Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект “SERS как метод для in vivo мониторинга лекарственных препаратов и их эффектов” направлен на разработку системы мониторинга лекарственных препаратов in vivo в режиме реального времени на основе метода поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (англ. surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS). Необходимость разработки такого подхода обусловлена большой индивидуальной вариативностью метаболизма лекарств и реакций раковых опухолей на химиотерапевтические препараты. Первый этап работы требует разработки подложек SERS, которые имеют потенциал для in vivo применений. Поэтому были определены требования к SERS подложкам, которые включали высокую чувствительность, равномерность усиления сигнала, использование биосовместимых материалов в качестве основы и механическая и химическая стабильность. В литературе имеется очень ограниченное количество подложек, удовлетворяющих этим требованиям. В связи с этим было реализовано шесть протоколов изготовления подложек совместно с коллегами из Германии, Литвы, Франции: 1. g-C3N4, функционализированный полимерными “коврами” с интегрированными наночастицами. С помощью этого подхода была получена чувствительность вплоть до 10ˆ-9 М для родамина 6G, что соответствует фактору усиления 2,4х10ˆ7. Работа опубликована в ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 9797−9805 (Q1, IF 8,456). 2. Фотонный кристалл. Реализована SERS подложка на поверхности градиентного фотонного кристалла, что позволило реализовать различные условия усиления в разных позициях подложки. Такой подход также привел к увеличению чувствительности подложки примерно в 9 000 раз. Работа опубликована в Sensors & Actuators: B. Chemical 311 (2020) 127837 (Q1, IF 6,393). 3. Электрохимическое осаждение наночастиц на поверхность кардиологических стентов. Зафиксировано усиление сигнала за счет эффекта SERS. 4. Трехмерные структуры, изготовленные методом двухфотонной полимеризации. Получено два пика плазмонного резонанса, соответствующие формированию плазмонных наночастиц и их агрегатов. 5. Функционализация диазониевыми солями. Эксперименты показали значительное усиление поглощения в области плазмонного резонанса. Однако, ширина пика составляла 80-150 нм, что говорит о неоднородной агрегации частиц на поверхности, что также подтверждается данными SEM. Как известно, это ограничивает воспроизводимость сигнала в SERS. Результаты были представлены на 14 международном форуме стратегических технологий "IFOST 2019", Томск, 14-17 октября 2019 г. 6. Получение подложек методом Френца с последующей лазерной обработкой. За счет свой электропроводности, подложка показала свою перспективность для применений в качестве как SERS подложки, так и электрохимического электрода. Такая комбинация подходов может позволить одновременно использовать два аналитических подхода и таким образом разрешить важнейшее ограничение подхода SERS - получение количественных данных. Предварительные результаты были представлены на приглашенных семинарах в INP Greifswald и TU Chemnitz (Германия). Одним из важнейших вопросов при выполнении экспериментов в биологических матриксах является увеличение чувствительности и селективности детектирования за счет функционализации поверхности. Один из простых в реализации подходов основан на последовательной функционализации поверхности наночастиц гидрофильными и гидрофобными тиолами для захвата малых гидрофильных молекул. Тем не менее, в литературе не представлено пространственно-разрешенных исследований таких иерархических поверхностей, хотя именно распределение молекул по поверхности определяет их уникальные свойства. Это связано с ограничениями химических методов анализа, которые не позволяют получить достаточное пространственное разрешение. В связи с этим был разработан подход для анализа гетерогенных (гидрофильных/гидрофобных) областей функционализированной поверхности для обеспечения чувствительности и селективности SERS подложки к молекулам лекарственных препаратов, который планируется развить при дальнейшем выполнении проекта. Для выполнения модельных экспериментов проведены все предварительные работы, включая анализ SERS подложек различными методами, определение их параметров с использованием модельных молекул, тестовые SERS эксперименты. Также, определены ключевые параметры (концентрация и время экспозиции) применения третбутилгидропероксида* (TBHP) для индуцирования гибели клеток. Подготовлен русскоязычный текст литературного обзора по теме “Возможности SERS при различных типовых патологических процессах” на основе 198 литературных источников. Развитие SERS имплантов для ключевых применений позволит лучше понять индивидуальные особенности организма и сделать шаг к персонализированной медицине за счет мониторинга биомолекул в организме в режиме реального времени. Использование имплантов позволит зафиксировать наночастицы для оптической фокусировки при мониторинге процессов в течение нескольких дней. Уже на этом раннем этапе развития технологии возможно определить ряд задач, где такой подход мог бы привести к прорыву как в качестве здравоохранения, так и в понимании индивидуальных реакций. *ТВНР - аналог перекиси водорода, активирующего внутриклеточное свободнорадикальное окисление.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Второй этап проекта “SERS как метод для in vivo мониторинга лекарственных препаратов и их эффектов” направлен на разработку системы мониторинга лекарственных препаратов in vivo в режиме реального времени на основе метода поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (англ. surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS). Необходимость разработки такого подхода обусловлена большой индивидуальной вариативностью метаболизма лекарств и реакций раковых опухолей на химиотерапевтические препараты. На этом этапе было запланировано завершение модельных экспериментов по детектированию лекарственных препаратов и их эффектов и определению механизма гибели раковых клеток методом SERS. Для этого использовались подложки, изготовленные методом Франца, которые представляют собой полиуретан с интегрированным золотыми наноструктурами. Данные подложки являются проводящими, что позволяет реализовать метод электрохимического детектирования параллельно с оптическими подходами. С использованием этих подложек были реализованы запланированные в проекте модельные эксперименты. При этом получены следующие пределы обнаружения: 1Е-6 М для венлафаксина и О-дезметилвенлафаксина, 1Е-3 М для адреналина. К сожалению, данные пределы обнаружения существенно выше, чем концентрации, которые необходимо детектировать в in vivo применениях. Вторым подходом, реализуемым в проекте, была методика определения механизма гибели клеток (некроза или апоптоза), что важно для отслеживания реакция опухоли на лекарственные препарат. По результатам проведения ряда экспериментов, спектральный отклик клеток оказался невоспроизводим. В связи с этим, было признано, что обе концепции не перспективны для реализации in vivo, так как в этом случае добавятся дополнительные сложности измерения, такие как паразитные сигналы, неспецифичная адсорбция белков на поверхности и низкая эффективность оптической схемы сбора сигнала. В связи с этим был предложен принципиально другой принцип детектирования с использованием SERS меток как более перспективный для in vivo применений, а именно, функционализация поверхности молекулами, спектр которых зависит от детектируемого параметра (в данном случае, рН среды). В результате была реализована следующая концепция SERS подложки: сама подложка представляет собой композитную структуру на основе полиэтилентерефталата (ПЭТ) и серебряных наночастиц, обработанных лазерным излучением для их фиксации на поверхности полимера, затем электрохимически дополнительно осаждались серебряные плазмонные частицы. Серебро было функционализированно 4-нитробензолтиолом (4-NBT) в качестве SERS метки. Данная молекула была выбрана потому, что на поверхности серебра и при лазерном облучении она постепенно восстанавливается до аминобензолтиола (4-ABT), что выражается в появлении NH2 моды в спектрах, и затем димеризуется в 4,4’-димеркаптоазобензол (DMAB), что выражается в появлении N=N моды на 1437 см-1. На скорость этого процесса влияет рН среды и концентрация активных кислородных радикалов. Был поставлен модельный эксперимент, в котором спектр 4-NBT детектировался в питательных средах, в которых культивировались клетки рака молочной железы, собранные на разных сроках культивации (вплоть до 12го дня). Было показано, что рамановские спектры действительно зависят от свойств среды, был предложен механизм, объясняющая влияние рН среды на SERS спектр за счет влияния концентрации ионов водорода на скорость фотокаталитической реакции димеризации 4-ABT. Более того, была изучена структура такой подложки, описан механизм ее формирования, показано, что такая подложка обладает высокой стабильностью (как механической, так и стабильностью в биологической среде), подтвержден ее бактерицидный эффект. При использовании данного подхода, SERS сигнал детектируется с использованием портативного рамановского спектрометра через кожу, что позволяет говорить о перспективе данного принципа формирования SERS подложек для in vivo применений. Популярная статья о проекте: https://news.tpu.ru/news/2021/05/07/38310/