Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. С использованием стандартных методов биохимии, молекулярной и клеточной биологии синтезированы полноразмерные рекомбинантные белки аррестин и рековерин. На данный момент готовы бактериальные штаммы, трансформированные плазмидами, кодирующими следующие белки: Transducin полноразмерный; Rhodopsinkinase полноразмерный; Phosphodiesterase-6 фрагмент aa111-190; Phoshodiesterase-6 фрагмент аа656-860; Guanylatecyclase фрагмент аа521-630. Поликлональные антитела к полноразмерным аррестину и рековерину наработаны стандартными методами путём иммунизации кроликов с последующим выделением антител аффинной хроматографией. 2. Получены микрочипы на мембране из регенерированной целлюлозы с антителами к аррестину и рековерину по разработанной нами ранее технологии, которые были успешно использованы для определения наилучших пар антител и оптимальных условий проведения анализа. Микрочипы с антителами к другим антигенам готовы к использованию и в настоящее время хранятся в 50% глицерине при температуре -70 С. 3. Полученные и приобретённые к аррестину и рековерину моно- и поликлональные. антитела были: 1) иммобилизованы на микрочипах; 2) иммобилизованы на магнитных частицах; 3) биотинилированы. Затем эти антитела были проверены для детекции соответствующих антигенов во всех возможных комбинациях. Кроме того, в каждом случае иммуноанализ проводился в 2-х вариантах. А именно, эксперименты включали следующую последовательность операций: 1) связывание на микрочипе антигена из раствора с концентрацией 1 мкг/мл с последующей стандартной отмывкой; 2а) детекция сигнала магнитными частицами, покрытыми антителами, методом “push-pull”, или 2б) связывание на микрочипе биотинилированных антител с последующей отмывкой и детекцией сигнала магнитными частицами, покрытыми стрептавидином; 3) получение изображения микрочипа, декорированного магнитными частицами, и количественная оценка значения сигнала – поверхностной плотности связанных магнитных частиц в пятне. Показано, что применение детектирующих антител, иммобилизованных на магнитных частицах, приводит к существенно (в 1.5-2 раза) более высоким значениям сигнала, чем в случае биотинилированных антител и покрытых стрептавидином магнитных частиц. Таким образом, продемонстрирована возможность и установлены оптимальные параметры иммунодетекции на микрочипах двух раково-сетчаточных антигенов, аррестина и рековерина. А именно, для аррестина: моноклональное антитело в качестве связывающего и поликлональное, иммобилизованное на магнитных частицах, - в качестве детектирующего; для рековерина: поликлональное антитело в качестве и связывающего, и детектирующего, иммобилизованного на магнитных частицах. 4-5. Разработаны принципиально новые методы иммунохимического анализа, обладающие высокими аналитическими характеристиками, а именно, иммуноблоттинг с магнитными метками. В качестве модельной системы для разработки метода использован интерлейкин IL-1β. Его определение имеет самостоятельную ценность, поскольку он считается информативным биомаркером воспаления в различных биологических образцах, таких как сыворотка или бронхоальвеолярный лаваж. Для детекции магнитными частицами в качестве прозрачной малоадгезивной подложки использовали мембрану из регенерированной целлюлозы вместо нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида, которые обычно применяются при иммуноблоттинге. Для связывания молекул белка поверхность фотохимически активировали азидофенильными группами. Этот подход не требует блокирования/деактивации поверхности субстрата после связывания аналита и обеспечивает более простой и быстрый протокол. Эффективность иммобилизации белка с использованием этого метода составляет ~ 300 нг/см2, что близко к образованию монослоя белка. В то же время неспецифическое связывание магнитных частиц незначительно. После нанесения образца на подложку и освещения ультрафиолетом, аналиты детектировали сканированием поверхности магнитными частицами, покрытыми антителами, в магнитном поле и ламинарном потоке. Этот метод обеспечивает ультравысокую чувствительность, так как позволяет «отметить» отдельные молекулы аналита на поверхности светящимися частицами, которые хорошо видны под микроскопом в тёмном поле. Показано, что при нанесении на мембрану чистого белка предел детектирования (LOD) составил 0,1 - 0,3 фг или менее 10000 молекул на 2-3 мм2 пятна. Высокая чувствительность в сочетании с простотой и быстротой эксперимента делают эту методику самостоятельным ценным аналитическим методом, если в образце нет веществ, которые могли бы помешать проведению анализа. Однако такие мешающие вещества могут присутствовать в реальных биологических образцах. Некоторые компоненты образца (не только белки, но и небольшие молекулы, такие как аммиак, амины и тиолы) могут препятствовать ковалентной иммобилизации аналита. Поэтому в процедуру анализа была введена дополнительная стадия электрофоретического разделения образца перед фотохимической иммобилизацией. Электрофорез проводили в зазоре между листами согнутой активированной мембраны без геля. ФИТЦ-БСА был использован в качестве модельной системы для изучения параметров и условий электрофореза. Однако при использовании нативной коммерческой диализной мембраны, имеющей неровности на поверхности, как было показано методом АСМ, подвижность белка во время электрофореза изменялась невоспроизводимым образом. Поэтому поверхность мембраны была сглажена путём нанесения «лакированного» целлюлозного слоя, что значительно улучшило воспроизводимость. Толщина зазора была оценена двумя независимыми методами: на основе количества белка, которое может вместить зазор, и проводимости пары контактирующих мембран. Оба метода дают толщину зазора ~1 мкм. Показано, что наблюдаемая подвижность белков является чисто электрофоретической, электроосмотический поток не был обнаружен. Измеренное значение коэффициента диффузии ФИТЦ-БСА в зазоре между мембранами составило 5 × 10-7 см2/с, что практически совпадает со значением коэффициентом диффузии белка в растворе. Проведённый анализ образца выдыхаемого воздуха здорового человека с добавлением IL-1β, показал LOD 0,1-0,3 фг или <10000 молекул, как и для чистого белка.Таким образом, хотя электрофоретическое разделение образца не обеспечивает высокого разрешения и информации о молекулярной массе анализируемых белков, оно успешно отделяет аналит от избытка других веществ, которые могут мешать анализу. Калибровочные кривые также совпадают с таковыми для дот-блоттинга, подтверждая, что электрофорез не приводит к потере аналита. Динамический диапазон составляет около двух порядков. Изменяя диаметр петли, можно анализировать образцы разных объемов до 30 мкл. В пересчёте на концентрацию LOD составил 0,3 фг / 30 мкл = 10 фг/мл. Такая высокая чувствительность делает разработанную методику превосходящей большинство методов иммуноанализа, в том числе тирамид-амплифицированного ИФА, используемого во многих сверхчувствительных коммерческих наборах. Низкое значение LOD, достигаемое за короткое время анализа, свидетельствует о дополнительном эффекте электрофореза: он служит не только для отделения белков, но и для быстрого концентрирования аналита из образца в тонком зазоре. При связывании белков на поверхности, массообмен не является лимитирующей стадией, поскольку время диффузии через зазор ~ 1 мкм составляет менее одной секунды. Таким образом, в настоящем способе аналит быстро и почти количественно переносится из объёма образца на сравнительно небольшую площадь поверхности субстрата, тогда как массоперенос в обычных иммуноанализах является основным фактором, ограничивающим чувствительность и скорость анализа. Мы сравнили чувствительность обнаружения сигнала с помощью магнитных частиц по сравнению с флуоресцентной и хемилюминесцентной детекцией, которые обычно используются в иммуноблоттинге. Для этого вместо антител против IL-1 β, непосредственно связанных с магнитными частицами, мы использовали биотинилированные антитела. Для обнаружения биотиновой метки затем использовали частицы, покрытые стрептавидином. Никаких изменений LOD в анализе IL-1β при введении дополнительной стадии не наблюдалось. Если вместо магнитных частиц, покрытых стрептавидином, использовали флуоресцентное детектирование с помощью меченного Cy-5 стрептавидина, полученное значение LOD составляло 10 пг. Для хемилюминесцентного определения с помощью конъюгата стрептавидин-пероксидаза и люминола LOD составлял 1 пг. Мы также провели дот-блот-анализ IL-1β, следуя общепринятому протоколу на нитроцеллюлозной мембране, что привело к значению LOD 1 пг. Хотя лучшая чувствительность может быть достигнута при использовании некоторых коммерческих наборов для хемилюминесцентной детекции, настоящая технология более чувствительна, по крайней мере, на два порядка. Применение нового метода продемонстрировано на примере анализа образцов выдыхаемого воздуха, собранных от больных туберкулезом на нанофильтрах. Высокая чувствительность данного способа позволила обнаружить IL-1β в образце, полученном от больного туберкулезом, в количестве 0,5 фг, что выше чувствительности большинства известных способов иммуноанализа. Дополнительным преимуществом метода является возможность последовательной детекции нескольких аналитов на одной и той же мембране путём использования нескольких видов магнитных частиц с различной специфичностью связывания. Чтобы продемонстрировать это, мы использовали другой биомаркер, иммуноглобулин А, который присутствует в образцах выдыхаемого воздуха. Общий IgA был обнаружен в образцах как от больного туберкулезом, так и от здорового добровольца. Магнитные частицы затем полностью удаляли с мембраны при скорости потока 1 мл/мин. После сканирования мембраны частицами, специфичными к общему IgA, и удаления связанных частиц, был проведён анализ типа «far-western», который обнаружил молекулы, специфичные к антигену Mycobacterium tuberculosis Psts1, с использованием магнитных частиц, покрытых этим антигеном. Psts1-специфичные молекулы были обнаружены в образце от больного туберкулёзом и не были обнаружены в контроле. Это согласуется с нашими предыдущими данными, показывающими, что Psts1-специфический IgA в выдыхаемом воздухе может служить биомаркером туберкулеза. Преимущество настоящего метода заключается также в низком расходе антител, составляющем 3 нг на анализ. Для сравнения, типичный расход антител в Вестерн-блоте составляет 1 мкг. 6. Собрано 126 образцов сыворотки крови у 89 больных раком почки, причем у 37 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после нефрэктомии). Собрано 122 образца мочи у 85 больных раком почки, причем у 37 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после нефрэктомии). Собрано 87 образцов биопсии почки. 7. Собрано 35 образцов сыворотки крови у 30 больных раком мочевого пузыря, причём у 5 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после ТУР мочевого пузыря). Собрано 36 образцов мочи у 31 больных раком мочевого пузыря, причем у 5 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после ТУР мочевого пузыря). Собран 21 образец биопсии мочевого пузыря. 8. Собрано 89 образцов сыворотки крови у 56 больных раком простаты, причем у 33 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после простатэктомии). Собрано 75 образцов мочи у 45 больных раком простаты, причем у 30 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после простатэктомии). Кроме того, у контрольной группы здоровых добровольцев собрано 79 образцов сыворотки крови и 81 образец мочи. 9. По результатам работы за отчетный период опубликована 1 статья в высокорейтинговом журнале “Analytical Chemistry” (Q1, IF = 6.35), а также принята к печати 1 статья в индексируемом WoS журнале «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». Кроме того, приняты к публикации тезисы на 2 международные конференции, проведение которых планируется осенью 2020 года.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработан принципиально новый метод, позволяющий ускорить массоперенос в ультрачувствительном иммуноанализе с детекцией магнитными частицами. Метод заключается в применении микрочипов, изготовленных на мембране из регенерированной целлюлозы, с особым химически расщепляемым покрытием, которое формируется на этапе блокирования непрореагировавших активных групп на поверхности после ковалентной иммобилизации белка. Блокирование осуществляется с помощью амина с перфторнонаноильной группой, присоединенной через дисульфидный линкер. Применение этого метода детекции обеспечивает ультравысокую чувствительность анализа. Значения предела обнаружения для типичных белковых биомаркеров составляют 1 фМ при времени инкубации 1 ч. Это значение по порядку величины совпадает с таковым для ультрачувствительного иммуноанализа с электрофоретическим концентрированием. Новый метод позволяет избежать проблемы загрязнения оборудования потенциально опасными биологическими объектами. Дополнительным важным достоинством созданной технологии является снижение уровня фона в анализе. Неспецифически адсорбированные на фторированном покрытии микрочипа белки удаляются вместе с покрытием при химическом расщеплении дисульфидных связей, значительно снижая фоновый сигнал. В модельном иммунофлуоресцентном анализе показано 30-кратное увеличение отношения сигнал / фон по сравнению с контрольным микрочипом на стеклянной подложке, модифицированной эпоксидными группами. Получены рекомбинантные белки и наработаны поликлональные антитела к ним: полноразмерный трансдуцин (GNAT2), фьюжн из двух регуляторных доменов родопсинкиназы (GRK1), а также фрагмент фосфодиэстеразы-6 (PDE6A, аа111-190). Изготовлены однокомпонентные микрочипы с антителами к каждому из этих антигенов а также с ранее полученными антителами к аррестину и рековерину, протестированы пары антител в ультрачувствительном иммуноанализе и выбраны лучшие. Отработана мультиплексная тест-система для определения аутоантител к раково-сетчаточным антигенам. Для модельных аналитов - поликлональных антител - значения пределов обнаружения не превышали 100 фг/мл. Продемонстрирована высокая специфичность анализа. Показана невозможность детекции аутоантител с помощью этой тест-системы, связанная с физико-химическими особенностями ультрачувствительного иммуноанализа с детекцией магнитными частицами. С использованием выбранных пар антител отработана мультиплексная тест-система для анализа 4 раково-сетчаточных антигенов: аррестина, рековерина, родопсинкиназы и трансдуцина. Определены значения пределов обнаружения – не более 100 фг/мл для каждого из антигенов - и построены калибровочные кривые. Продемонстрирована высокая специфичность анализа (отсутствие ложно-положительных сигналов). Определено влияние компонентов сыворотки крови и тканевых лизатов на чувствительность и специфичность тест-систем. Повышение предела обнаружения при переходе от модельных образцов к образцам сыворотки и тканевых лизатов не превышало 1/2 порядка. Собраны образцы мочи и сыворотки от 50 больных РМП, 50 больных РПЖ, а также 15 больных ПКР. Меньшее по сравнению с запланированным число образцов, собранных у больных ПКР, объясняется существенным перевыполнением плана по этим образцам в предыдущий период: к настоящему моменту собраны образцы сыворотки и мочи от 141 больных ПКР, причем у 95 больных получено по 2 образца (за 1 день перед и через 7 дней после нефрэктомии). С помощью разработанной тест-системы проведено определение раково-сетчаточных антигенов в 101 образце от больных ПКР: 51 образец мочи и 50 образцов сыворотки крови. Кроме того, проанализировано 35 образцов, полученных от здоровых контролей (18 образцов мочи и 17 образцов сыворотки), 14 образцов мочи и 15 образцов сыворотки, полученных от больных РПЖ, и 8 образцов мочи от больных РМП и РПЖ. Для диагностики ПКР с помощью разработанной тест системы установлены значения чувствительности и специфичности. Самую высокую эффективность демонстрирует обнаружение аррестина и рековерина в моче: Аррестин: чувствительность - 90%, специфичность - 94%. Аррестин+рековерин: чувствительность - 96%, специфичность - 89%. В высокорейтинговых журналах, входящих в Q1, опубликовано 2 статьи, на двух конференциях представлены тезисы докладов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Осуществлено дальнейшее совершенствование методики ультрачувствительного иммуноанализа на микрочипах, применяемой для анализа образцов мочи. Во-первых, использованное ранее ручное нанесение растворов антител на подложку было заменено на электрораспыление через маску. Новая технология позволяет параллельно изготавливать 40-50 микрочипов с расходом антител около 3 нг на один анализ (расход антител сокращен втрое). Во-вторых, чтобы уменьшить большие вариации сигнала была разработано дополнительная процедура коррекции сигнала. Мы внесли полуэмпирическую поправку к расчету количества частиц на пятно N, (это значение использовалось в качестве сигнала на предыдущих этапах работы), делением его на среднее расстояние <L> от частицы до правой границы пятна. Использование N' вместо N в качестве значения сигнала анализа привело к снижению вариаций сигнала и увеличению динамического диапазона на два порядка. Таким образом, мы разработали способ, который может оценивать концентрации четырех антигенов в диапазоне 0,1–10 пг/мл с точностью 1/2 десятичного порядка. В дополнение к полученным ранее результатам было проанализировано 50 образцов мочи больных ПКР и 32 образца мочи контрольной группы. Несколько образцов ПКР пришлось исключить из дальнейшего анализа, так как для них гистологическое исследование не подтвердило диагноз ПКР. Общее количество образцов составило 89 для ПКР и 50 для контрольной группы. Расчетные значения AUC для родопсинкиназы и трансдуцина составили 0,65 (95% ДИ 0,55–0,76) и 0,64 (95% ДИ 0,54–0,75), соответственно. Оценки AUC для аррестина и рековерина составили 0,93 (95% ДИ 0,89–0,97) и 0,82 (95% ДИ 0,75–0,89) соответственно. При пороге 0,1 пг/мл аррестин продемонстрировал специфичность 94% и чувствительность 89%, а рековерин показал специфичность 96% и чувствительность 66%. Наилучшие результаты были достигнуты при комбинации аррестина с рековерином, когда тест считался положительным, если любой из этих биомаркеров превышал 0,1 пг/мл. В этом случае соответствующее значение AUC составило 0,96 (95% ДИ 0,93–0,99), при этом были достигнуты 96%-ная чувствительность и 92%-ная специфичность, что является одним из лучших показателей среди всех опубликованных биомаркеров ПКР в сыворотке и моче. Можно также отметить значительные положительные попарные корреляции между концентрациями различных антигенов в моче пациентов с ПКР. В работе было проанализировано 40 образцов мочи больных раком мочевого пузыря и 40 образцов больных рака предстательной железы на содержание в них двух раково-сетчаточных антигенов – аррестина и рековерина. В случае рака мочевого пузыря биомаркеры эффективнее работают совместно, чем по отдельности: значение AUC повышается с 0,63-0,67 до 0,76. В то же время предсказательная сила рековерина для диагностики рака предстательной железы близка к нулю (AUC = 0,54). Как следствие, эффективность его комбинации с аррестином почти не отличается от таковой для одного аррестина (AUC = 0,78 и 0,74, соответственно). Чувствительность комбинации аррестина и рековерина составляет около 60% как для РМП, так и для РПЖ (в обоих случаях по сравнению с данными из контрольной группы p < 0,001 в χ2-тесте). Для больных РПЖ, в моче которых детектированы аррестин и рековерин, характерен более высокий уровень ПСА, хотя различие не является статистически значимым (p > 0,05). Кроме того, можно заметить, что высокие уровни ПСА (> 10-15 нг/мл) также более характерны для положительных по аррестину или рековерину пациентов. Мы не нашли существенных различий между группами светлоклеточного, хромофобного и папиллярного ПКР, что позволяет предположить, что аберрантная экспрессия раково-сетчаточных антигенов является общей чертой различных опухолей. Стадия опухоли также не влияет на концентрации данных антигенов в моче больных ПКР. В группе ПКР мы отобрали 10 пациентов, у которых были обнаружены антигены, и проанализировали образцы мочи, собранные через семь дней после нефрэктомии. Во всех случаях содержание аррестина и рековерина в моче было ниже предела детектирования. Родопсинкиназа и трансдуцин были обнаружены в одном и двух образцах, соответственно, что согласуется с их относительно низкими значениями специфичности. Эти данные подтверждают, что данные антигены имеют опухолевое происхождение и при удалении опухоли исчезают вместе с ней. Кроме того, мы проанализировали по 10 образцов больных РМП и РПЖ, у которых тест до операции был положительным, на присутствие антигенов в моче, взятой через 7 дней после удаления опухоли. Как в случае РМП, так и в случае РПЖ, в 90% образцов ни одного из антигенов не было детектировано. Это согласуется с результатами, полученными для рака почки, и подтверждает опухолевое происхождение аррестина и рековерина, обнаруживаемых в моче. На заключительном этапе выполнения проекта была решена важнейшая из поставленных задач: разработан новый метод диагностики урологических онкозаболеваний путем определения следовых количеств раково-сетчаточных антигенов в моче. Наибольшей диагностической эффективностью обладает комбинация аррестина и рековерина. Использование более чувствительного, чем общепринятые, метода иммуноанализа для детекции ультранизких концентраций аррестина и рековерина в моче позволяет выявлять рак мочевого пузыря и рака предстательной железы с чувствительностью 58-60%, в то время как для рака почки она составляет 96%. Таким образом, положительный анализ на данные биомаркеры позволяет подозревать как рак почки, так и рак мочевого пузыря и предстательной железы. Это означает, что в случае положительного теста требуется дополнительное обследование для дифференциальной диагностики этих урологических онкозаболеваний. В то же время данные антигены могут рассматриваться как потенциальные прогностические биомаркеры при лечении и для оценки состояния больных.