Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Основной задачей проекта является разработка технологии создания биоэлектронных интерфейсов для регистрации электрических параметров нейрона для управления его функцией. Для достижения поставленной цели в рамках первого года выполнения проекта создана функциональная модель усилителя биопотенциала по технологии нанесения одно -или многослойных структур из полупроводниковых, нанокомпозитных и металлических материалов на диэлектрических подложках. На основе данной модели будет создан прототип наноразмерного транзистора, который позволит проводить считывание мембранного потенциала с единичных клеток и ляжет в основу системы считывания разрабатываемых биоэлектрических интерфейсов. Для реализации плана проекта были проведены следующие исследования на нейронах и аксонах - Разработаны биологические модели для тестирования возможности измерения изменений мембранного потенциала с помощью Нанотранзисторов. Моделями могут служить миелиновые нервы лягушки (Rana temporaria), идентифицированные нейроны различных ганглиев пиявки, (Hirudo medicinalis или Macrobdella Decora) и культура нейронов гиппокампа мышей. Для данных модельных объектов исследования предлагается использовать микроспектроскопию КР, лазерную интерференционную микроскопию и сканирующую ион-проводящую микроскопию. - Исследованы изменения состояния цитоплазмы нейрона в норме и при действии медиаторов (ацетилхолин, АТФ, серотонин). Установлено, что в состоянии покоя, , максимальные изменения ОРХ наблюдали в примембранной области нейрона, а при активации АХР как в примембранной области так и в цитоплазме. Активация АХР приводит к уменьшению высоты фазового профиля (распределения ОРХ) нейрона за счет выхода везикул с серотонином в локальных областях мембраны клетки с максимальными изменениями мембранного потенциала. Проведены тестовых испытания по измерению функциональных свойств клеток с помощью Нанотранзистора и разработанных наноразмерных биосенсоров. С помощью сканирующей ион-проводящей микроскопия исследовали измерения жесткости нейрона. Разработана методология оценки различий жесткости различных участков клетки, которые не тестируются при обычных способах топографии. Установлено, что нейроны как позвоночных, так и беспозвоночных имеют значения жесткости более мягкие, чем опухолевые клетки. Установлено, что при активации АХР наблюдается существенное обратимое снижение жесткости нейрона. Действие ацетилхолина может быть связано с экзоцитозом везикул, который стимулируется повышением концентрации внутриклеточного кальция, изменением состояния плазматической мембраны или с перестройками цитоскелета. Разработана методика исследования функциональных особенностей разработанных тестовых биологических систем. Установлено, что частота Retzius-клетки сегментарного ганглия пиявки составляет от 0,25 до 0,28 Гц, а при ТС кожи (изменение температуры от 20 до 350С) за первые 1,5 – 2,5 минуты возрастает до 0,6 Гц. На фоне увеличения частоты наблюдалась так же деполяризация мембраны нейрона. Обнаружено, что изменения частоты Rz-клеток наблюдаются не только при изменении температуры участка боковой стенки тела животного, но и участков головной и хвостовой присосок. Исследованы изменения морфологии, состава и конформации липидов миелина при действии медиаторов на рецепторы нейронов. Разработан метод количественного описания молекулярной упорядоченности молекул в липидного бислоя миелина. Установлено, что различия в распределении молекул каротиноидов и фосфолипидов связаны с морфологией миелина и волокна. Молекулы каротиноидов расположены преимущественно перпендикулярно к поверхности липидного бислоя миелина, а фосфолипидов – под углом 45о. Предполагается, что микродоменная организация интернодального миелина обусловлена наличием участков, обладающих более высокой степенью насыщенности жирнокислотных остатков и упорядоченности фосфолипидов миелина, и обеспечивает оптимальное функционирование и распределение ионных каналов. Исследованы изменения вязкости плазматической мембраны, внутриклеточного Са2+ и рН при действии АХ на рецепторы изолированного нейрона и нейрона, с сохраненными контактами с другими нейронами и глиальной клеткой. При термостимуляции кожи выявлено обратимое уменьшение количества мембраносвязанного кальция нейролемы, снижение потенциала внутренней мембраны () и содержания (уровень) НАДН митохондрий Rz-клетки. 5-НТ вызывает различные по направленности, но обратимые изменения содержания мембраносвязанного Са2+ на мембране Р- и R-клеток, выраженность которых зависит от его межклеточной концентрации. Наличие корреляции между состоянием мембранных липидов (вязкость плазматической мембраны) Р- и R-клеток и их Са2+-связывающей способностью при действии данного НМ, вероятно, отражает зависимость синаптической передачи сигнала от Р- к R-клетке от экзоцитоза серотонина.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках реализации второго этапа работ был собран и протестирован модуль для поддержания жизнедеятельности клеток. Были выбраны параметры для работы модуля. Была показана необходимость реализовать программное отключение нагрева и потока жидкости на время сканирования и обратное включение на время простоя. Была выполнена успешная адаптации конструкции прототипа Системы для измерений в среде, оптимальной для функционирования живых нейронных клеток, включающей в себя применение как технологического подхода с использованием системы циркуляции и поддержания температуры, так и биологического для сохранения нормальных морфологических и функциональных свойств. Был разработан протокол обратной связи для изготовления трехмерных структур включающий в себя процесс подведения к поверхности и принцип обратной связи current appears. Был проведен подбор оптимальных материалов и условий для создания трехмерных наноструктур, интегрированных в образец с живыми нейронными клетками, включающей в себя состав прекурсора трехмерных структур, методики изготовления и материала для субстрата. В ходе данного этапа мы рассмотрели различные методы для определения трансмиттеров в живых системах и наиболее актуальной и перспективной платформой для изготовления сенсорных устройств выступает нанокапилляр, поскольку у нанокапилляра возможно изменение физического размера, например, изменение размера электрохимически активной поверхности, а также изменение длины продольной части. Доступная модификация пипеток различными способами для определения большого спектра метаболитов также относится к преимуществам использования. Было показано, что с помощью наносенсора возможно определение АФК и дофамина, была определена чувствительность по каждому из определяемых аналитов. Был описан метод измерения дисперсии показателя преломления микроскопических объёмов жидкостей с помощью автоматизированного интерференционного микроскопа МИА-1Д и измерительной кюветы с микролункой. Приведено описание алгоритма обработки получаемых изображений с целью вычисления показателя преломления. Приведены результаты измерения дисперсии показателя преломления бычьего сывороточного альбумина. Показано, что предложенный метод позволяет измерять показатель преломления жидкостей микроскопических объёмов с точностью до 4–5 знака после запятой.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе выполнения 3-го этапа проекта была разработана основа для создания Биоинтерфейса, включающую подложку, обладающую оптимальными адгезивными свойствами, нейроны, среду, обеспечивающую жизнедеятельность нейронных клеток, и механические элементы, обеспечивающие подвод детекторов от системы считывания. Необходимым требованием для основы Биоинтерфейса является подложка с достаточной электрической проводимостью для возможности дальнейшей печати трехмерных структур на поверхности Биоинтерфейса, а также с необходимыми адгезививными свойствами для обеспечения жизнедеятельности разработанных in vitro моделей. Была выполнена трехмерная печать с применением боросиликатных нанокапилляров, изготовленных из боросиликатных заготовок (OD: 1.0 mm; ID: 0.5 mm; Sutter Instruments, США) с использованием лазерного пуллера P-2000 (Sutter Instruments, США). Типичный радиус изготовленных нанокапилляров составил 50-100 нм. Для нанесение трехмерных структур нанокапилляр заполнялся раствором 0.1 M H2SO4 и 0.1 М пиррола (Sigma Aldrich, США). Далее, нанокапилляр подводился к поверхности проводящего элемента изготовленной подложки на скорости нагружения 5 мкм/с и при постоянном потенциале 100 мВ. Затем, при контакте с поверхностью на подложку подавалось постоянное электрическое сопротивление 400 мВ, что приводило к полимеризации пиррола. После начала полимеризации нанокапилляр перемещался за счет латерального движения пьезоактюаторов СИПМ с постоянной скоростью 30-50 мкм/с в необходимом направлении. В ходе выполнения данного этапа проекта произведена интеграция Наносенсоров в конструкцию прототипа Биоинтерфейса путем изготовления проводящих дорожек (Рисунок 4 и 5) из нихрома для обеспечения возможности контакта Наносенсоров в конструкцию прототипа Биоинтерфейса. В ходе выполнения проекта нами также была разработана автоматизированная система подвода зонда к поверхности объекта, позволяющая также с высокой точностью выполнять операции по ручному позиционированию нанокапилляра. Разработанный модуль значительно упрощает работу по печати наноструктур на поверхности образца. рамках проекта в качестве системы для сбора и обработки данных с Биоинтерфейса и Наносенсоров был разработан прототип биоэлектронного интерфейса, который представляет собой устройство, для одновременного считывания данных с нескольких аналоговых каналов, что позволяет измерять электронные импульсы одновременно у нескольких нейронов. Разработка позволяет использовать данное устройство, как высокоточное и высокоэффективное устройство считывания и обработки сигналов. Обмен данными между прототипом биоинтерфейса и ПК осуществляется посредством шины USB 2.0 Hi-Speed, что обеспечивает высокую скорость и надежность передаваемых данных. В рамках проекта было разработано программное обеспечение (NanoSenseDAQ.exe), позволяющее считывать, обрабатывать и анализировать цифровые данные, отправляемые прототипом модуля сбора данных. Программное обеспечение позволяет выбирать блок считывания данных, количество анализируемых каналов, и автоматически масштабировать получаемые сигналы в правильные единицы и значенияю. Был проведен анализ влияния размерного фактора, вплоть до единиц нанометра, на электрофизические характеристики усилителя потенциала. Полученные результаты систематизируют знания о влияния размерного фактора на электрофизические параметры двухканальных пипеток с полупроводниковым слоем на их окончание. Были проведены исследования влияния условий культивирования нервной клетки на характеристики модели усилителя (транзистора).Требованием к условиям культивирования нервной клетки является отсутствие влияния на вольтамперные характеристики модели усилителя (транзистора) при рабочем диапазоне концентраций. В ходе работы было обнаружено, что значительное влияние на модель разработанного транзистора вносит pH исследуемого раствора. Так, обнаружено, что рН раствора влияет на величину тока, измеряемой модели усилителя. Таким образом, измерения с применением данного сенсора необходимо проводить в среде с буфером. Были разработаны рекомендации по выбору in vitro моделей для тестирования Биоинтерфеса с интегрированными Наносенсорами.Установлено, что нейроны плохо садятся и растут на подложках ITO и Nb без предварительной обработки подложек поли-орнитином. Если на подложках ITO еще можно попробовать вырастить единичные клетки, то на подложках Nb это невозможно. В любом случае работа с нейрональной сетью на подложках ITO и Nb невозможна. Доказано, что обработка подложек полиорнитином позволяет посадить и вырастить на этих подложках нейроны, и получить нейрональную сеть. Однако было показано, что проводящие свойства подложек меняются. Подобраны условия формирования нейрональных структур из фрагментов мозжечка крысы, что может быть использовано в дальнейшем, как модель взаимодействия отдельных участков мозга животных. Установлено, что жесткость мембраны нейронов связана с типом подложек, на которых эти нейроны растут. Это наблюдается несмотря на то, что нейроны непосредственно со сплавом не контактируют, а контактируют во всех случаях только с поли-орнитином.Так, в ходе работы решено использовать матрицу с проводящими элементами для минимизации контакта культивируемых клеток с металлическими участками подложки с дальнейшим подведением проводящих полипирроловых проводящих контактов. Были проведены исследования по влиянию различных воздействий (механическое, химическое и др.) на трансформацию сигнала между соединенными нейронными клетками в сети. По результатам эксперимента обнаружено значительное повышение внутриклеточного уровня кальция как в единичной клетки, так и в нейрональной сети. Были разработаны приложения Биоинтерфейса для регистрации in vitro функционирования различных нервных клеток. В качестве объекта для сравнения была выбрана возбудимая зеленая водоросль – аналог аксона кальмара в растительном мире. Для данной водоросли хорошо изучена реакция на механических стресс. При микроповреждении клеточной стенки происходит образование локальной щелочной зоны в месте повреждения. Данный феномен был изучен с помощью сурьмянного электрода. Это дало хорошее основание для сравнения свойств наноэлектродов, разработанных в ходе реализации проекта, и широко используемах электродов из сурьмы. Калибровочные кривые для двух типов рН датчиков похожи между собой. Апробация работы рН-наносенсоров была проведена на возбудимых клетках Chara corallina при механическом повреждении клеточной стенки стеклянной микропипеткой. Регистрируемые сдвиги рН характеризуются схожей динамикой, что подтверждает возможность использования данного наносенсора для внеклеточных измерений в растворе с пониженной ионной силой.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Были подобраны оптимальные условия для визуализации морфологии тел и отростков стволовых клеток, а также исследовали изменения локальной жесткости сформировавшихся астроцитов в культуре при помощи метода сканирующей микроскопии ионной проводимости. Были подобраны условия для регистрации спектров комбинационного рассеяния (КР) от тел и отростков астроцитов в культуре при помощи метода конфокальной микроспектроскопии КР, что позволяет не только визуализировать распределение ряда биологических молекул, но и оценить изменения их конформации в норме и при патологии. Впервые были впервые проведены эксперименты по сравнению морфологии тел и отростков астроцитов, индуцированных из плюрипотентных стволовых клеток здоровых доноров и пациентов с наследственной БП. Впервые проведены эксперименты по исследованию белок-липидного состава цитоплазмы и окислительно-восстановительного состояния цитохромов ЭТЦ митохондрий астроцитов, индуцированных из плюрипотентных стволовых клеток здоровых доноров и пациентов с БП. Установлено, что высота тел, а также морфология тел астроцитов, полученных из ПСК здоровых доноров и пациентов БП, достоверно не отличаются , в то время, как высота отростков астроцитов, полученных из ПСК пациентов с БП, достоверно больше, чем высота отростков астроцитов здоровых доноров. Была проведена оптимизация условий для получения изображения нервной клетки с помощью сканирующей ионной микроскопии, получены результаты по морфологии стволовых клеток, трансформировавшихся в астроциты здоровых доноров и пациентов с БП. Предполагается, что выявленные изменения морфологии отростков астроцитов пациентов при патологии связаны с изменениями в синтезе белков или белок-липидного состава клетки. Были разработаны и исследованы на биосовместимость разные типы проводящих подложек, которые могли бы служить основой для создания Биоинтерфейса. Исследовалась способность прикрепления нейронов к разным типам подложек. Процедура размещения нейронов на подложке предполагает покрытие поверхности подложки полимером, несущим положительный или частично положительный заряд на поверхности (поли-D-лизин или поли-L-орнитин). Были проведены исследования жесткости мембраны в каждой точке поверхности клетки, выращенной на разных типах подложек. Предполагалось, что размещение клеток меняет их функциональное состояние (например, «жесткость»-свойство цитоплазмы клетки). Для подложек ITO покрытых полиорнитином жесткость мембраны оказалась высокой, порядка 2 кПа. Отметим, что максимальная величина жесткости выявлена в цитоплазме сомы нейрона. Подобраны условия формирования нейрональных структур из фрагментов мозжечка крысы, что может быть использовано в дальнейшем, как модель для исследования взаимодействия отдельных нейронов мозга животных. В в ходе исследования адгезии нейронов на искусственных подложках доказана возможность локализации нейронов коры больших полушарий мыши на поверхности (ITD) и (TVD) под-ложек, покрытых поли-L-лизином (0,5 мг/мл) в течение 2 часов. 2. Было показано, что при активации терморецепторов кожи изменения РВ Retzius-нейронов одного ганглия сопровождаются изменениями РВ как других нейронов (Р- и L-клетки) этого же ганглия, так и других ганглиев пиявки, что важно для исследования перераспределения сигнала возбуждения (ПД) в сети. Установлено, что при электростимуляции Р-клетки в Retzius-клетке генерируются дополнительные ПД, а частота РВ Retzius-клетки возрастает (Рис.21,б). Таким образом, в нейронах ганглия трансформация РВ через синапс от Р-клетки к Retzius-клетке меняет частоту РВ Retzius-клетк. Была отработана технология и разработаны необходимые механические элементы системы для нанесения трехмерных наноразмерных структур для создания контактов биоинтерфейса. Было проведено сравнение свойства наноэлектродов, разработанных в ходе реализации проекта, и широко используемых электродов из сурьмы. Калибровочные кривые для двух типов рН датчиков аналогичны. Апробация работы рН-наносенсоров была проведена на возбудимых клетках Chara corallina при механическом повреждении клеточной стенки стеклянной микропипеткой. Регистрируемые сдвиги рН характеризуются схожей динамикой, что подтверждает возможность использования данного наносенсора для внеклеточных измерений в растворе с пониженной ионной силой. Была показана чувствительность полученных структур к внешнему электрическому полю. 3. Был подобран оптимальный субстрат для фиксации нейронов H. medicinalis на стеклянной подложке с APTES для их дальнейших исследований с помощью СИПМ. Применение APTES позволяет нейронам более прочно осесть, что улучшает качество сканирования и не оказывая токсического действия на клетки. Установлено, что величина «жесткости» нейро-нов пиявки и гиппокампа меняется в диапазоне 30-200 паскаль. отработана модель дифференцировки клеток PC-12 с применением NGF. Установлена оптимальная доза NGF в расчёте на количество клеток в культуре (100 нг/мл NGF на 100 тыс. клеток, исходное количество клеток в лунке). Получены микрофотографии культуры клеток PC-12 в разные дни дифференцировки (1,3,5,7 день). Проведена оценка появления нейрональных маркеров – β3 тубулина, нейрофиламенты-L в разные дни дифференцировки (1,3,5,7 день). Проведена оценка изменения внутриклеточной концентрации Na+ и K+ при электростимуляции на 7 день дифференцировки клеток в присутствии NGF, уабаина в кальцийсодержащей среде, а также безкальциевой среде. Были получены данные о возможности использования прототипа Биоинтерфейса, нейросеть в ганглия с помощью оптических методов (стационарная, селективная флуоресцеенция) для контроля изменений уровня мембраносвязанного Са2+ (МСК) и величины мембранного потенциала митохондрии нейрона (ПМХ). 1. Доказано, что объектом исследования с помощью Биоинтерфейса могут быть: нейроны ганглиев пиявки, (Hirudo medicinalis) с отходящими от них афферентны-ми волокнами; миелиновые нервные волокна седалищного нерва лягушки (Rana temporaria); плюрипотентные стволовые клетки здорового донора и пациентов с наследственной формой болезни Паркинсона. Доказано, что дополнительными методами (оптические сенсоры) Биоинтерфейса могут быть: стационарная флуориметрия, микроспектроскопия комбинационного рассеяния (КР); лазерная интерференционная микроскопия; регистрация мембранного потенциала (МП) и потенциала действия (ПД) Rz-нейронов (осуществляли с помощью микроэлектродной техники); сканирующая ион-проводящая микроскопия (Scanning Ion-Conductance Microscopy - SICM). Установлено, что нейроны плохо фиксируются и растут на подложках ITO и Nb без предварительной обработки подложек полиорнитином (или поли-L-лизином). Обработка подложек полиорнитином позволяет посадить и вырастить нейроны, и получить сеть (исследование взаимодействий между отдельными нейронами). Подобраны условия формирования нейрональных структур из фрагментов мозжечка крысы, что может быть использовано в дальнейшем, как модель для исследования взаимодействия отдельных нейронов мозга животных с помощью Биоинтерфейса. Доказано, что использование серебряных наночстиц позволяет усилить сигнал КР и с высокой точностью тестировать, как изменение содержания и конформации ряда молекул, синтез АТФ в клетке, так и выход медиатора (серотонин) из клетки что можно использовать в модели Биоинтерфейса. Разработаны экстраклеточные платиновые наносенсоры для регистрации выхода ряда медиаторов из клетки (серотонин) и АФК, что можно использовать в модели Биоинтерфейса.