Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Обнаружены несколько новых изолятов ранее известных видов и новых видов бактерий-симбионтов инфузорий Paramecium. Все виды, к которым принадлежат новые находки, относятся к двум сестринским порядкам филы Alphaproteobacteria, Rickettsiales и Holosporales. Отдельно стоит отметить вторую в истории находку Paraholospora nucleivisitans (представитель семейства Holosporaceae, который может мигрировать между макронуклеусом и цитоплазмой хозяина). Интересна находка внутриядерных Trichorickettsia mobilis (Rickettsiaceae) в клетках Paramecium multimicronucleatum и симбионтов этого же вида, населяющих цитоплазму Paramecium putrinum. Особенно важны для дальнейшей работы найденные представители ключевых для проекта родов Caedimonas и Preeria (семейство Holosporaceae). Симбионты Caedimonas sp., найденные в цитоплазме клеток клона Paramecium tetraurelia, характеризуются уникальным для одноклеточных организмов "mate-killer" эффектом (зараженные ими инфузории убивают бессимбионтных партнеров при половом процессе) и дают оптимальную возможность для изучения генетики симбиоза Paramecium – Caedimonas, так как P. tetraurelia являются модельным объектом генетики инфузорий. Обнаружение внутриядерных инфекционных бактерий Preeria sp. в клонах Paramecium polycaryum расширяет возможности для проведения сравнительного геномного анализа внутри рода Preeria. Пока нами секвенированы геномы трех изолятов этих внутриядерных бактерий: два ранее изученных изолята были обнаружены в клонах двух видов комплекса Paramecium aurelia, а третий, геном которого секвенирован в отчетном году – у Paramecium caudatum. Еще несколько новых симбионтов из семейств Holosporaceae и Rickettsiaceae пока ожидают точной идентификации. В ходе исследований инфузорий-хозяев симбиотических бактерий был проведен сравнительный морфологический и молекулярно-филогенетический анализ более чем сорока клонов, изначально определенных как представители вида Paramecium multimicronucleatum. В результате открыто два новых вида - самостоятельный морфологический вид Paramecium lynni sp. n. и криптический вид Paramecium fokini sp. n. Пересмотрены представления о видовых морфологических признаках у Paramecium. При поддержке гранта завершены совместные с итальянскими коллегами работы по описанию Sarmatiella mevalonica (семейство Rickettsiaceae), цитоплазматических симбионтов инфузорий Paramecium tredecaurelia. Сотни бактерий населяют цитоплазму клетки-хозяина, не окружены мембраной, хотя иногда обнаруживаются и в вакуолях (вероятно, автофагических). Геном Sarmatiella размером ~ 1270 т.п.н. содержит более 1200 генов и множество инсерционных последовательностей. Для представителя Rickettsiaceae этот геном достаточно невелик. Уникальной особенностью этих бактерий является наличие у них генов, кодирующих мевалонатный путь синтеза изопреноидов. Этот путь обычен для эукариот, но очень редко встречается у бактерий, и присутствие этих генов в бактериальных геномах всегда связывают с горизонтальным переносом. Наличие этих генов расширяет метаболические возможности симбионта. Есть основания предполагать, что у Sarmatiella обратные реакции этого пути могут приводить к синтезу ацетил-коА, необходимого для синтеза фосфолипидов. Также у этой бактерии обнаружены система секреции IV типа и гены, кодирующие компоненты жгутикового аппарата, из которых также может быть собрана система секреции III типа. Симбиоз облигатен для бактерии, но не является необходимым для инфузории-хозяина. Обнаружение Sarmatiella расширяет представления об эволюции внутриклеточного паразитизма у Rickettsiaceae, высокоспециализированной группы бактерий. Впервые получены данные о геномах нескольких бактерий-симбионтов инфузорий. Геном Trichorickettsia mobilis из макронуклеуса P. multimicronucleatum составляет примерно 2000 т.п.н., включая в себя одну кольцевую хромосому и две плазмиды. Геном Megaira venefica из цитоплазмы Paramecium nephridiatum имеет размер чуть менее 2000 т.п.н., и также включает в себя плазмиды. Геном другого вида того же рода, Megaira polyxenophila (хозяин – Paramecium caudatum) пока не собран достаточно качественно, его размер находится в пределах 1500-2000 т.п.н., и он также содержит плазмиды. В отчетном году нами успешно осуществлена комбинированная сборка генома внутриядерной симбиотической бактерии Preeria caryophila из данных, полученных в результате парноконцевого (Illumina) и нанопорового (Oxford Nanopore Technologies) секвенирования. Ранее, до начала настоящего проекта, были собраны геномы двух изолятов этого вида. При сборке генома из парноконцевых библиотек (короткие прочтения) было получено 108 контигов, а размер генома составил примерно 990 т.п.н. Геном из «mate-pair»-библиотек (более длинные прочтения) был собран в 16 больших (>1000 п.н.) скэффолдов, в общей сложности их протяженность составила примерно 910 т.п.н. При сборке прочтений нанопорового секвенирования генома был получен единственный контиг длиной 831190 п.н. При этом число открытых рамок считывания оказалось даже немного больше, то есть при комбинированной сборке не было ничего потеряно, а размер генома «уменьшился» почти на 80 т.п.н. Это еще раз иллюстрирует основную проблему анализа геномов представителей Holosporaceae и Rickettsiaceae – огромное число повторов и высокое содержание АТ-пар, что сильно препятствует точной сборке из недостаточно длинных прочтений. В отчетном году мы начали анализ пулов малых РНК, синтезируемых инфузориями в ответ на развитие бактериальной инфекции Preeria caryophila. По предварительным данным, при попадании бактерий Preeria в клетку Paramecium в первые 6 часов после начала инфекции инфузория не производит большого числа некодирующих малых РНК, имеющих гомологию с бактериальными последовательностями. Следовательно, система интерференции РНК инфузории, по всей видимости, не блокирует напрямую транскрипты бактериального происхождения. Основным направлением дальнейшей работы станет сравнительный анализ полных транскриптомов и пулов малых РНК хозяина на разных этапах становления симбиоза Paramecium-Preeria.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном году проект развивался в трех направлениях: мы искали подходы к анализу транскриптомов партнеров по симбиозам между инфузориями и бактериями и продолжали исследования роли малых РНК в регуляции симбиоза; мы проводили сравнительный анализ геномов нескольких групп бактерий-внутриклеточных симбионтов Paramecium; мы изучали новые виды симбиотических бактерий, в том числе проверяли их способность к активной инфекции, а также исследовали возможность передачи симбиотических бактерий между инфузориями при половом процессе хозяев. Мы получили первое свидетельство того, что малые РНК могут быть вовлечены в ответ парамеций на бактериальную инфекцию. При экспериментальном заражении клонов Paramecium tetraurelia и P. biaurelia инфекционными внутриядерными симбионтами Preeria caryophila через 2-6 часов после начала инфекции у инфузорий было выявлено множество экспрессирующихся кластеров некодирующих малых РНК, при этом экспрессия большинства этих кластеров была активирована в ходе экспериментального заражения. В основном малые РНК синтезировались с кодирующих последовательностей генома парамеций. Функция подавляющего большинства кодирующих регионов генома инфузорий, с которых экспрессировались кластеры малых РНК, остается неизвестной и требует дальнейшего анализа, в том числе совместного анализа транскриптома мРНК и синтезирующихся siРНК. В любом случае, активация большого числа локусов в геноме обоих клонов инфузорий в ответ на появление в клетке инфекционных бактерий не кажется случайной. В отчетном году завершено и опубликовано описание нового рода бактерий – симбионтов цитоплазмы Paramecium polycaryum. Эти бактерии, получившие название Gromoviella agglomerans, относятся к семейству Holosporaceae, причем по молекулярной филогении они попадают не в кластер инфекционных внутриядерных Holosporaceae, к которому относятся рода Holospora, Preeria и Gortzia, а в группу неинфекционных цитоплазматических симбионтов Paramecium. Характерной особенностью симбионтов этой группы является способностью формировать прочные агрегаты в цитоплазме клетки-хозяина, которые не дезинтегрируют даже при разрушении инфузории. При делении инфузории крупные агрегаты могут даже мешать процессу цитокинеза. Анализ генома Gromoviella показал, что эта бактерия не имеет генов, отвечающих за синтез LPS, с чем, возможно, может быть связана способность к образованию агломератов. Второй важной обнаруженной нами особенностью этих бактерий оказалась их способность (пусть и достаточно слабая) заражать другие клетки парамеций при фагоцитозе. Способность бактерий Gromoviella к активной инфекции новых хозяев - принципиально новый факт, так как ранее считалось, что инфекционными являются лишь те представители Holosporaceae, для которых характерен двухфазный жизненный цикл с расселительной (инфекционной) стадией и репродуктивной стадией. На завершающей стадии описания находятся еще два ранее неизвестных рода цитоплазматических симбионтов из той же группы Holosporaceae. Нам удалось экспериментально обнаружить перенос симбиотических бактерий между инфузориями при половом процессе – конъюгации. При конъюгации клетки-партнеры обмениваются гаплоидными пронуклеусами, которые переходят из одной клетки в другую по цитоплазматическому мостику. Гипотеза состояла в том, что по этому же мостику с током цитоплазмы могут перемещаться и симбионты. В двух комбинациях клонов P. tetraurelia (в одной из этих пар один из клонов содержал бактерий Caedibacter taeniospiralis, в другой один из клонов был заражен Caedimonas varicaedens) нам удалось зарегистрировать перенос симбиотических бактерий из зараженного партнера в незараженного. C помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) мы достоверно детектировали бактерий в цитоплазме клеток бессимбионтного клона-реципиента как после нескольких делений эксконъюгантной клетки, так и непосредственно в момент переноса симбионтов из клетки в клетку в конъюгирующей паре через 3-4 часа после начала конъюгации. Частота, с которой это происходит, составляла не более чем 7-10% от общего числа конъюгирующих пар. Обнаружение таких «передающихся половым путем» бактериальных инфекций у инфузорий дает ответ на вопрос о способах расселения неинфекционных бактерий в популяциях инфузорий-хозяев, ранее остававшихся абсолютно неизвестными. Исследования геномов симбионтов нескольких родов из семейств Rickettsiaceae и Holosporaceae принесли много интересных результатов. Для каждого вида изучаемых бактерий мы при возможности стремились секвенировать геномы нескольких изолятов и провести их сравнение. Геномы представителей Rickettsiaceae в целом достаточно большие: так, у Trichorickettsia mobilis из цитоплазмы P. putrinum размер генома составил 1,943 млн.п.н., у Trichorickettsia mobilis из макронуклеуса P. multimicronucleatum – 1,966 млн. п.н.; у Megaira polyxenophila из цитоплазмы P. tetraurelia – 1,6 млн.п.н. Геномы Megaira и Trichorickettsia содержат целый ряд характерных для риккетсий белок-кодирующих генов, отвечающих за патогенность и вирулентность, а также за синтез токсинов и антитоксинов. Оба вида также имеют плазмиды, содержащие гены, потенциально играющие роль в вирулентности. Геномы симбионтов парамеций из семейства Holosporaceae оказались удивительно пластичными по ряду характеристик. Мы секвенировали геном Paraholospora nucleivisitans, бактерий из цитоплазмы P. sexaurelia, и сравнили его с геномом Gromoviella agglomerans – представителем той же филогенетической группы бактерий. Геномы Paraholospora (533 т.п.н.) и Gromoviella (590 т.п.н.) оказались самыми маленькими из пока секвенированных геномов Holosporaceae. При сравнении геномов Paraholospora и Gromoviella были выявлены существенные перестройки и невысокий процент покрытия геномов регионами синтении. Еще сильнее отличались друг от друга геномы трех изолятов внутриядерных симбионтов Preeria caryophila. Разброс в размерах геномов оказался необычно велик – соответственно, 831 т.п.н., 928 т.п.н. и 498 т.п.н. Самый маленький геном содержал всего 540 белок-кодирующих генов. При этом полногеномное выравнивание и анализ синтенных областей трех геномов показывали, что все геномы собраны практически без потерь. Помимо такого несоответствия размеров и состава генома яркой особенностью геномов Preeria оказалась очень низкая синтенность – число перестроек в геномах было исключительно велико. Причины такой высокой изменчивости генома Preeria неясны. Анализ групп ортологичных генов в секвенированных геномах Holosporaceae позволил выделить ряд метаболических кластеров, характерных для тех или иных родов и групп родов внутри семейства. Нами впервые секвенированы геномы нескольких изолятов бактерий Caedimonas varicaedens, относящихся к семейству Caedimonadaceae порядка Holosporales. Caedimonas являются симбионтами, придающими инфузориям-хозяевам киллер-свойства: при попадании в пищеварительные вакуоли клеток чувствительного клона парамеций эти бактерии убивают реципиентов. Один из исследуемых нами изолятов приводит к появлению у инфузории-хозяина способности убивать партнеров по половому процессу. Размеры геномов варьировали от 995 т.п.н. до 1302 т.п.н. В геномах выявлено от 1114 до 1380 белок-кодирующих генов. Плазмид не обнаружено. Большинство проаннотированных генов C. varicaedens отвечают за передачу генетической информации, углеводный метаболизм, передачу клеточных сигналов и взаимодействие с окружающей средой. В геномах представлены гены нескольких систем секреции, вероятно, вовлеченных во взаимодействия с хозяином. Метаболические возможности Caedimonas шире, чем у представителей Holosporaceae. В геномах пока не удалось выявить гены, отвечающие за синтез возможного эффектора, обеспечивающего киллер-свойства инфузориям, содержащим этих симбионтов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном году мы сфокусировались на том, чтобы максимально собрать данные о разнообразии симбиотических бактерий, которые поддерживаются в клонах инфузорий Paramecium коллекции RC CCM в РЦ «Культивирование микроорганизмов» (СПбГУ). Для этого необходимо было секвенировать метагеномы клонов, содержащих симбионтов, собрать из метагенома геномы отдельных участников системы, и идентифицировать симбионтов. Мы секвенировали ряд метагеномов клонов Paramecium, содержащих симбиотические бактерии из порядка Holosporales. При анализе геномов наибольшее внимание мы уделили геномам бактерий Preeria caryophila (Holosporaceae) и Caedimonas varicaedens (Caedimonadaceae). Preeria caryophila – высокоинфекционные внутриядерные симбионты парамеций, которые являются одной из моделей, с которыми мы работаем на протяжении всего выполнения проекта. Полученные новые данные подтвердили высокий полиморфизм Pr. caryophila по размеру генома (размеры варьируют практически вдвое) и удивительно большое число внутригеномных перестроек. Нам удалось установить, что при попадании в пищеварительные вакуоли инфузорий инфекционных форм Preeria происходит нарушение закисления вакуолей. Незакисленные вакуоли с симбионтами выходят из занимающего несколько часов процесса циклоза и сохраняются в цитоплазме парамеции на срок 2-3 дня. Бактерии из них попадают в макронуклеус в малых количествах и неодновременно. Таким образом, инфекция в массовой культуре инфузорий развивается не синхронно, и для получения транскриптомных данных высокого качества необходимо работать с отдельными клетками. Тем не менее, мы завершили эксперимент, в котором секвенировали транскриптомы Paramecium biaurelia в ходе развития инфекции Pr. caryophila в нескольких временных точках после начала экспериментального заражения. Анализ данных проводится в период подготовки отчета. Готовится к отправке в журнал статья с описанием новых вариантов симбиозов между Paramecium и Holospora-подобными бактериями: в ней описываются новые обнаруженные нами ассоциации между P. polycaryum и Pr. caryophila и между P. nephridiatum и Gortzia yakutica, обсуждается вопрос частоты промискуитета внутриядерных симбионтов инфузорий. Помимо геномов Preeria мы секвенировали также 7 геномов 4 видов Holospora, геном Gortzia sp. и геномы нескольких видов малоинфекционных симбионтов, как известных (Mystax nordicus), так и новых. Caedimonas придают инфузориям-хозяевам киллер-эффект – способность быстро убивать не содержащих симбионтов парамеций при совместном инкубировании. Анализ геномов Caedimonas направлен, в частности, на поиски возможного «токсина» - молекул, вовлеченных в убийство наивных парамеций. Caedimonas varicaedens – неинфекционные симбионты цитоплазмы парамеций, достаточно редко они могут колонизировать макронуклеус инфузории. Геномы разных изолятов C. varicaedens варьируют по размеру в пределах от 1300 до 1600 т.п.н. Плазмид в геномах не обнаружено, то есть неизвестный киллер-фактор кодируется на хромосоме. Секреторный аппарат Caedimonas представлен характерной для порядка Holosporales системой Sec и менее характерной Sec-независимой системой Tat, которая встречается у представителей рода Rickettsia. Помимо компонентов системы секреции II типа, в геноме Caedimonas sp. присутствуют гены, относящиеся к системам секреции IV типа и VI типа. У Caedimonas, в отличие от Holospora, присутствуют все гены, кодирующие ферменты цикла трикарбоновых кислот, АТФ-синтаза, что говорит о том, что эти бактерии, в отличие от напрямую забирающих АТФ у хозяина Holospora, являются менее «жесткими» паразитами. С помощью секвенирования уникальной для Caedimonas вставки в гене 16S рРНК удалось определить истинный масштаб дивергенции между разными изолятами бактерий, относимых к данному виду. Результаты молекулярно-филогенетического анализа показывают, что внутри вида C. varicaedens можно выделить как минимум три группы изолятов. Собраны и проанализированы геномы 3 изолятов Megaira, 2 изолятов Trichorickettsia. Результаты анализа нескольких геномов Megaira и Trichorickettsia вошли в статью, отправленную в журнал Nature Ecology and Evolution. Мы завершили все эксперименты и анализ генома бактерий-эпибионтов Paramecium calkinsi. Эти бактерии относятся к недавно открытому нами семейству Deianiraeaceae (пор. Rickettsiales), и так же, как и представители рода Deianiraea, передаются через среду, прикрепляются к клеткам инфузорий и убивают их, не проникая внутрь. Нам удалось получить микрофотографии бактерий на поверхности зараженных инфузорий с помощью электронной микроскопии, что является важным для подтверждения внеклеточного образа жизни этих бактерий. Анализ генома показал, что метаболические возможности нового рода шире, чем у Deianiraea, в частности, эти бактерии способны к самостоятельному синтезу большинства аминокислот. Из приспособлений к паразитизму нужно отметить функциональные системы секреции II и IV типа. Нами также был найден представитель еще одного нового рода того же семейства, бактерии-эпибионты Paramecium bursaria. Интересно, что эти бактерии не убивают хозяев, и это первый случай, когда внеклеточный паразитизм риккеттсиеподобных бактерий не является летальным для инфузорий. Помимо геномов симбионтов Paramecium мы также в этом году смогли впервые исследовать бактерий-симбионтов морской инфузории Ophryodendron obietinum (Suctoria, Oligohymenophorea). Эти инфузории паразитируют на морских гидроидных полипах Obelia longissima, распространенных в северных морях. Нами были собраны образцы Ophryodendron из двух беломорских популяций и одной популяции с Баренцева моря. В цитоплазме инфузорий из всех популяций были выявлены многочисленные бактерии. Эти бактерии были идентифицированы как представители Gammaproteobacteria (пор. Pseudomonadales), ранее описанные из данных, полученных на основе проведенного метабаркодинга образцов морской воды. В одной из беломорских популяций также был выявлен и второй вид симбионтов, представители Alphaproteobacteria. Иногда из метагеномных данных нам удавалось собрать рибосомный оперон не только для ожидаемой «профессиональной» симбиотической бактерии, но и еще для ряда бактерий, присутствие которых в симбиотической системе оказывалось неожиданным. Мы считаем, что эти бактерии доминируют в составе микробиома инфузорий, то есть не являются специализированными симбионтами, а просто ассоциированы с клеткой инфузории, находясь внутри нее (например, в пищеварительных вакуолях) или на ее поверхности. Полученные данные позволят в дальнейшем моделировать прокариотные консорциумы, ассоциированные с парамециями. Отдельное внимание было уделено внутриродовому разнообразию симбиотических бактерий Trichorickettsia. Вид Trichorickettsia mobilis подразделяют на три подвида (T. mobilis mobilis, T. mobilis hyperinfectiva и T. mobilis extranuclearis) в соответствии с тем, в каких видах Paramecium и в каких компартментах – макронуклеусе или цитоплазме - были описаны эти бактерии, и обладали ли они подвижностью. Мы добавили в исследование еще несколько изолятов Trichorickettsia mobilis, обнаруженных нами в клонах P. multimicronucleatum (в макронуклеусе) и P. putrinum (в цитоплазме), секвенировали ген 16S рРНК, выполнили светомикроскопические и электронномикроскопические исследования, что позволило пересмотреть систематику внутри этой группы бактерий, а также предположить существование у них сложного жизненного цикла. В ходе работ по изучению разнообразия симбиотических бактерий мы одновременно исследуем разнообразие инфузорий-хозяев. В отчетном году нами опубликована статья с описанием двух новых видов Paramecium, P. lynni и P. fokini, ближайшими родственниками которых являются P. caudatum и P. multimicronucleatum.