Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведен анализ текущей литературы о роли и участии митохондрий и различных изоформ пориновых белков митохондрий в механизмах действия известных противораковых препаратов (паклитаксела, доксорубицина), а также существующих подходов к созданию новых терапевтических соединений адресного воздействия на митохондриальные пориновые белки. Уделено особое внимание на участие систем контроля качества белков в митохондриях в формировании клеточного ответа на стресс. Упор в Обзоре делается на выяснение особенностей взаимодействия внешних стрессов (в том числе и химиотерапевтических агентов, доксорубицина и паклитаксела) на метаболическую активность митохондрий и влияние различных изоформ поринов. Созданы и отработаны методы культивирования гормон-зависимых культур аденокарцином молочной железы человека двух типов MCF-7 и BT474. Используя модифицированный метод CRISPR-Cas9, наиболее современный и распространенный метод генетического редактирования генома клеток человека в культуре, было проведено генетическое редактирование клеток MCF-7 (рак молочной железы человека) и получены одиночные VDAC1, VDAC2 и VDAC3 нокауты клеток MCF-7. Успешность удаления соответствующих генов (vdac1, vdac2, vdac3) подтверждена тремя независимыми методами, в том числе методом ко-трансфекции клеток красным флуоресцентным белком (RFP), который в генетически модифицированных клетках регистрируется как появление красной флуоресценции в ядре и цитоплазме клеток. В предварительных экспериментах обнаружено, что удаление VDAC1 или VDAC2 увеличивает чувствительность MCF-7 VDAC1 KO и MCF-7 VDAC2 KO, но не MCF-7 VDAC3 KO клеток, к классическим противораковым препаратам (доксорубицину и паклитакселу). Удаление отдельных изоформ поринов сопровождается изменением метаболической активности как показано по восстановлению Резазурина (Аламар) для всех типов клеток. Удаление ростовых факторов в среде инкубации индуцирует клеточную гибель по типу апоптоза. В наших предварительных экспериментах, полное и длительное удаление ростовых факторов из среды инкубации сопровождалось массовой клеточной гибелью всех типов клеток, что указывает на необходимость поддержания концентрации ростовых факторов в среде, которое обеспечивает жизнеспособность клеток и достаточно для закрывания пориновых каналов, что необходимо для определения роли каждой из изоформ в стресс-устойчивости генетически модифицированных клеток рака молочной железы человека. Получены предварительные данные по последствиям нокаута VDAC1, VDAC2, VDAC3 на основные митохондриальные характеристики (синтез АТФ, транспорт ионов кальция, кальциевая емкость митохондрий in situ, мембранный потенциал, содержание и модификация митохондриальной ДНК). Показано, что удаление поринов приводит к усилению цитотоксического эффекта доксорубицина и паклитаксела. Установлена необходимость получения культур клеток, в которых будут методами генетической модификации получены линии, содержащие только одну из изоформ поринов (VDAC1,2 KO, VDAC2,3 KO, VDAC1,3 KO). Используя созданную нами модель компьютерного докинга молекулы hVDAC1, наиболее распространенной изоформы человеческого порина (hVDAC1), мы идентифицировали потенциальный блокатор поринов, вещество под названием Oxyphenisatin (3,3-bis(4-hydroxyphenyl)-1H-indol-2-one), известное под цифровым идентификатором, присвоенным для тестирования (NSC номером) NCS 59814 (https://dtp.cancer.gov/organization/dscb/obtaining/available_plates.htm). Продемонстрировано, что нокаут изоформы VDAC1, мало влияет на транспорт и общую кальциевую емкость по сравнению с диким типом клеток, в отличие от VDAC2 и VDAC3, удаление которых снижает общую кальциевую емкость и время удержания наколенного кальция в матриксе. Сделан вывод о том, что VDAC1, модифицирует кальциевый гомеостаз митохондрий в меньшей степени чем VDAC2 или VDAC3. Изменение проницаемости внешней мембраны митохондрий к АДФ, одному из субстратов митохондриальной аденилаткиназы определялось по влиянию пориновых нокаутов на активность окислительного фосфорилирования, основную функцию митохондрий. Обнаружено, что генетическая модификация профиля поринов в клетках MCF-7, сопровождается изменением процессов окислительного фосфорилирования добавленной АДФ, в различных типах дигитонин-пермеабилизованных клеток MCF-7. Необходимо особо отметить, что удаление отдельных изоформ поринов, не затрагивает целостности сопрягающей мембраны и дыхательной цепи во всех типах клеток, и 2.4ДНФ стимулировал дыхание, которое оставалось чувствительным к азиду натрия (NaN3), специфическому ингибитору дыхательной цепи и цитохром оксидазы. Эти данные совпадают с тем, что митохондрии в дигитонин-пермеабилизованных клетках всех четырех типов (MCF-7 WT; MCF-7 VDAC1 KO; MCF-7 VDAC2 KO; MCF-7 VDAC3 KO) сохраняют способность создавать мембранный потенциал, необходимый для транспорта ионов кальция и поддержания окислительного фосфорилирования. Показано, что удаление VDAC1, но не VDAC2 или VDAC3, усиливает метаболическую активность. Создана успешная животная модель ортотопической твердой опухоли в голых мышах BALB/cNUDE, с предварительно подготовленным эстрогеновым фоном, при этом инокуляцию и наращивание опухолей проводили под контролем восстановления эстрального цикла у каждой мыши. Ортотопическая модель опухоли из диких и VDAC1 нокаутных клеток показала различия в динамике опухолеобразования между дикими и VDAC KO клетками MCF-7. В результате проведенных исследований показано, что генетическое удаление одной из трех изоформ митохондриальных поринов (VDAC1, VDAC2, VDAC3) и модификация общего содержания пориновых каналов в клетках рака молочной железы человека, не влияет на их жизнеспособность, и две остающихся изоформы в любых комбинациях обеспечивают и поддерживают метаболическую активность модифицированных клеток. Из полученных данных нельзя сделать однозначных выводов о ведущей роли какой-нибудь из изоформ поринов в обеспечении и поддержании жизнеспособности этих клеток рака молочной железы человека. Подобно диким клеткам с полным набором, генетически модифицированные клетки не демонстрируют значительных изменений в уровне базовой клеточной гибели или признаков апоптозной клеточной гибели. Часть полученных результатов опубликована в отечественных и зарубежных журналах, а также представлена на трех международных форумах (VI Съезд Биофизиков России, Россия, 2019; Национальный Институт Сердца, Легких и Крови, Симпозиум по Биологии Митохондрий, США Бетезда 2019; Рецепторы и внутриклеточная сигнализация, 2019).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Сравнительный анализ «диких» (WT) и VDAC-модифицированных MCF-7 клеток, продемонстрировал, что VDAC-дефицитные клетки имеют более высокий уровень окислительного стресса, и под действием одинаковых концентраций одного и того же препарата и повышенную чувствительность к индукции окислительного стресса. В работе установлено, что генетическое удаление любой из изоформ поринов из клеток MCF-7, приводит к значительному увеличению чувствительности полученных клеток, и модификация содержания поринов сопровождается повышенной чувствительностью клеток к апоптозной клеточной гибели. 2. Временная и дозовая зависимость активации каспазы-3 в культуре «диких» клеток MCF-7 демонстрирует низкий уровень активации каспазы-3, и в противоположность диким клеткам, VDAC-модифицированные клетки (VDAC1-/-; VDAC2-/-; VDAC3-/-) демонстрируют драматическое увеличение чувствительности и активацию каспазы-3, характеристического маркера и показателя индукции и развития процесса апоптозной клеточной гибели. Анализ состояния ядерного материала с использованием пропидиумом иодида, флуоресцентного ядерного красителя, показал, что удаление митохондриальных поринов не приводит к характерным изменениям морфологии ядерного материала в «диких» и VDAC-модифицированных клетках. Доксорубицин и паклитаксел, уменьшали способность митохондрий к накоплению добавленных ионов кальция и активацию Ca2+-зависимой неспецифической МРТ поры в дигитонин-пермеабилизованных «диких» и VDAC-дефицитных клетках MCF-7. Различия в поведении поры (общая Ca2+ емкость митохондрий, скорость накопления ионов Ca2+ наблюдались при окислении субстратов Комплекса 1 (пируват/глутамат) и Комплекса 2 (сукцинат в присутствии ротенона) в «диких» клетках MCF-7 по сравнению с их VDAC-дефицитными производными. Ca2+ емкость митохондрий, активация Ca2+-зависимой неспецифической поры, которая сопровождается увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий и потерей мембранного потенциала, коррелировало с индукцией апоптоза и выходом апоптогенных факторов. Показано, что высвобождение митохондриальных апоптогенных факторов происходит без участия Ca2+-зависимой МРТ поры и не чувствительны к блокатору МРТ поры. 3. Установлено, что клетки MCF-7и ее производные обладают повышенной чувствительностью к действию низких концентраций ростовых факторов, и демонстрируют выраженную клеточную гибель при низких концентрациях сыворотки (1%-0.1% ФБС). Это обстоятельство оказалось непреодолимым препятствием для использования низких концентраций сыворотки для создания условий, когда пориновые каналы закрываются. В предварительных данных мы показали, что другой класс клеток рака молочной железы человека, ВТ474, не теряют своей жизнеспособности в течении 96 часов при инкубации в средах инкубации с очень низким (0.01% ФБС) содержанием добавленной сыворотки. Так клетки ВТ474 также являются предметом исследования настоящего гранта, то они будут использованы в работах по изучению закрытого состояния VDAC каналов, индуцированных при физиологических условиях. 4. Цитотоксичность доксорубицина и паклитаксела к «диким» и VDAC-дефицитным производным MCF-7 клеток при различных дозах агентов отличается незначительно между различными линиями, в то же время действие этих же препаратов на метаболическую активность всех 4 типов клеток имеет выраженную зависимость и распадается на две группы: метаболизм клеток «диких» и VDAC-3-/-дефицитных монотонно убывает, а для VDAC-1-/- и VDAC-2-/-дефицитных клеток проходит через максимум. Обнаружено, что удаление пориновых каналов и их изоформ при патофизиологических условиях, способствующих искусственному снижению проницаемости внешней мембраны митохондрий, сопровождается подавлением реакций окислительного фосфорилирования в комплексе 2, при удалении из митохондрий изоформ VDAC1-/- и VDAC3-/-, но не VDAC2-/-. 5. Для всех клеточных линий MCF-7 (WTи VDAC KO) показано, что дигитонин при концентрации 0.005% успешно увеличивает проницаемость плазматической мембраны для получения доступа к внутриклеточным митохондриям, без механического разрушения архитектуры клеток и сохранения внутриклеточного окружения и структуры митохондрий. Способность митохондрий накапливать и удерживать определенное количество добавленных ионов кальция меняется и каждый тип клеток демонстрирует характерную кальциевую емкость и удаление любой из изоформ VDAC в этих клетках, сопровождается значительным (в 2-3 раза) уменьшением Ca2+-емкости в дигитонин-пермеабилизованных клетках всех типов и Ca2+ аккумулирующая емкость и транспорт ионов Ca2+ в митохондрии «диких» и VDAC-дефицитных клетках рака молочной железы, MCF-7, радикально отличаются друг от друга. Используя флуоресцентную конфокальную микроскопию, продемонстрировано изменение проницаемости внешней мембраны митохондрий в «диких» и VDAC-дефицитных клетках по накоплению и удержанию флуоресцентного зонда 3 кДа и накопление флуоресцентной краски размером 3 кДа уменьшается в следующем порядке: MCF-7 WT> MCF-7 VDAC2-/-> MCF-7 VDAC3-/-, в состоянии покоя и в отсутствие химиотерапевтических агентов. Продемонстрирована также, различная степень поляризации митохондрий в «диких» и VDAC-дефицитных клетках MCF-7, что приводит к различной степени деполяризации внутриклеточных митохондрий под действием доксорубицина. Наибольшая поляризация внутриклеточных митохондрий наблюдается в VDAC1-/--дефицитных клетках и уменьшается в следующем порядке: MCF-7 WT> MCF-7 VDAC2-/-> MCF-7 VDAC3-/-. Действие доксорубицина и паклитаксела сопровождается сдвигом метаболической активности клеток и снижению скорости синтеза АТФ и усиления гликолиза. Удаление VDAC1-/- I VDAC3-/- снижает АДФ и ДНФ зависимое дыхание, в то время как удаление изоформы VDAC2-/-, практически не изменяет ни АДФ, ни ДНФ зависимое окисление сукцината в этих митохондриях. Модуляция максимальной активности дыхательной цепи, при работе комплекса 2 (окислении сукцината) в следующем порядке: MCF-7 VDAC3-/-> MCF-7 VDAC1-/-> MCF-7 VDAC3-/-. Оба препарата подавляли скорость роста клеток MCF-7 (WT) и MCF-VDAC KO в логарифмической фазе роста. 6. Используя электрофизиологическую модель реконструкции VDAC-каналов на бислойной мембране и/или в однослойных липосомах продемонстрировано, что все соединения из списка 23 агентов, выявленных нами в предварительных исследованиях из базы свободного доступа таких как National Cancer Institute (NCI, USA), продемонстрировали низкую блокирующую активность на проводимость реконструированных пориновых каналов. 7. На основе полученных результатов сделаны выводы о необходимости изменения компьютерной модели для поиска эффективных блокаторов и необходимости перехода от докинга «плоских» двухмерных молекул в молекулу hVDAC1, к поиску 3-х мерных пептидов, способных обеспечивать лучшее сродство и большую селективность связывания. 8. Доклинические исследования с использованием клеток рака молочной железы MCF-7 и их VDAC-дефицитных производных показали, что удаление любой из изоформ митохондриальных поринов сопровождается снижением опухолеобразующей способности имплантированных клеток рака молочной железы MCF-7 и ее VDAC-дефицитных производных. Опухолеобразующая активность всех типов клеток MCF-7, уменьшалась в следующем порядке: «дикий» тип MCF-7 WT>> VDAC3-/-> VDAC2-/->>> VDAC1-/-. Несмотря на то, что VDAC1-/- клетки обладали наименьшей опухолеобразующей способностью, эти клетки также обладали наименьшим метастатическим и токсическим действием на внутренние органы (легкие, печень и селезенку) животных. Наиболее активное метастазирование и токсичность была обнаружена у мышей, в которых были имплантированы клетки MCF-7 VDAC2-/-. 9. Были определены и использованы оптимальные условия инокуляции клеток и создания ортотопических опухолей в жировой ткани молочной железы «голых» мышей BALB/c NUDE. Полученные морфологические данные по состоянию жировой и окружающих тканей, состояние легких, печени и селезенки демонстрируют успешное создание опухолей и метастазирование в близлежащие ткани, в легкие, печень и селезенку. 10. Созданы и отработаны рабочие протоколы оптимизации оценки состояния имплантированных опухолей (размер и плотность опухоли, васкуляризации) и подобраны экспериментальные условия (эстрогеновая подготовка, количество имплантируемых клеток, объем инокулята, локализация инъекции) для успешного приживления клеточных суспензий, с учетом необходимости дополнительной эстрогенной терапии. Были идентифицированы условия создания опухолей (количество клеток и объем вводимого инокулята в единичной инъекции, оптимизированы концентрации и протокол использования эстрогена и смеси белков) для успешного получения ортотопических опухолей в животной модели «голых» мышей BALB/c NUDE, «дикими» и VDAC-дефицитными клетками MCF-7.