Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Был осуществлен поиск новых биологических объектов, продуцирующих ранее неизвестные морские соединения, для изучения структурного разнообразия и биогенеза биоактивных метаболитов морских губок, морских звезд и некоторых других морских беспозвоночных в интересах биомедицины и биотехнологии. Всего было выделено 20 вторичных метаболитов из морских губок, звезд и горгонарии, определены их структуры, включая абсолютную стереохимию с помощью 1D и 2D ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, и химических трансформаций. Установлено, что 10 из выделенных новых соединений являются первыми членами ряда неизвестных ранее структурных групп природных веществ. В том числе, были найдены в морских беспозвоночных, в частности, в горгонарии Leptogorgia sp., новые гумуленовые сесквитерпеноиды, лептогоргины A-C и новый стероид, лептогоргоид А. Из губки Haliclona gracilis было выделено семь новых полиоксигенированных стероидов, грацилосульфатов А-G, содержащих новый 3β-O-сульфонато, 5β,6β-эпокси (или 5(6)-дегидро), 4β,23-гидрокси-общий структурный мотив. Из губки Monanchora pulchra был выделен пентациклический гуанидиновый алкалоид, монанхоксимикалин С в препаративных количествах для детального изучения его противоопухолевых свойств. Было определено, что найденные нами новые морские соединения, включая алкалоид, гумуленовые сесквитерпеноиды и сульфатированные стероиды, показывают многообещающую активность против рака простаты человека. Получены новые данные о биогенезе биоактивных метаболитов горгонарий и морских губок. Из вьетнамской морской губки Stelletta sp. были выделены и изучены шесть новых соединений терпеноидной природы, принадлежащие к редкой изомалабарикановой структурной группе. Установлено, что два соединения являются 3-ацетокси аналогами известных изомалабарикановых 13E/Z- изомеров, содержащих 3-кето группу. Еще четыре новых терпеноида являются укороченными производными, продуктами трансформации изомалабарикановых соединений. Наибольший интерес среди них вызывает уникальное соединение, содержащее в своей структуре необычную для морских терпеноидов в том числе изомалабарикановых производных тройную связь. В настоящее время заканчивается установление структур выделенных соединений. Был осуществлен скрининг экстрактов из нескольких видов морских звезд, собранных в северных и южных районах Западной части Тихого океана и в Арктике, перспективных для выделения новых природных соединений. Была изучена Арктическая морская звезда Asterias microdiscus, собранная в восточной части Чукотского моря, и выделены два новых минорных метаболита - сульфатированный полигидроксистероид, названный микродискусолом G, и полигидроксилированный биозид, микродискусозид A. Было установлено, что микродискусол G имеет 3β,5,6β,15α,16β-пентагидроксистероидное ядро и 24-метил-холестановую боковую цепь с сульфатной группой при С-28, такая боковая цепь была впервые обнаружена в стероидных метаболитах морских звезд. Микродискусозид A содержит Δ4-3β,6β,8,15α,16β-пентагидроксистероидное ядро, гликозилированное остатком ксилопиранозы по С-3, и Δ24(28)-26-гидрокси-24-метилхолестановую боковую цепь, гликозилированную остатком ксилопиранозы по C-26. Изучена цитотоксическая и канцерпревентивная активности для некоторых из выделенных соединений. Стероидные астеросапонины проявляли цитотоксическое действие против нормальных клеток JB6 Cl41 и раковых клеток HT-29, MDA-MB-231, THP-1 и Raji и эффективно подавляли пролиферацию клеток и образование колоний раковых клеток HT-29 и MDA-MB-231 в нецитотоксичных концентрациях. Гликозиды полигидроксистероидов были неактивными или менее активными в тех же экспериментах. Был начат поиск и изучение метаболитов морских звезд Solaster pacificus и Leptasterias polaris acervata. Был получен ряд суммарных фракций и выделены несколько индивидуальных соединений, строение которых устанавливается. Выполнен молекулярно-генетический анализ 17 образцов морских губок, для семи из них определено таксономическое положение до уровня семейства и рода. Найден оптимальный подход для получения препаратов геномной ДНК высокого качества и с высоким выходом. Подобраны условия амплификации фрагментов гена 28S рРНК из изученных образцов морских губок. Начата работа по оптимизации амплификации гена 28S рРНК из образцов морских звезд. Таким образом, выделена большая серия новых природных соединений из различных беспозвоночных, собранных в ходе экспедиций на НИС «Академик Опарин» в 2011-2019 гг. в северных и южных районах Западной части Тихого океана и в Восточной части Арктики. Установлено строение выделенных соединений, включая абсолютную стереохимию их асимметрических центров. На основании анализа структур выделенных соединений высказаны предположения о ферментах, участвующих в процессах их биосинтеза. Для ряда выделенных веществ исследована противоопухолевая и канцерпревентивная активности. По результатам работ опубликованы 4 статьи в журналах, индексируемых Web of Science, и одни тезисы доклада.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На данном этапе выполнения проекта были выделены и структурно изучены низкомолекулярные вторичные метаболиты морских губок и звезд. Были разработаны методики выделения целевых веществ с помощью экстракции растворителями, колоночной хроматографии на различных сорбентах и высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате был получен ряд фракций, содержащих целевые метаболиты, а также были выделены 32 индивидуальных соединения из губок и морских звезд, включая 25 ранее неизвестных. Установлено полное химическое строение для ряда выделенных веществ, включая абсолютные конфигурации асимметрических центров. Для других предложены структуры, которые могут быть уточнены при дальнейших исследованиях. Строение выделенных веществ было установлено при помощи 1D и 2D ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, в том числе масс-спектрометрии высокого разрешения и тандемной масс-спектрометрии, а также направленных химических трансформаций, анализа спектров электронного кругового дихроизма (ЭКД) и квантово-химического моделирования. Была исследована биологическая активность ряда выделенных метаболитов. Так, из губки Melonanchora kobjakovae были выделены 4 новых ω-O-гликозилированных амида полиоксигенированных жирных кислот, названные мелонозидами С–F, и установлены их структуры. Анализ 1D и 2D ЯМР и масс-спектров, показал, что мелонозиды С и D вместо двух карбонильных групп внутри полиметиленовой цепи, как в известных мелонозидах А и В и миксиллинах А–С, содержат циклопентенильный фрагмент с двойной связью, сопряженный с одной карбонильной группой. Этот фрагмент, насколько нам известно, впервые найден в липидах. Вероятно, мелонозиды С и D образуются из их биосинтетического предшественника при альдольно-кротоновой конденсации карбонильных групп в положениях С-11 и С-16 с альфа-метиленовыми группами. Помимо наличия циклопентенового фрагмента в структурах С и D, мелонозиды С-F отличаются от ранее известных мелонозидов и миксиллина В положением карбонильных групп, двойной связи и наличием остатка дофамина, а не тирамина. Кроме того, мелонозид F имеет цепь из С26 атомов, как у известных мелонозида B и миксиллина А, а не С28, как в мелонозиде А и миксиллинах В и С. Из морской губки Lissodendoryx papillosa применением колоночной хроматографии и ВЭЖХ на различных сорбентах были выделены папилозины A–E – необычные продукты смешанного алкалоидоуглеводного биосинтеза. Они являются первыми представителями новой структурной группы природных соединений – производных гексаальдоновых кислот, имеющих гетероциклические заместители. Для выделенных пяти соединений были предложены химические структуры. Сравнительный анализ ЯМР спектров показал, что папилозины отличаются друг от друга строением гексаальдоновой кислоты, числом и положением остатков бром-пирролкарбоновой и пирролкарбоновой кислот. Из морской губки Spongionella sp. выделили шесть соединений, одно из них является новым. Известные соединения были идентифицированы сравнением их спектральных данных с литературными. Выделенные вещества относятся к спонгиановым дитерпеноидам – группе соединений, имеющих 6,6,6,5-тетрациклическую систему и отличающихся друг от друга характером и степенью окисления. Известно, что некоторые спонгиановые дитерпеноиды проявляют различные биологические активности, включая цитотоксическую, антифунгальную, противовирусную и противовоспалительную. Нами в настоящее время выполняется изучение противоопухолевой активности выделенных веществ. Продолжено исследование метаболитов губки Stelletta sp., собранной у берегов Вьетнама. Были выделены шесть новых стеллеттинов Q-V и один известный метаболит глобостеллетин N. Для установления структуры и стереохимии выделенных веществ применялись методы ЯМР спектроскопии, тандемной ИЭР масс-спектрометрии, анализ спектров электронного кругового дихроизма (ЭКД) и квантово-химическое моделирование. Установлено, что два соединения являются 3-ацетокси аналогами известных изомалабарикановых 13E/Z-изомеров – глобостеллеттинов К и М, содержащих 3-кето группу в кольце А. Еще четыре новых терпеноида являются нор-терпеноидами изомалабарикановой серии. Установлена абсолютная стереохимия двух новых изомалабарикановых тритерпеноидов – стеллеттинов Q и R, установлено строение новых нор-терпеноидов стеллеттинов S-V, дополнительно подтвержденное расчетами химических сдвигов. Пересмотрены конфигурации асимметрических центров в двух ранее известных изомалабариканах. Наибольший интерес среди найденных веществ вызывает соединение, содержащее редкую в морских терпеноидах и уникальную в изомалабарикановых производных тройную связь. Был изучен этанольный экстракт морской губки Oceanapia sp. Из него выделен необычный метаболит - оцеаналин B, принадлежащий к редкой группе α,ω-биполярных липидоалкалоидов. В оцеаналине В α-конец молекулы структурно близок к редким сфинголипидам, а ω-конец представлен 1-замещенным тетрагидроизохинолиновым производным. С помощью анализа ЯМР-, ЭКД-, масс-спектров и химических трансформаций была установлена структура и абсолютная стереохимия оцеаналина В. Показано, что оцеаналин B проявляет высокую in vitro активность против флуконазол-устойчивых дрожжей Candida glabrata. Было продолжено выделение сфинголипидов из морской звезды Leptasterias (Hexasterias) polaris acervata, собранной в Беринговом проливе с глубины 40-45 метров. В результате хроматографического разделения были получены набор фракций и индивидуальные церамиды. Далее планируется получение масс-спектров каждой фракции, а также проведение метанолиза и ГЖХ-МС анализа полученных производных. Исследование морской звезды Solaster pacificus привело к выделению восьми новых тритерпеновых гликозидов, которые были названы пацификусозидами D–K, и известного тритерпенового гликозида кукумариозида D. Были предложены структуры для всех выделенных гликозидов. Установлено, что пацификусозиды Е, G и J имеют новый тип тетрасахаридной углеводной цепи, содержащей неметилированные терминальные моносахаридные остатки, никогда ранее не встречавшиеся в тритерпеновых гликозидах. Пацификусозиды F, H и K содержат тетрасахаридную цепь нового типа, имеющую остаток 6-O-OSO3-Glc, впервые найденный в соединениях этого класса. Поскольку тритерпеновые гликозиды являются типичными метаболитами не морских звезд, а голотурий, то очевидно, что морская звезда S. pacificus специализируется на питании голотуриями E. fraudatrix. Этим можно объяснить структурное сходство пацификусозидов D–K и кукумариозидов, ранее выделенных из этой голотурии. Была исследована цитотоксическая активность выделенных соединений по отношению к нормальным эпидермальным клеткам мыши JB6 Cl41 и клеткам меланомы человека при помощи МТС метода. Показано, что исследуемые вещества подавляют жизнеспособность клеток в микромолярных концентрациях. Опубликована обзорная статья «Малабарикановые и изомалабарикановые тритерпеноиды, включая их гликоконъюгированные формы». В ней обсуждаются структурное разнообразие, таксономическое распределение, биологические активности, биогенез и синтезы малабарикановых и изомалабарикановых тритерпеноидов, а также некоторых их производных. Эти природные соединения привлекают большое внимание не до конца выясненным биосинтетическим происхождением и биологической активностью, особенно высокой цитотоксичностью некоторых изомалабариканов в отношении опухолевых клеток, а также многообещающими нейропротекторными свойствами, проявляемыми в наномолярных концентрациях. Опубликована обзорная статья «Сфинголипиды классов Asteroidea и Holothuroidea: структуры и биологические активности». В ней обобщены имеющиеся в литературе сведения о сфинголипидах морских звезд и голотурий за последние два десятилетия: особенности структур, биогенеза и биологической активности. Показано, что ранее были изучены сфинголипиды 24 тихоокеанских видов морских звезд и голотурий. Всего из этих иглокожих были выделены и структурно идентифицированы около 150 сфинголипидов. Это свидетельствует о том, что иглокожие и, в частности, морские звезды и голотурии, являются богатым источником сфинголипидов, структуры которых могут заметно отличаться от структур соответствующих метаболитов наземных растений и животных. С использованием результатов секвенирования генов 18S РНК выполнена молекулярно-генетическая идентификация 6 образцов морских губок и 4 образцов морских звезд. Для них определено таксономическое положение до уровня семейства, рода, а для некоторых образцов - до вида. Выделены препараты геномной ДНК высокого качества и с высоким выходом из 8 образцов морских звезд. Подобраны условия амплификации фрагментов гена 18S рРНК из образцов морских губок и звезд. Начата работа по оптимизации амплификации гена COI и ITS образцов морских звезд. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация по гену COI 2 образцов морских звезд. Выполнен поиск и анализ потенциальных референсных генов для определения уровня экспрессии генов ферментов биосинтеза вторичных метаболитов в разных тканях морской звезды Patiria pectinifera и голотурии Eupentacta fraudatrix. С использованием программы RefFinder установлено, что наиболее подходящим референсным геном для E. fraudatrix является ACTB, а для P. pectinifera – GAPDH. На данном этапе выполнения проекта опубликованы 4 статьи в журналах, индексируемых WoS, три из них в журналах Q1, и двое тезисов докладов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На данном этапе выполнения проекта были выделены и структурно изучены низкомолекулярные вторичные метаболиты морских губок и звезд. Были разработаны методики выделения целевых веществ с помощью экстракции растворителями, колоночной хроматографии на различных сорбентах и высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате был получен ряд фракций, содержащих целевые метаболиты, а также были выделены 24 индивидуальных соединений из губок и морских звезд, включая 18 ранее неизвестных. Установлено полное химическое строение для ряда выделенных веществ, включая абсолютные конфигурации асимметрических центров. Для других предложены структуры, которые могут быть уточнены при дальнейших исследованиях. Строение выделенных веществ было установлено при помощи 1D и 2D ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, в том числе масс-спектрометрии высокого разрешения и тандемной масс-спектрометрии, а также направленных химических трансформаций, анализа спектров электронного кругового дихроизма (ЭКД) и квантово-химического моделирования. Была исследована биологическая активность ряда выделенных метаболитов. Так, удалось выделить из дальневосточной морской губки Stelodoryx toporoki четыре новых ω-гликозилированных амида жирных кислот, замещенных остатками дофамина, ранее найденных нами в губке Melonanchora kobjakovae. Это позволило установить полное химическое строение соединений. Для определения абсолютной конфигурации стереогенного центра С-2 в топорозидах А–D (ранее названных нами мелонозидами С–F) синтезировали (S)- и (R)-(2-метоксипропионил)дофамины и агликон топорозида D. Спектры ЭКД топорозидов А–D, агликона топорозида D и (S)-(2-метоксипропионил)дофамина показали сильный отрицательный эффект Коттона. Эти данные показали, что знак эффекта Коттона не зависит от длины углеводородной цепи и присутствия остатка глюкуроновой кислоты, что позволило установить 2S-конфигурацию в топорозидах А–D. Продолжая изучение спонгиановых дитерпеноидов из губки Spongionella sp., мы определили относительную конфигурацию нового спонгионеллола А на основании данных экспериментов NOESY и значений констант спин-спинового взаимодействия. Данные NOESY показали, что протоны H-6β, H3-18, H3-20, H-11β и H-17 находятся на одной и той же β-стороне молекулы, а Н-9 и Н-13 - на α-стороне молекулы. Константы спин-спинового взаимодействия показали β-ориентацию протона H-7, α-ориентацию протона Н-5, конформацию кресла колец А и В, конформацию ванны кольца С и β-положение кольца Е по отношению к остальной части молекулы. Установленная конфигурация тетрациклической системы для спонгионеллола А согласуется с предложенной ранее для спонгиановых дитерпеноидов с раскрытым D-циклом - аплирозеолов 8-12. Два выделенных дитерпеноида, спонгионеллол А и 15,16-дидезокси-15α,17β-дигидрокси-15,17-оксидоспонгиан-16-карбоксилат-15,17-диацетат, проявили высокую активность и селективность, действуя на клетки рака предстательной железы человека, в том числе и на клетки, резистентные к гормональной терапии и доцетакселу. Установлено, что механизмом действия веществ является каспазозависимый апоптоз. Из дальневосточной морской звезды Solaster pacificus было выделено восемь новых тритерпеновых гликозидов, пацификусозиды D–K, и один ранее известный тритерпеновый гликозид, кукумариозид D. Установлено, что пацификусозиды E, G и J имеют новый тип тетрасахаридной углеводной цепи с терминальным неметилированным моносахаридным остатком. Пацификусозиды F, H и K содержат иной тип новой олигогликозидной цепи с 6-O-SO3-Glc в качестве одного из моносахаридных остатков. Вероятно, морская звезда S. pacificus может частично метаболизировать тритерпеновые гликозиды голотурий, используя собственные ферментные системы. Стоит отметить, что в морской звезде S. pacificus, мы не обнаружили полярных стероидных соединений – типичных вторичных метаболитов морских звезд. Вероятно, полученные с пищей тритерпеновые гликозиды играют в морской звезде ту же защитную от хищников и патогенных бактерий роль, что и в голотуриях. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация четырех образцов морских звезд по гену 18S рРНК и определено их таксономическое положение до рода. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация пяти образцов морских губок по гену COI и определено их таксономическое положение до вида. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация четырех образцов морских звезд по гену COI и определено их таксономическое положение как до вида, так и до рода. Подобраны оптимальные условия амплификации специфичных фрагментов гена ITS для шести образцов морских губок и восьми образцов морских звезд для дальнейшей молекулярно-генетической идентификации. На данном этапе выполнения проекта опубликованы 3 статьи в журналах, индексируемых WoS и Scopus, все в журналах Q1, и одни тезисы доклада.