Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью проекта является изучение изменчивости генофондов отечественных пород крупного рогатого скота на основании проведения комплексных сравнительных молекулярно-генетических исследований современных и исторических (музейных) образцов. В качестве материала для исследований были использованы черепа крупного рогатого скота, сохраняемые в краниологической коллекции Музея животноводства имени Е.Ф. Лискуна. В выполнении исследований были использованы генетические, геномные и биоинформационные методы. Для проведения работ были использованы специализированные помещения для работы с исторической и древней ДНК, а также базы данных генетической вариабельности современных образцов крупного рогатого скота объекта инфраструктуры ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Использование черепов из краниологических коллекций в качестве источника ДНК осложняется тем, что их подготовка к депонированию приводит к существенной деградации нуклеиновых кислот. Особенно критично получение достаточного количества ядерной ДНК. Проводили сравнение различных методов выделения ДНК, реализованных в форме пяти различных коммерческих наборов, с модификацией условий лизиса. В качестве биоматериала был использован костный порошок, получаемый из зубов исторических образцов. Было установлено, что использование метода выделения ДНК на основе магнитных частиц позволяло получать более высокие концентрации ДНК (2,75±1,33 - 4,43±1,69 нг/мкл двухцепочечной ДНК) по сравнению с использованием колонок с силикагелевой мембраной (0,83±0,23 нг/мкл двухцепочечной ДНК). Коэффициенты корреляции между концентрацией двухцепочечной ДНК в препаратах, полученных различными методами, составили 0,54 - 0,84. Это подтверждает, что основным фактором, влияющим на успешность выделения ДНК из исторических образцов, является сохранность образца, что согласуется с результатами других исследований. Создан банк биоматериала (костного порошка и ДНК) 126 исторических образцов крупного рогатого скота девяти пород, в том числе семи отечественных пород, включая холмогорскую, ярославскую, черно-пеструю породы, великоросский скот, местный воронежский скот, местный новгородский скот, местный саратовский скот и 2 иностранные породы, участвующие в формировании отечественных пород, включая голландскую и остфризкую породы. Концентрации двухцепочечной ДНК, выделенной из исторических образцов, в депонированных препаратах варьировали от 0,17 до 26,2 нг/мкл. Для оценки пригодности полученных препаратов ДНК для полногеномного генотипирования было выполнено тестовое генотипирование 12 образцов ДНК с использованием ДНК-чипов высокой плотности, содержащих 777 тыс. SNP. Анализ полученных результатов не выявил зависимости между концентрацией ДНК и результативностью полногеномного генотипирования, оцененной по показателю Call Rate – доли генотипированных SNP от общего количества SNP на ДНК-чипе. Результативность генотипирования 95% и выше (Call rate = 0,945 – 0,979) была получена для 9 из 12 препаратов ДНК с концентрацией от 3,2 до 6,84 нг/мкл и соотношением OD260 / OD280 от 1,83 до 2,02. В трех других препаратах с концентрацией 2,9 нг/мкл (OD260 / OD280 = 1,86), 4,48 нг/мкл (OD260 / OD280 = 2,00) и 6,84 нг/мкл (OD260 / OD280 = 1,85) результативность генотипирования составила, соответственно, 0,868, 0,879 и 0,776. Вероятно, основным параметром, определяющим пригодность ДНК для различного рода молекулярно-генетических исследований, является степень деградации ДНК в образцах при подготовке экземпляров краниологических коллекций к депонированию и последующем хранении. Выполнено генотипирование исторических образцов ДНК пород черно-пестрого корня по 11 локусам микросателлитов, рекомендованных ISAG. Сравнительный анализ показал сопоставимые значения генетического разнообразия современных и исторических образцов за исключением исторических образцов новгородского и голландского скота. Расчет значений генетических дистанций (Fst) показал, что генетические различия между парами пород, представленных историческими образцами, были существенно ниже, чем между парами тех же пород, представленных современными образцами. Анализ структуры филогенетического дерева, построенного на основании значений генетических дистанций Fst, показал, что современные популяции черно-пестрого и ярославского скота сформировались на базе исторических популяций этих пород, в то время как современные и исторические популяции холмогорского скота являются двумя ветвями развития общей предковой популяции. Наиболее генетически дивергентным является новгородский скот, который, по всей видимости, формировался на базе великоросского и голландского скота при существенном участии локальных пород. Полученные нами данные показали существенное изменение аллелофонда отечественных пород черно-пестрого корня в процессе разведения. Запланированные на 2-й год выполнения работ по проекту полногеномные исследования исторических образцов позволят получить более точные данные о компонентах генома, подвергшихся наибольшим изменениям в процессе селекции изучаемых отечественных пород.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Обобщены результаты исследований исторических популяций черно-пестрого скота по микросателлитам, включая образцы холмогорской, ярославской пород, великоросского, новгородского скота и голландской породы, датированные концом 19-го – началом 20-го века. Анализ полученных консенсусных генотипов показал эффективность генотипирования 97,67±0,31%. Анализ показателей генетического разнообразия не выявил существенных различий между историческими и современными популяциями холмогорского и ярославского крупного рогатого скота (uHe = 0,726–0,774 и 0,708–0,739; Ar = 2,716–2,893 и 2,661–2,758 для исторической и современной выборок, соответственно). Наибольшим генетическим разнообразием характеризовался великоросский скот (0,852 и 3,111 соответственно), наименьшим - голландский скот (0,644 и 2,533 соответственно). Установлено незначительное участие исторического голландского скота в формировании отечественных пород, при этом показано, что большее влияние голландский скот оказывал на формирование холмогорской породы. Проведенный анализ генетической структуры популяций черно-пестрых пород показал сохранение исторических компонентов в геноме современных представителей холмогорской и ярославской пород. Результаты исследований исторических и современных образцов черно-пестрых пород были опубликованы в журнале Genes (Q1) – https://doi.org/10.3390/genes11080940. Проведено полногеномное SNP-генотипирование исторических образцов черно-пестрых пород с использованием ДНК-чипов высокой плотности. Эффективность генотипирования (call rate) варьировала от 0,566 до 0,966. В результате проведенного контроля качества для дальнейшего анализа были отобраны исторические образцы холмогорской, ярославской пород и великоросского скота, имеющие достоверные генотипы по более 27 тыс. SNP. Установлено, что уровень генетического разнообразия в исторической популяции холмогорского скота был достоверно ниже (p<0,001), а ярославского скота – достоверно выше (p<0,001) по сравнению с современными популяциями аналогичных пород. В обоих исторических популяциях скота был отмечен достоверный дефицит гетерозигот. Анализ числа протяженных гомозиготных районов (ROH) показал, что количество ROH большей длины (8-16 и > 16 Mb) было существенно выше в современных популяциях скота по сравнению с историческими, что указывает на наличие недавнего инбридинга в современных популяциях скота. Расчет генетических дистанций (Fst) показал наибольшую близость исторической популяции ярославского скота с популяцией великоросского скота. Современная популяция холмогорского скота имеет большее генетическое сходство с исторической популяцией (Fst = 0,026) по сравнению с степенью генетического сходства между исторической и современной популяциями ярославского скота (Fst = 0,078). Это позволяет предположить участие других предковых популяций в формировании современной популяции ярославского скота. Результаты анализа генетической структуры исторических и современных популяций черно-пестрого скота, оцененной по SNP-маркерам, показывают сохранение в современных популяциях обеих пород исторических геномных компонентов, что согласуется с результатами исследований, полученными с использованием микросателлитов. Проведен детальный анализ «отпечатков селекции» в современных популяциях ярославского и холмогорского скота на основании анализа высоко плотных SNP-генотипов (более 500 тыс. SNP). Наряду с подтверждением известных геномных регионов, находящиеся под давлением отбора (девять и шесть, соответственно), было выявлено по три новых области, локализованные на BTA 4, BTA 15, BTA 17 у ярославского скота и BTA 12, BTA 15, BTA 18 – у холмогорского скота. Был расширен список позиционных генов-кандидатов, ассоциированных с идентифицированными геномными регионами, выполнена их функциональная аннотация и оценено возможное участие в искусственном отборе в связи с происхождением и развитием пород. Результаты исследований «отпечатков селекции» в геноме ярославского и холмогорского скота опубликованы в статье в журнале PLoS One (Q1) - https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242200. Пополнен банк ДНК исторических образцов ДНК крупного рогатого скота, датированных концом 19-го – началом 20-го века, включая симментальскую, красную тамбовскую, курганскую, серую украинскую, казахскую, калмыцкую, киргизскую, якутскую романьольскую, фюненскую, ангельнскую, венгерскую, кианскую, красную немецкую породы, астраханский и сибирский скот. Проведенное генотипирование образцов вышеназванных пород позволило определить консенсусные генотипы по 9-и и более локусам микросателлитов для 69 образцов одиннадцати пород, включая симментальскую, курганскую, серую украинскую, казахскую, калмыцкую, киргизскую, астраханский скот, якутскую, ангельнскую, венгерскую и красную немецкую. По результатам проведенного контроля качества для дальнейшего анализа было отобрано 62 консенсусных генотипа. Анализ показателей генетического разнообразия, в целом, показал сопоставимый уровень генетического разнообразия у исторических и современных представителей пород за исключением исторической популяции курганского скота, в которой отмечался существенно более низкий уровень генетического разнообразия (Ar = 2.111±0.261, uHe = 0.500±0.108), в то время как у других исторических популяций значения вышеназванных показателей варьировали от 2.556 до 2.965 и от 0.648 до 0.789, соответственно. Среди исследованных исторических образцов достоверное отклонение от генетического равновесия по Харди-Вайнбергу было установлено только у венгерского скота (uFis = -0.129). Анализ структуры дерева Neighbor-Net, построенного на основании генетических дистанций Fst, показал наибольшую удаленность курганского скота. Современные популяции исследуемых пород локализовались, главным образом, на большем удалении от ребер сети, в то время как исторические образцы были расположены на ребрах сети. Данное наблюдение можно рассматривать как указание на смешанное происхождение исторических популяций и большую специализацию, и генетическую изолированность современных популяций. Анализ генетической структуры исторических и современных образцов красных, палево-пестрых и турано-монгольских пород показал сохранение исторических геномных компонентов в современных популяциях этих пород. На основании полученных консенсусных генотипов по 9 локусам микросателлитов, рекомендованных ISAG (BM2113, BM1824, ETH10, ETH225, INRA023, SPS115, TGLA122, TGLA126 и TGLA227) сформирована сводная база генотипов исторических образцов пород черно-пестрого корня, палево-пестрых пород и пород турано-монгольского происхождения. База генотипов содержит данные о генотипах 115 исторических образцов крупного рогатого скота 16 пород, включая 12 отечественных пород (ярославскую, холмогорскую, симментальскую, курганскую, серую украинскую, казахскую, калмыцкую, киргизскую, якутскую породы, великоросский, новгородский, и астраханский скот) и 4 иностранные породы, принимавших участие в формировании отечественных пород скота (голландскую, ангельнскую, венгерскую, красную немецкую). Генотипы исторических пород будут использованы в качестве эталонных при разработке программ сохранения отечественных пород крупного рогатого скота и выборе животных – доноров ценных генотипов для использования в селекции. Страница проекта на сайте организации - https://www.vij.ru/goszadanie-i-proekty/proekty/proekty-rnf/498-proekt-19-76-20012-rnf.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На этапе 2021 года проведены дополнительные полногеномные исследования исторических образцов пород черно-пестрого скота с использованием ДНК-чипов высокой плотности, в результате которых анализируемая выборка была расширена до 31 головы. По результатам проведенного контроля качества для проведения анализа было отобрано 67046 SNP. Было показано, что исторические популяции несут значительную долю общих геномных компонентов, в то время как современные популяции являются более генетически обособленными. Установлено сохранение исторических геномных компонентов в современных породах черно-пестрого скота, при этом наибольшая доля таких компонентов выявлена в холмогорской породе. Проведенный поиск «отпечатков селекции» в геноме исторических и современных популяций холмогорского и ярославского скота выявил наличие в холмогорской породе 67 SNP, а в ярославской породе 99 SNP, превышающих пороговые значения p<0,001. Выполнена структурная и функциональная аннотация генов, внутри которых локализованы идентифицированные SNP. Проведено полногеномное генотипирование исторических образцов крупного рогатого скота красных и палево-пестрых пород с использованием ДНК-чипов высокой плотности. По результатам проведенного контроля качества для исследований отобрано 15 образцов и 63331 SNP. Установлено, что исторические популяции крупного рогатого скота характеризуются меньшей степенью генетической обособленности по сравнению с современными популяциями. Показано, что наибольшая доля исторических геномных компонентов сохранилась в современной популяции горского скота. Это позволяет рассматривать горский скот как важнейший национальный генетический ресурс и объект для разработки программ его сохранения. Подтверждено участие красного датского скота в формировании алеллофонда красной горбатовской породы, что проявлялось в их близкой локализации на PCA-плоте, сходной генетической структуре на Admixture-плоте, а также формировании общей ветви на Neighbour-Net дереве и TreeMix дереве. Установлено существенное участие красных голштинов в формировании аллелофонда бестужевского скота, однако наличие предковых геномных компонентов позволило породе сохранить свою уникальную генетическую структуру, отличающую ее других красных пород скота и от голштинов. Создан банк ДНК бурых пород, который включает образцы ДНК 82 индивидуумов 11 пород и популяций, датированных первой четвертью 20 века, в т.ч. саратовский скот, горский скот, тувинский скот, курганский скот, тушинский скот, аулиекольская порода, костромская порода, бурая швицкая порода, шортгорнская порода, шортгорн-астраханский скот, юринский скот. Из 82 образцов, использованных в исследованиях, для 68 образцов были получены растворы ДНК с концентрациями, превышающими установленный порог 1 нг/мкл. Проведенные исследования 11 локусов микросателлитов позволили получить консенсусные генотипы по 9-11 локусам для 34 образцов, которые были использованы для популяционно-генетического анализа. Мы не наблюдали каких-либо существенных различий в генетическом разнообразии между историческими и современными популяциями бурого скота. Анализ структуры Neighbor-Net показал участие исторического бурого швицкого и горского скота в формировании современного кавказского типа бурой швицкой породы. Анализ генетической структуры популяций бурых пород показал сохранение исторических компонентов в геноме современных представителей всех исследованных пород. В результате проведенных исследований на расширенной выборке исторических и современных популяций турано-монгольского скота получены данные о динамике аллелофонда изучаемых пород и популяций скота. Сравнительное исследование аллельных профилей исторических и современных образцов калмыцкого, киргизского и казахского скота показало потерю 15 «исторических» аллелей в современных популяциях. Напротив, в современных популяциях было выявлено 60 новых аллелей, не встречавшихся в музейных образцах. Наибольшее число новых аллелей было выявлено у казахского белоголового скота, что, вероятно, отражает участие герефордов в его формировании. Установлено, что исследуемые популяции крупного рогатого скота, наиболее вероятно, ведут свое происхождение от двух предковых популяций. В процессе демографической истории в изучаемых популяциях турано-монгольского скота (калмыцкий, киргизский и казахский скот) произошли изменения аллелофонда, которые оказались наиболее значительны в казахской белоголовой породе. Вместе с тем, было установлено, что все три изучаемые современные популяции крупного рогатого скота сохранили долю предковых генетических компонентов, что делает их важнейшими национальными генетическими ресурсами.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект направлен на изучение изменчивости генофондов отечественных пород крупного рогатого скота под воздействием искусственной селекции на основании комплексных сравнительных молекулярно-генетических исследований современных и исторических (музейных) образцов. Исследования проводили на исторических (датированы концом 19 – первой половиной 20 века) и современных образцах отечественных пород крупного рогатого скота. В качестве групп сравнения в исследования были включены родственные зарубежные породы. В проведении исследований были использованы современные молекулярно-генетические и биоинформационные методы. Выполнено полногеномное генотипирование 45 исторических образцов семи пород бурого и турано-монгольского крупного рогатого скота. Результативность генотипирования (CR – call rate) составила 0,704±0,039 с вариациями в отдельных образцах от 0,402 до 0,968. Анализ параметров генетического разнообразия в группах исторических и современных представителей одноименных пород показал, что аллельное разнообразие (Ar) было достоверно (p<0,001) ниже в исторических популяциях бурого швицкого и киргизского скота по сравнению с современными. Результаты анализа Neighbor-Net показали, что исследованные исторические образцы бурого и турано-монгольского скота формировали общую ветвь, близкую к современному киргизскому скоту. Современный калмыцкий скот показал генетическую близость с современным горским скотом, что может быть связано с относительной территориальной близостью основных мест разведения указанных групп скота. Современные животные бурой швицкой породы, монгольского и якутского скота образовали породо-специфичные кластеры. Это может свидетельствовать о меньшей специализации пород в начале XX века по сравнению с современными. Расчет генетических дистанций показал наибольшую близость исторической популяции калмыцкого скота с одноименной современной породой (Fst = 0,003, D = 0,391), историческими и современными популяциями киргизского (Fst = 0,020, D = 0,537 и Fst = 0,020, D = 0,418 соответственно), современной популяцией монгольского скота (Fst = 0,030, D = 0,419). Исторический образец сибирского скота был ближе к популяциям турано-монгольского скота Средней Азии (калмыцкий, киргизский скот), чем к монгольскому или якутскому скоту, что согласуется с историей освоения Сибири, миграций калмыцких и киргизских племен. На основании анализа генотипов по микросателлитам на объединенной выборке исторических образцов черно-пестрого, красного, палево-пестрого, серого, бурого и турано-монгольского крупного рогатого получены данные о генетическом разнообразии, генеалогических связях между породами и генетической структуре изучаемых исторических популяций в сравнении с современными представителями пород. Анализ показателей генетического разнообразия на основании микросателлитынх маркеров показал, что аллельное разнообразие популяций в начале XX века было выше по сравнению с современными породами. Подобная закономерность прослеживалась во всех исследованных группах скота. Анализ главных компонент, выполненный на основании микросателлитных маркеров, позволил дифференцировать популяции черно-пестрого корня, показав близкую кластеризацию одноименных пород. В группах красного, палево-пестрого, бурого и турано-монгольского скота четкое разделение показано только для современных популяций, в то время как исторические популяции хотя и стремились к одноименным породам, но в целом были достаточно схожи между собой, что может объясняться недостаточно интенсивной селекцией в этих группах пород по сравнению с породами черно-пестрого корня. Анализ генетической структуры популяций черно-пестрых пород показал сохранение исторических компонентов в геноме современных представителей холмогорской и ярославской пород. В наибольшей степени исторические компоненты генома сохранены в холмогорской породе. В великоросском скоте обнаружены компоненты, характерные для всех четырех кластеров. В исторических образцах красных и палево-пестрых пород выявлена смешанная структура популяций, в которой присутствуют как геномные компоненты, характерные для современных пород, так и аутентичные компоненты, свойственные историческим популяциям. В исторических популяциях симментальской и ангусской породах незначительно представлены геномные компоненты, широко распространенные в современных одноименных породах, что подтверждает дивергенцию пород под действием интенсивной селекции. В красной немецкой породе обнаружены компоненты, свойственные как историческим, так и современным породам. В исторических и современных одноименных популяциях бурых и турано-монгольских пород в разной степени выявлены общие генетические компоненты. При анализе структуры популяции на основании SNP-маркеров у горского, киргизского и калмыцкого скота выявлена высокая доля генетических компонентов бурой швицкой породы, что может объясняться использованием ее в качестве улучшающей. Высокая доля компонентов, общих с монгольским скотом, в калмыцком и киргизском скоте подтверждает общность происхождения этих пород. На основании анализа генотипов по SNP-маркерам на объединенной выборке исторических образцов черно-пестрого, красного, палево-пестрого, серого, бурого и турано-монгольского крупного рогатого получены данные о генетическом разнообразии, генеалогических связях между породами и генетической структуре изучаемых исторических популяций в сравнении с современными представителями пород. Большая разрешающая способность SNP-чипов по сравнению с микросателлитными маркерами позволила выявить отклонения от равновесия Харди-Вайнберга во всех исследованных популяциях. Однако общие тенденции остались аналогичны тем, что были выявлены с использованием микросателлитных маркеров: в большинстве исследованных исторических популяций преобладал недостаток гетерозигот, в современных – избыток. Генетические связи между исследованными популяциями скота, оцененные на основании генетических дистанций по Fst, рассчитанными по SNP-маркерам, и визуализированные с использованием алгоритма Neighbour-Net, не противоречат результатам микросателлитного анализа. По результатам тестового полногеномного секвенирования (WGS) нам удалось собрать на референсный геном геномы всех девяти генотипированных исторических образцов и экстрагировать SNP-генотипы, используя позиции, локализованные на Bovine HD 700K BeadChip. Однако результативность успешно генотипированных SNP (GC.Score>0,5), используя данные WGS, между отдельными образцами существенно различалась и варьировала от 24889 SNP до 734384 SNP. Для сравнения, число экстрагированных SNP в современных образцах варьировало от 454030 до 674987 SNP. Проведенный анализ тестовых полногеномных данных показал, использование технологии полногеномного секвенирования позволяет существенно расширить объем получаемой генетической информации, пригодной для дальнейшего анализа, что открывает новые возможности в расширении нашего понимания воздействия искусственной селекции на формирование аллелофонда пород крупного рогатого скота. Таким образом, результаты проведенных исследований по проекту показали, что в современных популяциях отечественных пород крупного рогатого скота сохранились исторические генетические компоненты. По результатам проведённых исследований предложена комплексная стратегия сохранения и тиражирования высокоценных генетических ресурсов крупного рогатого скота и интеграции результатов исследований в программы селекционно-племенной работы с породами. Выполнена апробация технологии в условиях селекционно-племенного центра ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста.