Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Инсульт головного мозга является одной из основных причин инвалидности и смертности населения в мире. Пациенты, выжившие после инсульта, подвержены риску инвалидности и имеют высокую частоту рецидива. К факторам риска ишемического инсульта мозга, также относятся перенесенные транзиторные ишемические атаки, артериальная гипертензия, мерцательная аритмия, нарушения липидного обмена, сахарный диабет. Несомненно, превентивная терапия, направленная на предупреждение ишемического инсульта у пациентов из группы риска позволит предотвратить сосудистую катастрофу головного мозга, или улучшить исход заболевания. Целью заявленного проекта является разработка метода превентивной генной терапии, направленной на повышение жизнеспособности нейронов при угрозе наступления ишемического инсульта, и как следствие, оказывающие нейропротекторное действие в области «ишемической полутени» в период 3‒6 часового «терапевтического окна». В настоящей работе аденовирусные векторы, несущие гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM), были доставлены в головной мозг непосредственно (прямая генная терапия), или на клеточных носителях — мононуклеарных клетках крови пуповины человека (клеточно-опосредованная генная терапия) — путем интратекальной инъекции до моделирования ишемического инсульта головного мозга у крыс. Для превентивной прямой и клеточно-опосредованной генной терапии были наработаны рекомбинантные репликативно-дефектные вирусные векторы на основе аденовируса человека пятого серотипа (Ad5), несущих: (1) ген сосудистого эндотелиального фактора роста (Ad5-VEGF); (2) ген глиального нейротрофического фактора (Ad5-GDNF); (3) ген нейрональной молекулы клеточной адгезии (Ad5-NCAM); (4) репортерный ген зеленого флюоресцирующего белка (Ad5-GFP). Полученные аденовирусные векторы были использованы для генетической модификации мононуклеарных клеток крови пуповины человека (МККП). В результате трансдукции МККП аденовирусными векторами были созданы следующие генно-клеточные конструкции: (1) МККП+Ad5-VEGF-GDNF-NCAM; (2) МККП+Ad5-GFP. Эффективность трансдукции МККП аденовирусным вектором Ad5-GFP была подтверждена через 72 часа после культивирования МККП+Ad5-GFP с помощью люминсцентной микроскопии. В цитоплазме МККП+Ad5-GFP выявлено специфическое зеленое свечение. Методом проточной цитометрии установлено, что процент GFP-позитивных МККП человека при MOI равном 10 достигает 29±5%. Оценка уровня мРНК трансгенов (VEGF165, GDNF и NCAM1) в культуре генетически модифицированных МККП человека была выполнена методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Показано достоверное увеличение синтеза в МККП+Ad5-VEGF-GDNF-NCAM мРНК трансгенов. В частности, содержание мРНК VEGF165 увеличилось в 141,8±8,24 раз, мРНК GDNF в 167,51±6,85 раз и мРНК NCAM1 в 122,9±13,5 раз по сравнением с контролем (нативные, нетрансдуцированные МККП). Превентивную прямую генную терапию проводили за 3 суток до моделирования ишемического инсульта. Выбранный временной промежуток обусловлен темпами трансдукции аденовирусным вектором клеток ЦНС после интратекальной инфузии. Подопытным крысам интратекально вводили 2×107 вирусных частиц Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в равном соотношении каждого вектора Ad5-VEGF (1/3), Ad5-GDNF (1/3), Ad5-NCAM (1/3) в 20 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl). Превентивную клеточно-опосредованную генную терапию проводили за 2 суток до моделирования ишемического инсульта. В данном случае начало превентивной генной терапии выбрано с учетом начала экспрессии трансгенов в МККП и их адресной миграцией в ЦНС после трансплантации. Животным интратекально вводили 2×106 генетически модифицированные МККП (МККП+Ad5-VEGF-GDNF-NCAM) в 20 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl). В зависимости от вводимого препарата экспериментальные животные были разделены на 5 групп: (1) NaCl группа — инфузия 0,9% NaCl (n=6); (2) Ad5-GFP группа — инфузия аденовирусного вектора, несущего репортерный ген GFP (n=7); (3) Ad5-VEGF-GDNF-NCAM группа — инфузия аденовирусных веторов, несущих терапевтические гены VEGF, GDNF и NCAM (n=6); (4) МККП+Ad5-GFP группа — инфузия МККП, трансдуцированных Ad5-GFP (n=6); (5) МККП+Ad-VEGF-GDNF-NCAM группа — инфузия МККП, трансдуцированных Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM (n=9). У крыс после превентивной прямой генной терапии инсульт моделировали через 3 суток, у крыс после превентивной клеточно-опосредованной генной терапии — через 2 суток. Ишемический инсульт головного мозга вызывали методом дистальной окклюзии средней мозговой артерии. Восстановление сенсомоторной функции у подопытных крыс после моделирования ишемического инсульта оценивали с помощью поведенческого теста «Липкая лента». Анализ полученных данных обнаружил симметричные ответы на левой и правой лапах во всех группах животных. Однако, значимых сдвигов у крыс из контрольных групп после моделирования инсульта, по сравнению с базовыми (тренировочными) значениями, не обнаружено на всех сроках исследования. Важно отметить, что в группе МККП+Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM через неделю после инсульта установлено угнетение сенсомоторной реакции, которое продолжалось до 21 суток. Принимая во внимание тот факт, что нейротрофические факторы сдерживают эксайтотоксический эффект глутамата в периинфарктной области, можно предположить, что угнетение сенсомоторной реакции может быть вызвано рекомбинантными молекулами VEGF, GDNF и NCAM и рассматриваться как положительный защитный механизм при ремоделировании мозга после ишемического повреждения. Через 21 сутки после моделирования инсульта подопытных животных наркотизировали, забирали образцы крови и спинномозговой жидкости. Головной мозг выделяли из черепной коробки и фиксировали в 4% растворе параформальдегида. Макроскопическое исследование головного мозга подопытных крыс обнаружило стандартную локализацию очага инфаркта в теменной доле головного мозга, что соответствует месту окклюзии средней мозговой артерии. Морфометрический анализ объема инфаркта выявил статистически значимые различия между терапевтическими и контрольными группами. Больший объем инфаркта мозга у крыс из контрольных групп свидетельствует о положительном действии превентивной генной терапии на сохранность ткани мозга при наступлении инсульта. Молекулярные и клеточные сдвиги в головном мозге через 21 сутки после моделирования инсульта на фоне прямой и клеточно-опосредованной превентивной генной терапии изучали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Астроциты маркировали антителами против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), олигодендроциты — антителами против транскрипционного фактора олигодендроцитов 2 (Olig2). Клетки микроглии выявляли при помощи антител к белку Iba1. Белки теплового шока и проапоптозные белки определяли с помощью антител против Hsp70 и Caspase3, соответственно. Иммуноэкспрессию маркеров синаптических контактов выявляли антителами против синаптофизина (Synaptophysin) и белка постсинаптической плотности 95 кДа (PSD95). Полученные результаты исследования о снижении экспрессии белков клеточного стресса (Hsp70) и уменьшении количества клеток, вступивших в апоптоз (Caspase3-позитивные клетки), позволяют заключить, что превентивная генная терапия способна сдерживать гибель нейронов в зоне ишемического поражения мозга. Кроме того, о преодолении негативных последствий ишемии в реабилитационном периоде свидетельствуют данные о восстановлении функциональной активности нейронов (усиление экспрессии синаптических белков ‒ синаптофизина и PSD95), поддержании миелинизации (увеличение количества олигодендроглиальных клеток) и препятствии развития астроглиоза (снижение количества астроцитов и клеток микроглии). Экспрессию репортерного гена зеленого флуоресцирующего белка в головном мозге крысы изучали после интратекальной инъекции Ad5-GFP. С помощью флуоресцентной микроскопии микропрепаратов головного мозга подопытных крыс через 3 недели после моделирования инсульта зеленый флуоресцирующий белок был выявлен в клетках мозга в области ишемического инфаркта. Продукцию терапевтических рекомбинантных молекул (VEGF, GDNF и NCAM) в трансплантированных генетически модифицированных МККП изучали с помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Через три недели после моделирования ишемического инсульта в левом полушарии в области ишемического инфаркта были выявлены МККП, продуцирующие рекомбинантные молекулы человека VEGF, GDNF и NCAM. Таким образом, после интратекальной инфузии интактным крысам аденовирусные векторы, несущие кДНК трансгенов, или генетически модифицированные МККП с помощью спинномозговой жидкости достигают головного мозга, где аденовирусные векторы трансдуцирует клетки мозга, а трансплантированные МККП мигрируют в ткань мозга. После моделирования этим животным ишемического инсульта рекомбинантные терапевтические молекулы, продуцируемые клетками мозга, или МККП, оказывают нейропротекторное действие на нейроны в области «ишемической полутени» (пенумбры) в период «терапевтического окна» и в последующие три недели реабилитационного периода. Мультиплексное профилирование выполнено в образцах крови и спинномозговой жидкости подопытных и интактных животных. В работе была использована коммерчески доступная панель Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 23-Plex Assay. Предварительный анализ в содержании эндогенных цитокинов, хемокинов и факторов роста в крови и спинномозговой жидкости у животных из контрольной группы NaCl не выявил значимых различий при сравнении с интактными крысами, что вероятно, указывает на прекращение воспалительной реакции на 21 сутки после моделирования инсульта. Интратекальная инъекция комбинации аденовирусных векторов, несущих кДНК, кодирующую VEGF, GDNF и NCAM, или генетически модифицированных клеток крови пуповины на 21 сутки эксперимента также достоверно не влияет на уровень цитокинов в образцах ликвора подопытных животных, при сравнении с интактными крысами. Анализ полученных данных свидетельствует о более эффективном влиянии превентивной клеточно-опосредованной генной терапии на ремоделирование мозга после ишемического инсульта. Таким образом, заявленные за отчетный период ожидаемые результаты получены.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящем исследовании впервые для лечения инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях испытан способ внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом (генетически модифицированный лейкоконцентрат [ГМЛ]). ГМЛ получают по нашей оригинальной методике на основе лейкоконцентрата (CD46-позитивных клеток), выделенного из периферической крови мини-свиньи, и комбинации трех аденовирусных векторов Аd5/35F, несущих по отдельности кДНК, кодирующую сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (NCAM). Для сдерживания гибели нейронов в «ишемической полутени» в период «терапевтического окна» внутривенную аутоинфузию ГМЛ проводят через 4 часа после моделирования ишемического инсульта головного мозга у мини-свиньи. Заявленный способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга в период «терапевтического окна» является оригинальным и ни в одной из лабораторий мира экспериментально не проверяется. В соответствии с общим планом работ на период с 1 июля 2020 г. по 30 июня 2021 г. были выполнены следующие конкретные работы и достигнуты соответствующие результаты: I. Наработка в препаративных количествах генетических векторов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5 серотипа (Ad5) с модифицированными фиберами (Ad5/35F), несущих кДНК, кодирующую VEGF165, GDNF, NCAM1. 1. В ходе работ были получены опытные образцы рекомбинантных репликативно-дефектных вирусных векторов на базе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5) с фибером аденовируса 35 серотипа (Ad5/F35): 1) кодирующих сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) – в объеме 25,0 мл; 2) кодирующих ген глиального нейротрофического фактора (GDNF) – в объеме 23,7 мл; 3) кодирующих ген нейрональной молекулы адгезии (NCAM) – в объеме 29,1 мл. Спектрофотометрическим методом установлено, что количество частиц рекомбинантных векторов в препаратах опытных образцов составляло: для опытного образца Ad5/F35-VEGF – 1,8 ОЕ, для опытного образца Ad5/F35-GDNF – 2,1 ОЕ, для опытного образца Ad5/F35- NCAM – 2,5 ОЕ. Специфическая активность опытного образца Ad5/F35-VEGF составляла 2,1×109 БОЕ/мл, для опытного образца Ad5/F35-GDNF составляла 3,0×109 БОЕ/мл, опытного образца Ad5-NCAM – 1,5×1010 БОЕ/мл. II. Получение генетически модифицированного лейкоконцентрата и молекулярный анализ экспрессии терапевтических генов in vitro 1. Генетически модифицированный лейкоконцентрат получали на основе лейкоконцентрата, выделенного из периферической крови мини-свиней и аденовирусных векторов (Ad5/F35-VEGF165 + Ad5/F35-GDNF + Ad5/F35-NCAM1). Процедура получения ГМЛ включала следующие этапы: а) Под глубоким наркозом в асептических условиях из подключичной вены животного забирали 50 мл крови в стерильные закрытые контейнеры (гемакон) объёмом 250 мл с антикоагулянтом СРDА-1 (Green Cross, Корея) (объем консерванта в каждом пакете 35 мл). б) В пакет с цельной кровью и консервантом добавляли 6% раствор гидроксиэтилкрахмала (Стабизол ГЭК 6%, Берлин-Хеми АГ, Германия) в соотношении 1:1. Затем пакет переворачивали вверх дном и центрифугировали при 350 rpm на центрифуге Рresvac (DP-2065 R PLUS) 10 минут при 10°С. Эритроциты удаляли с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 (ООО "Лидкор", Екатеринбург). в) После удаления эритроцитов пакет с портами ориентированными вверх снова центрифугировали при 350 rpm на центрифуге Рresvac 10 минут при 10°С. Надосадочную жидкость, содержащую лейкоциты, плазму и стабизол из пакета экстрагировали в новый контейнер «Компласт-300». г) В контейнер с надосадочной жидкостью добавляли физиологический раствор в соотношении 1:9 и «Компласт» с портами ориентированными вверх центрифугировали при 1300 rpm на центрифуге Рresvac 10 минут при 10°С. Полученную надосадочную жидкость (физиологический раствор, содержащий стабизол) из контейнера для крови экстрагировали таким образом, чтобы в контейнере осталось 30 мл физиологического раствора, содержащего клеточную суспензию (лейкоконцентрат). д) В контейнер для крови, содержащий лейкоконцентрат, через порт с помощью стерильного шприца вводили объем аденовирусных векторов (Ad5/35F), несущих терапевтические гены vegf, gdnf, ncam, в физиологическом растворе, необходимый для достижения параметра MOI (multiplicity of infection — множественность инфицирования) равного 10 (MOI=10).Трансдукцию лейкоконцентрата проводили в течение 12 часов при постоянном покачивании на шейкере (ELMI) при комнатной температуре (21-22°С). е) Через 12 часов в контейнер для крови, содержащий генетически модифицированный лейкоконцентрат (ГМЛ), добавляли 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 rpm и температуре 10°С в течение 10 минут с помощью центрифуги Рresvac. Надосадочную жидкость (физиологический раствор, содержащий фрагменты клеток и свободные вирусные частицы) из контейнера экстрагировали таким образом, чтобы в контейнере оставалось приблизительно 30 мл физиологического раствора, включающего клеточную суспензию — генетически модифицированный лейкоконцентрат (ГМЛ). 2. Анализ уровня мРНК трансгенов в генетически модифицированных лейкоцитах методом ПЦР-РВ. Установлено, что уровень содержания мРНК генов-мишеней при одновременной трансдукции тремя аденовирусными векторами (MOI=10) был в 1,4 раз выше для vegf165, в 8,6 ‒ для gdnf и в 3,6 ‒ для ncam1, по сравнению с уровнем мРНК генов-мишеней в нативных лейкоцитах. III. Установление эффективности генной терапии ишемического инсульта с помощью аутологичного генетически модифицированного лейкоконцентрата В исследовании были использованы самки мини-свиней (вьетнамская вислобрюхая) весом 20‒25 кг. Протокол эксперимента, включающий анестезию, хирургические вмешательства, послеоперационный уход и эвтаназию на конечных точках эксперимента, был одобрен Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (№5 от 26 мая 2020 года). В соответствии с заявленным планом настоящее исследование включало три экспериментальные группы животных: 1) мини-свиньи после моделирования ишемического инсульта головного мозга подвергались внутривенной аутоинфузии лейкоконцентрата, трансдуцированного Ad5/F35-VEGF165 + Ad5/F35-GDNF + Ad5/F35-NCAM1 (n=3); 2) мини-свиньи после моделирования ишемического инсульта головного мозга подвергались инфузии физиологического раствора (n=3); 3) интактные мини-свиньи. 1. Оценка терапевтической эффективности клеточно-опосредованной генной терапии инсульта с помощью оценки неврологического статуса и поведенческих тестов. а) Анализ неврологического статуса у животных после моделирования инсульта головного мозга обнаружил, что в обеих группах экспериментальных животных на 3 и 7 сутки после операции отмечалось снижение болевой чувствительности, более выраженной в проксимальных отделах передних конечностей, чем в задних. Незначительное восстановление болевой чувствительности было отмечено у мини-свиней из контрольной и опытной групп на 14‒21 сутки после моделирования ишемического инсульта головного мозга. Пониженные тонус и сила скелетных мышц были выявлены на 3 и 7 сутки постоперационного периода во всех конечностях в обеих экспериментальных группах. При этом более выраженные изменения были отмечены на правой стороне (противоположной стороне окклюзии средней мозговой артерии). На 14‒21 сутки у мини-свиней из контрольной и опытной групп наблюдали признаки восстановления тонуса и силы скелетных мышц конечностей. б) Двигательную активность мини-свиней оценивали с помощью теста «Открытое поле». На 3 сутки после моделирования инсульта головного мозга горизонтальная активность контрольных и опытных мини-свиней была снижена при сравнении с данными, полученными от этих животных до операции. Через 7 суток у контрольных животных горизонтальная активность продолжала снижаться, а у опытных животных ‒ стала увеличиваться. К 21 суткам значения у мини-свиней из опытной группы не отличались от интактных значений и были в два раза выше, чем у контрольных животных. 2. Морфометрический анализ инфаркта головного мозга. Морфометрический анализ относительного объема инфаркта мозга выявил различия между контрольной и опытной группами. Объем инфаркта головного мозга в опытной группе был меньше по сравнению с контрольной группой. Таким образом, больший объем инфаркта мозга у мини-свиней из контрольной группы свидетельствует о положительном действии клеточно-опосредованной генной терапии с помощью аутологичного ГМЛ на сохранность ткани мозга при моделировании ишемического инсульта головного мозга. 3. Иммунофлуоресцентный анализ периинфарктной области мозга с помощью антител к специфическим маркерам нервных клеток (PSD95, Synaptophysin), астроцитов (GFAP), олигодендроцитов (Olig2), клеток микроглии (Iba1) и маркеров стресса (Hsp70) и апоптоза (Caspase3). Анализ относительной Hsp70-иммунопозитивной площади в периинфактной области выявил различную реакцию клеток мозга у экспериментальных животных. Уровень иммуноэкспрессии Hsp70 у животных из опытной группы был выше, чем у интактных и контрольных мини-свиней. Появление в клетках активной формы про-апоптозного белка Caspase3 свидетельствует о необратимой гибели клетки. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии Caspase3 в зоне ишемического инсульта головного мозга экспериментальных мини-свиней обнаружил, что в опытной группе количество Caspase3-позитивных клеток было меньше, чем в контрольной группе. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток нейроглии с помощью специфических маркеров обнаружило различную реакцию GFAP-позитивных астроцитов, Olig2-позитивных олигодендроцитов и Iba1-позитивных клеток микроглии в периинфарктной области мозга экспериментальных мини-свиней. У животных интактной группы GFAP-иммунопозитивная площадь была значительно больше, чем в контрольной группе (p <0.05). В опытной группе площадь, занимаемая астроцитами, была также меньше при сравнении с интактной группой, но больше, чем у контрольных животных. Количество Olig2-позитивных клеток было снижено в контрольной и опытной группе, относительно интактной группы. В интактной группе иммунопозитивная площадь, выявляемая при помощи маркера Iba1, была больше, чем в контрольной группе. Иммуноэкспрессия Iba1 в опытной группе была в два раза ниже при сравнении с интактной группой (p <0.05). Анализ иммунофлуоресцентного окрашивания периинфарктной области мозга антителами против синаптических белков позволил установить, что относительная синаптофизин-иммунопозитивная площадь, была значительно снижена в контрольной группе при сравнении с интактной группой 9,8 (8,7‒10,5) (p <0.05). Иммуноэкспрессия синаптофизина в опытной группе была меньше, чем в интактной, но больше, чем в контрольной группе. PSD95-иммунопозитивная площадь у интактных мини-свиней была больше, чем у экспериментальных животных. Однако уровень экспрессии PSD95 у мини-свиней из опытной группы был выше, чем у контрольных животных. Полученные нами данные о восстановлении двигательной активности, объеме инфаркта мозга и иммуноэкспрессии маркеров клеточного стресса и апоптоза, синаптических белков и клеток нейроглии свидетельствуют о положительном влиянии клеточно-опосредованной генной терапии с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, на ремоделирование мозга после ишемического инсульта у мини-свиней. Таким образом, заявленные за отчетный период ожидаемые результаты получены.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В настоящем исследовании впервые разработан и испытан способ превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом. Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный рекомбинантным генетическим материалом, получают по нашей оригинальной методике на основе лейкоконцентрата, выделенного из периферической крови мини-свиньи, и комбинации трех аденовирусных векторов Аd5/35F, несущих по отдельности кДНК, кодирующую сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (NCAM). Превентивную генную терапию терапии проводят при угрозе ишемического инсульта для повышения жизнеспособности нейронов головного мозга. В соответствии с общим планом работ на период с 1 июля 2021 г. по 30 июня 2022 г. были выполнены следующие конкретные работы и достигнуты соответствующие результаты: I. Наработка генетических векторов В ходе выполнения работ согласно договору на базе Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи (г. Москва) были наработаны в препаративных количествах рекомбинантные репликативно-дефектные химерные вирусные вектора на базе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5) с фибером аденовируса 35 серотипа (Ad5/F35): Ad5/F35-VEGF165; Ad5/F35-GDNF; Ad5/F35-NCAM1. II. Получение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом. Генетически модифицированный лейкоконцентрат получали на основе лейкоконцентрата, выделенного из периферической крови мини-свиней и химерных аденовирусных векторов (Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF, Ad5/F35-NCAM1), согласно разработанному нами оригинальному методу в контейнере для крови без манипуляций in vitro и использования биопродуктов животного происхождения и антибиотиков. Протокол получения обогащенного генетическим материалом аутологичного лейкоконцентрата включал следующие этапы: 1. У мини-свиньи из подключичной вены под глубоким наркозом в асептических условиях забирали 50 мл крови в стерильные закрытые контейнеры. 2. Лейкоконцентрат получали путем удаления эритроцитов с помощью 6% раствора гидроксиэтилкрахмала и центрифугирования. 3. Трансдукцию лейкоконцентрата проводили одновременно тремя аденовирусными векторами в равном соотношении каждого вектора Ad5/35F-VEGF165 (1/3) + Ad5/35F GDNF (1/3) + Ad5/35F-NCAM1 (1/3) в контейнере для компонентов крови в течение 12 часов. III. Превентивная генная терапия ишемического инсульта головного мозга. 1. Мини-свиньям из опытной группы (n=3) за двое суток до моделирования ишемического инсульта головного мозга внутривенно вводили 30 мл аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантным генетическим материалом. 2. Через двое суток после инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, у животных моделировали ишемический инсульт по разработанной оригинальной методике. На первом этапе для уменьшения кровотока в вилизиевом круге перевязывали правую сонную артерию. На втором этапе через трепанационное отверстие в левой височной кости прижигали дистальные ветви средней мозговой артерии. 3. Исследование включало три группы животных: 1) опытные мини-свиньи после моделирования ишемического инсульта головного мозга подвергались внутривенной аутоинфузии генетически модифицированного лейкоконцентрата (n=3); 2) контрольные мини-свиньи — инфузии физиологического раствора (n=3); 3) интактные мини-свиньи (n=3). IV. Установление эффективности превентивной генной терапии ишемического инсульта. Анализ данных о восстановлении двигательной активности подопытных животных после моделирования ишемического инсульта головного мозга свидетельствует о более раннем восстановлении изученных параметров у мини-свиней на фоне превентивной генной терапии. Через 3 недели после у контрольных мини-свиней объем инфаркта был в три раза больше, чем у опытных животных. Анализ данных иммунофлуоресцентного окрашивания периинфарктной области головного мозга опытных мини-свиней на фоне превентивной генной терапии, в отличие от контрольных животных обнаружил: (1) меньший уровень экспрессии Hsp70 и меньшее количество клеток, вступивших в апоптоз, что свидетельствует о сдерживании гибели клеток мозга в периинфарктной области; (2) восстановление функциональной активности нейронов согласно уровню экспрессии белков синаптических контактов; (3) сдерживание организации глиального рубца; (4) большее количество миелинобразующих олигодедроглиальных клеток. V. Сравнительный анализ эффективности превентивной генной терапии и генной терапии после моделирования инсульта. На 21-е сутки у подопытных животных на фоне превентивной генной терапии и генной терапии в острую фазу выявлено лучшее восстановление двигательной активности, по сравнению с контрольными мини-свиньями. Объем инфаркта у мини-свиней на фоне генной терапии в острую фазу был меньше, чем в контрольной группе. При этом в группе на фоне превентивной генной терапии объем инфаркта был вдвое меньше, по сравнению с контрольными животными. В периинфарктной области количество каспаза-3-позитивных клеток в контрольной группе было больше, чем в обеих терапевтических группах. Hsp70-иммунопозитивная относительная площадь не отличалась в интактной и во всех экспериментальных группах. Синаптофизин-иммунопозитивная площадь в контрольной группе была меньше, чем в интактной группе. Тогда, как в обеих терапевтических группах экспрессия синаптофизина не отличалась от интактной группы. PSD95-иммунопозитивная площадь была меньше в контрольной группе и не различалась в терапевтических группах, при сравнении с интактной группой. Анализ GFAP-позитивных астроцитов выявил увеличение GFAP-иммунопозитивной площади в контрольной группе по сравнению с интактной группой. При этом в обеих терапевтических группах GFAP-иммунопозитивная площадь не отличалась от интактной группы. Количество миелинобразующих Olig2-позитивных клеток было снижено в контрольной группе и не отличалось в терапевтических группах от интактных значений. Анализ Iba1-положительных клеток микроглии показал увеличение Iba1-иммуноположительной площади во всех экспериментальных группах относительно интактной группы. Однако площадь, занятая активированной микроглией, была меньше в терапевтических группах, чем в контрольной группе. Полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии, как превентивной генной терапии, так и генной терапии в острую фазу ишемического инсульта с помощью аутологичного лейкоконцетрата, обогащенного терапевтическими генами, на поведенческие тесты, сохранность ткани головного мозга и молекулярные и клеточные изменения в периинфарктной области. Таким образом, заявленные за отчетный период ожидаемые результаты получены.