Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе первого года работы по проекту было установлено, что введение Инфликсимаба приводит к замедлению развития ЕАЕ и проявлению клинических симптомов на более поздних этапах заболевания по сравнению с мышами без блокировки или с блокировкой hTNF с помощью MYSTI. Кроме того, введение Инфликсимаба приводило к установлению хронического течения заболевания и отсутствию ремиссии, в то время как у мышей без блокировки и на фоне MYSTI происходило снижение клинических симптомов на поздних этапах ЕАЕ, соответствующих фазе ремиелинизации. При этом в экспериментальном артрите введение как системного (Инфликисмаб), так и тканеспецифического блокатора (MYSTI) успешно подавляло развитие симптомов заболевания, что свидетельствует об эффективности блокировки TNF только из макрофагов при терапевтическом введении антител. Мы подтвердили, что системная, но не тканеспецифическая блокировка TNF из макрофагов, полностью подавляла образование герминальных центров В-клеточных фолликулов при иммунизации мышей Т-клеточно-зависимым антигеном. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования MYSTI для ингибирования TNF при различных патологиях, в первую очередь, в ревматоидном артрите, но и в рассеянном склерозе при условии, оптимизации протокола введения препарата. Обнаружено, что Ltα-дефицитные мыши, полученные в нашей лаборатории, восприимчивы к индукции ЕАЕ и развивают заболевание, сравнимое по клиническим показателям с мышами дикого типа. В то же время, мыши с дефицитом LTβR развивают клинические симптомы ЕАЕ на 14-15 дни после иммунизации MOG-пептидом. Замедление развития заболевания у мышей, дефицитных по Ltβr, но не у мышей с удалением Ltα может говорить о защитной роли LTα3 на ранних стадиях заболевания, а также свидетельствует о патогенной роли LTβR на стадии инициации ЕАЕ. Показано, что при нарушении сигнальных путей, опосредованных лимфотоксином, происходит накопление CD19+ В-клеток в ЦНС в Т-клеточнозависимой модели ЕАЕ. Более того, отсутствие Lta и Ltbr приводило к дифференцировке В-клеток в популяцию CD5+CD1d+ В-регуляторных клеток, способных супрессировать развитие заболевания. Установлено, что удаление IL-6 как в клетках микроглии, так и во всех миелоидных клетках, не влияло на развитие MOG35-55–индуцированного ЕАЕ и дифференцировку FoxP3+ Т-регуляторных клеток и IL-17A-продуцирующих Th17-клеток. Кроме того, в отсутствие IL-6 клетки микроглии активировались на уровне, сравнимом с мышами дикого типа, то есть удаление IL-6 не влияло на способность микроглии к активации. Обнаружено, что удаление TNF из Т-клеток не влияет на развитие Treg клеток, а также не затрагивает их супрессорные функции в гомеостазе. Показано, что TNFR2 сигнальный путь участвует в накоплении B2-клеток в гомеостазе. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о высокой эффективности комбинированной фармакологической блокировки IL-6 и TNF в модели HDM-индуцированной смешанной астмы у мышей, по сравнению с блокировкой отдельных цитокинов. Комбинированная блокировка двух провоспалительных цитокинов предотвращала экспансию патогенных Th17-клеток, вызванную анти-TNF монотерапией. Наши результаты свидетельствуют о том, что в патогенезе астмы задействована сложная система цитокиновых взаимодействий и, следовательно, терапевтические подходы, направленные на подавление не одного, а нескольких цитокинов одновременно, могут оказаться более эффективными, чем системная монотерапия. В ходе изучения роли цитокинов, а именно, IL-6 в патогенезе заболеваний кишечника, ассоциированных с воспалением, было показано, что IL-6 KO мыши более чувствительны к острому и хроническому DSS-индуцированному колиту, чем мыши дикого типа. При этом в модели колоректального рака, число опухолей и опухолевая нагрузка снижалась у мышей с полным нокаутом IL-6. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что IL-6 важен для развития колоректального рака у мышей в модели AOM-DSS, а изучение клеточных источников патогенного при раке и защитного в контексте острого колита цитокина является актуальной задачей. Важная роль передачи сигнала через рецептор лимфотоксина LTßR была продемонстрирована также в модели контактного дерматита, индуцированного оксазолоном. Было установлено, что мыши, дефицитные по LTßR, развивают менее тяжелое воспаление кожи, чем мыши дикого типа и мыши с дефицитом LTa, что, во-первых, свидетельствует о важности пути передачи сигнала, не опосредованного LTa3, через LTßR, а во-вторых, указывает на существование механизмов развития аллергического воспаления, не зависящего от наличия региональных лимфоузлов. Была начата работа по изучению роли цитокинов в патогенезе аутоиммунного диабета 1 типа на мышах. Для этого использовали клеточно-специфический алкилирующий агент: стрептозоцин (STZ). Оказывая токсичное воздействие на инсулин-продуцирующие клетки поджелудочной железы, STZ успешно вызвал хроническую гипергликемию у мышей дикого типа и сильную потерю веса при высоких дозировках. Мышам с STZ-индуцированным диабетом далее наносили полнослойные раны кожи на спине. Динамика заживления ран у мышей с диабетом не отличалась от динамики контрольных мышей. Однако после полного заживления ран у мышей, получавших высокие дозы STZ, было обнаружено нарушенное восстановление волосяного покрова. Показано, что два типа биспецифических блокаторов TNF человека, имеющих в своем составе одинаковый TNF-нейтрализующий модуль, но отличающиеся второй специфичностью, направленной на взаимодействие с поверхностными маркерами F4/80 (MYSTI-2) или CD11b (MYSTI-3) миелоидных клеток мыши, существенно отличаются по своей эффективности и динамике интернализации с поверхности клеток in vitro, что объясняет более высокую эффективность MYSTI-2 in vivo в сравнении с MYSTI-3 в экспериментах с отложенной индукцией острой гепатотоксичности. Экспериментально обоснована технология оптимизации биспецифических мини-антител путем перестановки местами двух VHH-модулей и использования серин-глицинового линкера, обеспечивающего большую подвижность доменов относительно друг друга. Кроме того, обоснован выбор мишеней для создания гуманизированных мини-антител, способных связывать и удерживать TNF на поверхности миелоидных клеток человека. В качестве основной мишени выбран CD14, высокий уровень экспрессии которого характерен для макрофагов человека. Получена конструкция, кодирующая внеклеточный домен CD14, для экспрессии, наработки и последующей иммунизации верблюда. Информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту: http://molimmunol.ru

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Общей методологической основой проводимых исследований является панель созданных за 20 лет и находящихся в стадии разработки генетически модифицированных мышей, которые используются как доклинические модели целого ряда заболеваний со значительной социальной значимостью (артрит, колит, аллергия и астма, рассеянный склероз, рак). В 2020 г. завершено многолетнее исследование, в ходе которого дано объяснение ограниченной эффективности анти-TNF терапии системного действия. Статья опубликована в одном из самых престижных журналов в области ревматологии – Annals of Rheumatic Diseases (IF=16). doi: 10.1136/annrheumdis-2019-216068. На основании этих результатов созданы и изучаются прототипы лекарств нового типа, основанные на биспецифических антителах, опубликована методологическая статья по их получению. Результаты лаборатории имеют первостепенное значение для перспективных клинических исследований и для медицины будущего с целью оптимизации и персонализации анти-цитокиновой терапии, а также поиска более эффективных методов лечения аутоиммунных, нейроиммунных и воспалительных заболеваний и рака.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Цитокины – молекулярный язык межклеточных коммуникаций, которые обеспечивают поддержание гомеостаза клеток и тканей организма (в т. ч. иммунной системы), а также вовлечены в патогенез различных заболеваний. Многие аспекты воспаления, аутоиммунитета и неоплазий связаны с действием цитокинов через специфичные рецепторы. Фундаментальную научную проблему представляет установление новых физиологических функций даже известных цитокинов и цитокиновых сигнальных каскадов, понимание молекулярных и клеточных механизмов их работы при заболеваниях, поиск новых терапевтических мишеней и разработка инновационных подходов к анти-цитокиновой терапии. Проект сфокусирован на изучении иммунорегуляторных, защитных и «патогенных» функций нескольких важнейших цитокинов - фактора некроза опухоли (TNF), лимфотоксина (LT) и интерлейкина-6 (IL-6). Общий методологический принцип нашего исследования базируется на панели созданных за 20 лет и находящихся в стадии постоянного расширения новых линий генетически модифицированных мышей с полным или тканеспецифичными нокаутами основных генов, входящих в сигнальные каскады TNF/LT и IL-6. Эти линии мышей используются нами как доклинические модели целого ряда заболеваний (астма, рассеянный склероз, рак кожи и псориаз, колит и колоректальный рак, артрит и некоторые другие патологические состояния). Кроме того, эти модели позволяют изучать роль цитокинов в гомеостазе – то есть в поддержании целостности барьерных тканей и баланса состава микробиоты, модуляции функций нервной системы, поведенческих реакциях и иммунометаболизме. Так, за отчетный период установлен вклад лимфотоксина, продуцируемого миелоидными и лимфоидными клетками, в гомеостаз и нейровоспаление. Мыши с генетической инактивацией IL-6 в дендритных клетках проявили частичную устойчивость к развитию заболевания с экспериментальной модели рассеянного склероза (ЕАЕ). Кроме того, оказалось, что IL-6, продуцируемый микроглией, принимает участие в формировании пространственной памяти, а TNF/TNFR2 сигнальный путь участвует в регуляции агрессии, однако нарушенная передача этого сигнального пути не затрагивает формирование депрессивно-подобного и тревожного поведения. В условиях системного LPS-индуцированного воспаления основным источником IL-6 оказалась мышечная ткань, а также печень, белая и бурая жировые ткани. В экспериментальной модели астмы комбинированная фармакологическая блокировка TNF и IL-6 оказалась эффективнее в улучшении функции легких и снижении фиброза в отличии от инактивации TNF и IL-6 по отдельности. В экспериментальной модели колоректального рака установлена роль IL-6 модуляции состава микробиоты. При исследовании роли лимфотоксина в воспалении и раке кожи показано, что в модели химически- индуцированного рака кожи LTα- и LTβR-дефицитные мыши значительно более восприимчивы к развитию плоскоклеточного рака кожи: у них образуется больше папиллом, а заболевание развивается быстрее. Предполагается, что сигнальный путь LTα-LTβR отвечает за регуляцию местной продукции IL-4 и IL-13 в коже при воспалении, и, таким образом, может модулировать противоопухолевый ответ. Установлена защитная роль TNFR2 в хроническом воспалении кишечника и контроле новообразований. На первичных культурах клеток с генетической инактивацией провоспалительных цитокинов определены молекулярные каскады, обеспечивающие взаимодействие стромальных клеток и лимфоцитов в трехмерном пространстве. Полученные за отчетный период результаты были представлены молодыми исполнителями проекта в многочисленных докладах на нескольких конференциях, в том числе на Европейском конгрессе по иммунологии, прошедшем в он-лайн формате, и Международной конференции, посвященной цитокинам суперсемейства TNF в Швейцарии. В начале 2021 научные сотрудники Носенко М.А. и Атретханы К.С. были удостоены Премии Правительства Москвы молодым ученым (2020) за цикл работ по теме «Провоспалительные цитокины - ключ к терапии аутоиммунных и раковых заболеваний» (https://nauka.mos.ru/). Кроме того, по результатам реализации проекта представлена диссертационная работа Губернаторовой Е.О. по теме «Интерлейкин-6 в иммунитете слизистых оболочек» на соискание степени кандидата биологических наук. Руководитель и исполнители проекта выступили одновременно организаторами и докладчиками на молодежной научной школе-конференции, посвященной актуальным проблемам иммунологии и физиологии, в том числе, цитокинам и цитокиновым сигнальным каскадам в контексте патогенеза COVID-19 и иммунного ответа на SARS-CoV-2. Слушателям были предложены две специальные лекции, посвященные памяти выдающихся ученых, иммунолога Charles A. Janeway Jr. и вирусолога Льва Александровича Зильбера, а также около десяти научных докладов ведущих ученых, покрывающих разнообразные аспекты иммунологии и физиологии. Кроме того, молодым ученым, среди них и молодые исполнители проекта, была предоставлена возможность выступить с научными докладами по результатам своей работы в формате кратких устных сообщений.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 г. основные усилия этого комплексного проекта были направлены на изучение роли цитокинов в индукции и поддержании острого и хронического воспаления в нескольких экспериментальных моделях, в т.ч. хронического воспаления как предшественника опухолевой трансформации в модели колоректального рака. ВОСПАЛЕНИЕ КИШЕЧНИКА И КОЛОРЕКТАЛЬНЫЙ РАК Несмотря на широкое применение анти-TNF терапии при воспалительных заболеваниях кишечника, роль TNF и его рецепторов в контексте этих патологий до сих пор однозначно не установлена. В экспериментах по индукции острого колита у мышей с дефицитом передачи сигнала через рецепторы TNF было установлено, что в отсутствие TNFR1 нарушается CXCL1 и CXCL5-опосредованное привлечение в кишечник нейтрофилов, что компрометирует антимикробную защиту на острой стадии воспаления. В то же время, отсутствие адекватной передачи сигнала через TNFR2 в случае хронического воспаления кишечника приводит к нарушению баланса эффекторных и регуляторных популяций Т-хелперов, что также вызывает тяжёлое повреждение кишечника. Таким образом, TNFR1 и TNFR2 по-разному выполняют защитную роль в колите, модулируя эффективный противомикробный ответ при остром воспалении (TNFR1) и контролируя баланс T-хелперов при хроническом воспалении (TNFR2). Эти результаты требуют дальнейшего экспериментального развития. Аналогичным образом была исследована роль IL-6 в патогенезе колита и колоректального рака. За отчетный период было установлено, что дефицит IL-6 в CD11c клетках, сказывается на содержании RORγt+ FoxP3+ клеток в собственной пластинке кишечника. Вопрос о том, влияет ли отсутствие IL-6 из дендритных клеток на другие RORγt-положительные популяции, а именно, на Th17 клетки и ILC, потребует более детального изучения в случае продления финансирования. Также было установлено, что на фоне острого воспаления у мышей с дефицитом IL-6 также снижается содержание RORγt+ клеток в собственной пластинке кишечника, а при индукции колоректального рака снижение RORγt+ клеток наблюдается и в опухолях. В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что IL-6 из CD11c+ дендритных клеток необходим для поддержания кишечного гомеостаза в условиях воспаления, но при этом может способствовать опухолевой прогрессии, регулируя накопление продуцирующих IL-17A RORγt+ клеток. Наконец, дефицит IL-6 в CD11c+ клетках сопровождается снижением уровня экспрессии цитокинов, вовлеченных в репарацию тканей, что может объяснять чувствительность таких мышей к колиту, но, с другой стороны, повышенную устойчивость к развитию опухолей в толстом кишечнике. Изменение состава микробиоты рассматривается может способствовать хроническому воспалению и опухолевой трансформации. За отчетный период были выявлены изменения в составе микробиоты и охарактеризован фенотип незрелых миелоидных клеток, накапливающихся в крови Lta-дефицитных мышей (Lta∆/∆) при совместном содержании с мышами дикого типа. Так, при совместном содержании с мышами дикого типа у Lta-дефицитных мышей уменьшается соотношение Firmicutes/Bacteroidetes. При этом в сыворотке происходит увеличение концентрации CCL2, ассоциированное с привлечением в кровь миелоидных клеток, экспрессирующих аргиназу-1. В отдельном подпроекте была рассмотрена возможная вырожденность сигналов, передаваемых двумя близкородственными цитокинами TNF и LT, в органогенез Пейеровых бляшек, расположенных в дистальном отделе тонкой и проксимальном отделе толстой кишки. Оказалось, что для формирования этих лимфатических фолликулов необходим TNF, продуцируемый ILC3. В этом сложном процессе сигнал от мембранного LT комплекса, содержащего LTβ, необходим с самых ранних стадий закладки зачатка лимфоидного органа, в то время как сигналы от TNF и LTα нужны на более поздних стадиях и имеют перекрывающиеся функции. Результаты этой части исследования были опубликованы в этом году (Gogoleva et al, 2022). ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ БЛОКИРОВКА ЦИТОКИНОВ Успешное лечение хронических воспалительных заболеваний включает в себя как прекращение воспаления, так и своевременную индукцию процессов восстановления тканей. Интересно, что TNF регулирует оба этих процесса и его блокировка успешно используется в лечении колита уже долгие годы, несмотря на предполагаемое подавление процессов репарации. В 2022 г. завершено и опубликовано многолетнее исследование механизма действия блокаторов TNF при воспалении кишечника с использованием уникальной линии мышей, гуманизированных по TNF. Оказалось, что блокировка TNF улучшает заживление кишечника посредством увеличения биодоступности IL-22, необходимого для пролиферации эпителиоцитов. Впервые показано, что мембранно-связанный TNF, экспрессируемый Т-клетками, поддерживает воспаление, в то время как растворимый TNF из эпителиальных клеток индуцирует экспрессию IL-22BP, который сдерживает IL-22-зависимое восстановление кишечника (Ninnemann et al, 2022). Комбинированная антицитокиновая терапия рассматривается как многообещающий подход к лечению тяжелой и резистентной к кортикостероидам астмы. В ходе проекта на животных моделях было впервые установлено, что комбинированная блокировка TNF и IL-6 оказывает комплексный эффект, проявляющийся как в снижении Th2-ассоциированной эозинофилии, так и Th1/Th17-опосредованной нейтрофилии в мышиной модели аллергической астмы. В совокупности полученные данные свидетельствуют о терапевтическом потенциале комбинированной фармакологической блокировки TNF и IL-6 при тяжелой нейтрофильной астме, что должно заинтересовать практическую медицину. Результаты этого исследования были опубликованы в статье (Namakanova et al. 2022). Другая часть исследования, связанного с фармакологической блокировкой цитокинов, посвящена изучению свойств уникального биспецифичного блокатора, избирательно направленного против TNF, продуцируемого миелоидными клетками (MYSTI). Ранее мы показали, что защитные свойства этого биспецифика коррелируют с низким уровнем системного TNF в сыворотке у мышей в экспериментальной модели острой гепатотоксичности, что свидетельствует об эффективной нейтрализации TNF in vivo. В отчетном году были исследованы некоторые фармакодинамичсекие показатели и оценена биодоступность биспецифичного блокатора TNF в сравнении с системным клинически применяемым блокатором. Кроме того, была впервые продемонстрирована эффективность MYSTI в модели колита. За отчетный период был проведен многопараметрический анализ продукции цитокинов, который выявил, что ярко выраженное снижение симптомов экспериментального артрите при фармакологической блокировке TNF сопровождается значительными изменениями цитокинового профиля с более низкой системной продукцией многих медиаторов воспаления. Результаты этой части проекта пока не опубликованы, но вошли в материалы диссертационной работы Друцкой М.С. на соискание степени доктора биологических наук, представленной к защите в декабре 2022 г. ЦИТОКИНЫ И ИММУНОМЕТАБОЛИЗМ Одно из новых направлений исследований лаборатории касается изучения иммунометаболических изменений в макрофгагах в контексте аллергического воспаления в экспериментальной модели астмы, индуцированной экстрактом клеща домашней пыли. Для моделирования ответа миелоидных клеток на первую встречу с аллергеном при сенсибилизации в астме, были апробированы протоколы in vitro дифференцировки из костного мозга нескольких типов миелоидных клеток, ассоциированных с легкими. Установлено, что уже при первой встрече с аллергеном, миелоидные клетки приобретают специфический иммунометаболический фенотип, характеризующийся продукцией провоспалительных цитокинов и одновременным увеличением показателей дыхания и гликолиза. При этом часть характерных для макрофагов иммунометаболических изменений при первом контакте с аллергеном опосредована передачей сигнала через рецептор врожденного иммунитета - TLR4. Эти результаты были опубликована в 2022 г. (Yurakova et al. 2022). Расшифровка молекулярных каскадов, запускаемых в миелоидных клетках сложными аллергенами будет продолжена в будущем.