Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. На первом этапе проводилась оптимизации работы системы двухфотонной полимеризации при использовании «стандартной» схемы изготовления трехмерных структур – перемещение лазерного луча с помощью гальваносканера, фокусируя его через микрообъектив. Благодаря установки системы активного охлаждения на акусто-оптический модулятор, выступающего в качестве оптического затвора, и перенастройке его режима работы на более высокие частоты (до 1МГц) удалось увеличить скорость перемещения лазерного луча гальваносканером до 50 000 мкм\секунду при работе с 10х объективом. Это позволяло проводить процесс отверждения фоточувствительных полимерных композиций с достаточно высокой производительностью, порядка 1мм3 за 20 минут на рабочих биосовместимых материалах при формировании рабочих структур. Это значение является очень хорошим показателем, по сравнению с результатами других исследований [2,3], где для формирования структур использовалось, в том числе, несколько пучков лазерного излучения. Тем не менее, существенным ограничением такого подхода, оставалась необходимость корректировки формируемой трехмерной модели под геометрические параметры вокселя, представляющего собой эллипсоид с характерным диаметром в плоскости XY ~2мкм, но сильно вытянутый в вертикальной оси (до 20мкм). Но уже на этом этапе получилось формировать структуры размером до 3х3х3мм за 5-7 часовой временной интервал, что позволило проводить отработку процесса формования трехмерных структур с различным дизайном. 2. В процессе выполнения работы, была разработана оптическая схема для осуществления SSFT. Исходно, в установке используется излучение второй гармоники фемтосекундного лазера ТЕМА-100 (Авеста проект, Россия) с длиной волны λ = 525 нм, длительностью импульса около 200фс, частотой генерации 80МГц. Для реализации процесса пространственно-временной фокусировки лазерного излучения необходимо пропустить излучение через две оптические схемы – стретчер (экспандеер), задачей которого является временное растягивание импульса по спектру (чирпированный импульс) и компрессор, который обеспечивает сжатие чирпированного импульса в фокусе микроскопического объектива, используемого для фокусировки. Были разработаны и рассчитаны оптические схемы стретчера и компрессора, в которых используется минимально возможное количество экономически доступных оптических и оптомеханических компонентов, что позволило вписаться в запланированный бюджет. Полученное на выходе из оптической системы лазерное излучение заводилось в основной оптический тракт установки лазерного микроструктурирования для проведения тестовых экспериментов. Параметры лазерногго излучения допускают использование объективов с малой числовой апертурой NA 0.1 - 0.2, обладающих большим рабочим полем с характерным размером 10мм, что позволяет формировать трехмерные структуры сантиметрового масштаба. 3. В процессе работы был разработан специальный алгоритм формирования трехмерных образцов, позволяющие проводить формирование не сплошных элементов, а имеющих внутреннюю микроструктуру микронного масштаба. Для этого, при заполнении структурных элементов, между отдельными проходами лазерного излучения устанавливался интервал, равный двойному диаметру вокселя в горизонтальной плоскости. Это позволило формировать не сплошной объем трехмерной структуры, а представляющий собой «сетчатую» внутреннюю структуру формируемых балочных элементов, которую удалось успешно очистить от неотверждённого материала при процессе отмывки сформированного образца. Был разработан и реализован подход, позволяющий получить рельеф с характерным размером в несколько микрон, формируемой на боковой поверхности структурных элементов скаффолдов. Основным преимуществом этого режима является возможность формировать его с необходимыми параметрами на необходимых частях трехмерных структур в процессе изготовления крупной трехмерной модели, формируя области с интенсивным, слабовыраженным или полностью отсутствующим микрорельефом. Этот результат является очень важным, поскольку позволяет задавать градиент в свойствах поверхности в различных участках формируемой крупной структуры. Такой подход позволяет реализовать процесс управляемого клеточного заселения скаффолда с различной скоростью по его объему, что позволяет формировать таким образом каналы, состоящие из областей с гладкими стенками, способствующие ограничению зарастания их клеточными культурами, сохраняя свою функцию транспорта веществ и удалению продуктов метаболитов. 4. На первом этапе исследований на модели тканевого сфероида (полистироловые шарики диаметром 150-250 мкм) был выполнен поиск оптимальных параметров для их переноса на принимающий субстрат методом прямого лазероиндуцированного переноса. В качестве гидрогелевого компонента биочернил, в которых находилась модель тканевого сфероида, был выбран раствор высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (ВМ ГК), не подвергавшейся стерилизации, поскольку этого не требовали условия модельного эксперимента. Известно, что оптимальным вязкостным диапазоном технологии LIFT для переноса биологических объектов (клеток, сфероидов) требуется вязкость гидрогелевого компонента биочернил около 150-250 мПа×сек. Экспериментальным путем, в процессе подготовки различных концентраций гидрогеля, было выяснено, что такой вязкости соответствует концентрация высокомолекулярной неавтоклавирванной ГК 4 мг/мл. С полученными гидрогелями были успешно проведены текстовые эксперименты по процессу лазерной печати клеточными сфероидами на сформированные методом двухфотонной полимеризации скаффолды, которые показали принципиальную возможность процесса успешного переноса сфероидов. В процессе работы были сформированы несколько тестовых образцов, которые подвергались дальнейшему исследованию при помощи сканирующей электронной микроскопии. Также, на полученных образцах отрабатывался новый метод растровой микроскопия с использованием нелинейно-оптического сигнала 3й гармоники.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За отчетный период получен был успешно выполнен обширный план научных исследований, направленных на разработку лазерных методов формирования тканеинженерных конструкций для задач регенеративной медицины, связанных с восстановлением поврежденных или утраченных фрагментов костных тканей. Проводимая работа была прежде всего направлена на решение двух основных задач, связанных с лазерными трехмерной печати, а также решения ряда комплексных междисциплинарных задач, направленных на разработку основ подхода к реализации полного цикла формирования биосовместимых и биорезорбируемых тканеинженерных конструкций на основе скаффолдов с клетками, пригодных для замещения костных дефектов. Важно отметить, что все полученные результаты, связанные с конкретной реализацией технологий лазерной печати, являются новыми и оригинальными, полученные результаты находятся на актуальном мировом уровне. Полученные результаты в целом соответствуют плану заявленных исследований, выполнение отдельных пунктов было скорректировано ввиду объективных причин, для достижения положительного результата. Основные полученные результаты за отчетный период: 1. Разработан подход с использованием технологии двухфотоной полимеризации, позволяющие формировать развитые трехмерные структуры с гетерогенным по объему дизайном. Задаваемая архитектоника с высокопористой системой позволяет формировать необходимое окружение для культивации клеток, включая области с повышенной и сниженной адгезией, а также систему микро- и макропор для обеспечения транспортной функции питательных веществ и метаболитов, а также способствовать васкуляризации сформированной тканеинженерной конструкции. 2. С использованием «классической» методики двухфотонной полимеризации, с учетом проведенной модернизации оборудования и оптимизации параметров изготовления, отработана технология формирования крупных трехмерных структур с характерными размерами до 5х5х5мм из биосовместимых и биорезорбируемых материалов на основе производных полилактида. Изготовлено несколько малых партий трехмерных структур, пригодных для заселения клеточными сфероидами и проведения модельных экспериментов на малых животных in vivo. Полученные скаффолды были охарактеризованы с помощью метода рентгеновской микротомографии, электронной микроскопии и ртутной порозиметрии. 3. Разработана оригинальная схема для реализации методики двухфотонной полимеризации с использованием принципа пространственно-временной фокусировки фемосекундного лазерного излучения. Разработана и собрана полнофукнциональная экспериментальная установка для проведения экспериментов по формированию крупных структур сантиметрового масштаба методом двухфотонной полимеризации. На разработанной установке была отработана методика формирования трехмерных структур сантиметрового размера с характерным разрешением 10мкм. 4. Разработана и собрана экспериментальная система лазерной печати с настраиваемой оптической системой, содержащей в себе элемент «Пи-шейпер», позволяющая задавать конфигурацию распределения энергии в лазерном пятне с профилем, отличным от Гауссова. С использованием разработанной системы и высокоскоростной видеосъемки были подобраны несколько режимов переноса клеточных сфероидов с использованием нестандартных конфигураций лазерного пятна. Проведена серия экспериментов, направленных на определение возможных режимов печати методом прямого лазерного переноса. В качестве наилучшего режима для переноса гелевых микрокапель со сфероидами был определен профиль лазерного пятна в виде двух концентрических колец при использовании энергии в импульсе 150-300мкДж в зависимости от толщины слоя геля. 5. Подобраны параметры для управляемого переноса клеточных сфероидов из мезенхимальных стволовых клеток на акцепторную поверхность. Оптимальный состав биочернил представлял собой смесь из высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (2 мг/мл) и фибриногена (20 мг/мл), что обеспечивало необходимую вязкость чернил и их повторяемый перенос с донорного слайда на акцепторный, а также позволяло механически зафиксировать полученные паттерны из сфероидов на акцепторной поверхности при помощи пипетирования раствора тромбина (4 ЕД/мл). Прецизионность и управляемость переноса сфероидов достигалась за счет точного позиционирования акцепторной поверхности при помощи разработанной системы для стерильной биопечати вне условий ламинарного шкафа, состоящей из изолированной влажной камеры, а также подвижной магнитной опоры. На основании подобранных параметров системы для биопечати был разработан подход для заселения скаффолдов клеточными сфероидами в необходимой геометрии. Примененный подход позволил равномерно распределить клеточные сфероиды по всему пространству скаффолда на расстоянии не менее 1 мм, что являлось необходимым параметром для дальнейшей визуализации перенесенных сфероидов при помощи специализированных методов 6. Был успешно опробован новый метод рентгеновской микротомографии, который будет проводиться на лабораторном томографическом комплексе ТОМАС, разработанном в Институте кристаллографии ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН для исследования сформированных трехмерных структур из биосовместимых полимерных материалов и локализации клеточных сфероидов на их поверхности. Получены данные по визуализации внутренней структуры сформированных трехмерных конструкций, на фоне которых контрастно выделяются клеточные сфероиды. Такой подход может успешно использоваться в качестве новой методики процесса заселения клеточным материалом трехмерных объемных скаффолд-структур, непосредственно во внутреннем объеме с характерным разрешением в несколько десятков микрометров. 7. Было проведено испытание биосовместимости созданных тканеинженерных конструктов на модели подкожной имплантации у крыс. Гистологический анализ выявил частичную деградацию скаффолда с замещением деградировавших участков зрелой соединительной тканью с сосудами. Наличие соединительнотканной капсулы, окружающей материал скаффолда, а также умеренная тканевая реакция в виде клеток инородных тел указывает на хорошую биосовместимость созданных конструктов, а также способность к их биоинтеграции с окружающими тканями. Дальнейшее проведение имплантаций сформироавнных скаффолдов на модели сегментарного костного дефекта большеберцовой кости кролика оказалось невозможным в силу неподходящего дизайна скаффолда, не предусматривающего его фиксацию в месте имплантации при помощи интрамедуллярного стержня. Полученный результат позволит в дальнейшем оптимизировать дизайны полимерных скаффолдов с целью их прочной фиксации в месте имплантации в кость без разрушения полимерного конструкта. 8. В рамках выполнения работы были рассмотрены альтернативные модели заселенных клетками скаффолдов, имплантируемых в малых животных. Классически, такие модели служат в качестве средств восстановления фрагментов поврежденных или утраченных тканей и органов. Однако, они таже могут выступать в качестве платформы для изучения новых терапевтических компонентов для лечения вирусных инфекций, например для вирусных гепатитов. В рамках выполнения работы рассмотрена возможность использования в качестве новых материалов термочувствительеных полимеров для изготовления трехмерных скаффолдов. Рассмотрены их характеристики, включающие их гидрофобно-гидрофильные свойства, определены механические свойства при различных температурах, а также возможные пути для их трехмерного микроструктурирования.