сравнении геномов Paraholospora и Gromoviella были выявлены существенные перестройки и невысокий процент покрытия геномов регионами синтении. Еще сильнее отличались друг от друга геномы трех изолятов внутриядерных симбионтов Preeria caryophila. Разброс в размерах геномов оказался необычно велик – соответственно, 831 т.п.н., 928 т.п.н. и 498 т.п.н. Самый маленький геном содержал всего 540 белок-кодирующих генов. При этом полногеномное выравнивание и анализ синтенных областей трех геномов показывали, что все геномы собраны практически без потерь. Помимо такого несоответствия размеров и состава генома яркой особенностью геномов Preeria оказалась очень низкая синтенность – число перестроек в геномах было исключительно велико. Причины такой высокой изменчивости генома Preeria неясны. Анализ групп ортологичных генов в секвенированных геномах Holosporaceae позволил выделить ряд метаболических кластеров, характерных для тех или иных родов и групп родов внутри семейства. Нами впервые секвенированы геномы нескольких изолятов бактерий Caedimonas varicaedens, относящихся к семейству Caedimonadaceae порядка Holosporales. Caedimonas являются симбионтами, придающими инфузориям-хозяевам киллер-свойства: при попадании в пищеварительные вакуоли клеток чувствительного клона парамеций эти бактерии убивают реципиентов. Один из исследуемых нами изолятов приводит к появлению у инфузории-хозяина способности убивать партнеров по половому процессу. Размеры геномов варьировали от 995 т.п.н. до 1302 т.п.н. В геномах выявлено от 1114 до 1380 белок-кодирующих генов. Плазмид не обнаружено. Большинство проаннотированных генов C. varicaedens отвечают за передачу генетической информации, углеводный метаболизм, передачу клеточных сигналов и взаимодействие с окружающей средой. В геномах представлены гены нескольких систем секреции, вероятно, вовлеченных во взаимодействия с хозяином. Метаболические возможности Caedimonas шире, чем у представителей Holosporaceae. В геномах пока не удалось выявить гены, отвечающие за синтез возможного эффектора, обеспечивающего киллер-свойства инфузориям, содержащим этих симбионтов.

 

Публикации

1. Кастелли М., Ланцони О., Джованнини М., Лебедева Н., Гаммуто Л., Сассера Д., Мелехин М., Потехин А., Фокин С., Петрони Дж. ‘Candidatus Gromoviella agglomerans’, a novel intracellular Holosporaceae parasite of the ciliate Paramecium showing marked genome reduction Environmental Microbiology Reports, v.14 (год публикации - 2021).

2. Кастелли М., Ланцони О., Нарди Т., Лометто С., Модео Л.. Потехин А., Сассера Д., Петрони Дж. ‘Candidatus Sarmatiella mevalonica’ endosymbiont of the ciliate Paramecium provides insights on evolutionary plasticity among Rickettsiales Environmental Microbiology, 23(3): 1684-1701 (год публикации - 2021).

3. Потехин А.А., Некрасова И.В., Флемминг Ф.Э. In shadow of Holospora – The continuous quest for new Holosporaceae members Protistology, 15 (3): 127–141 (год публикации - 2021).