Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За первый год работы проведены все запланированные работы и получены следующие результаты: 1) Была подобрана процедура пробоподготовки образцов препарата BP-Cx-1 для анализа методом МС ИЦР ПФ с прямым вводом образца. Далее на 11 образцах, полученных из разных партий, была оценена применимость МСИЦР ПФ для анализа контроля качества многокомпонентного материала. Из 11 образцов пять были синтезированы в одинаковых условиях, пять были получены с нарушением процедуры синтеза и один образец является стандартным материалом фармакопейной чистоты, на котором проводились все тесты in vivo. Для сравнения полученных масс-спектров была предложена статистическая метрика - индекс сходства Танимото для попарного сравнения молекулярных составов образцов из разных партий. Выяснено, что индексы Танимото для образцов, синтезированных в одинаковых условиях, сравнимы с тестом на воспроизводимость анализа для одного образца. Таким образом показано, что метод МСИЦР ПФ позволяет отличить образцы, синтезированные в стандартных условиях, от образцов, полученных с нарушением технологической процедуры, и может быть использован для контроля качества. По результатам работы подана статья в журнал Rapid Communication in Mass Spectrometry (вторая стадия рецензирования). 2) Для определения количества различных кислород-содержащих функциональных групп в составе индивидуальным компонентов препарата BP-Cx-1 были разработаны методы введения дейтериевых меток для анализа методом МСИЦР ПФ. Для определения карбоксильных групп был применен метод дейтерометилирования по Фишеру (СD3OH/SOCl2). Сумма карбонильных фрагментов (кетоны, альдегиды и хиноны) была определена с помощью восстановления бородейтеридом натрия (NaBD4) в водной среде. Для определения количество фенольных групп было предложено использовать реакцию ацилирования хлорангидридом-d3. Так как хлорангидрид приводит также к модификации карбоксильных групп, проводилась вторая стадия – метилирования по Фишеру, аналогично с дейтерометилированием, но с использованием легкого метанола. Во всех случаях меченый продукт очищали твердофазной экстракцией на картриджах Bond Elute PPL с последующим элюированием метанолом. Для подсчета количества групп в масс-спектрах искали серии пиков с разницей масс 17.03448, 45.029396 и 3.02193 Да, что соответствовало замещению протона и присоединению фрагмента CD3 (дейтерометилирование), CD3C(=O) (ацилирование) и присоединению к карбонильной группе протона и дейтерона (HD) в результате восстановления. Результаты были наложены на диаграммы ван Кревелена в координатах атомных отношений O/C и H/C. Таким образом было проведено картирование функциональных групп. Было обнаружено, что количество карбоксильных групп варьировалось от 0 для наиболее насыщенных компонентов до 4 для окисленных и ненасыщенных с атомными отношениями O/C > 0.4 и H/C < 1. Количество карбонильных групп менялось от 0 до 3. Количество фенольных групп также варьировалось от 0 до 3, причем максимальное количество наблюдалось для низко окисленных ненасыщенных молекул с O/C < 0.4 и H/C < 1, для которых наблюдалось минимальное количество карбоксильных групп. Для таких компонентов можно предложить типичную структуру флавоноидов, замещенный кверцетин, типичный полифенол для органического вещества растительного происхождения. Полученная информация о функциональных группах позволила провести коррекцию литературного индекса ароматичности, который высчитывается, исходя из предположения, что все кислородные атомы молекулы входят в карбоксильные группы (Koch& Dittmar, RCMS, 2008). Принято, что AI ≥ 0.67 указывает на присутствие конденсированной ароматической системы, AI ≥ 0.5 указывает на ароматическую молекулы, а AI < 0.5 на неароматический тип соединений. С помощью полученной информации о функциональных группах проведена коррекция индекса ароматичности. В итоге ароматичность более 10% молекулярных составов была переоценена. Работа проводилась совместно с лабораторией БиоГеоОномики центра Гельмгольца по исследованию окружающей среды (г. Лейпциг, Германия). Результаты представлены на международной конференции. По результатам работы подана статья в Analytical Chemistry (вторая стадия рецензирования). 3) Был проведен поиск структурных кандидатов для компонентов BP-Cx-1 в курируемой базе данных ChEMBL, включающей почти 2 миллиона индивидуальных структур и почти 16 миллионов описанных активностей. Из 2196 формул, найденных с помощью МСИЦР ПФ, 1613 были найдены в базе. Этим формулам соответствовали 43200 уникальных структур и 466641 записей биологической активности. Статистика профилей биологической активности показала, что биотестирование на клетках печени или по влиянию на печень наиболее часто встречаются для отобранных структур – 401 структура была протестирована на влияние на печень, среди которых для 242 показана гепатопротекторная активность. Для фильтрации структур по релевантности, были применены структурные фильтры по функциональным группам – карбоксильные, карбонильные и фенольные. Был предложен коэффициент достоверности от 0 до 3 – по совпадению количества различных функциональных групп. Для 216 молекулярных составов было найдено 90 структур с достоверностью 3 и 1177 с достоверностью 2: 540 структур с совпадающим количеством фенольных и карбонильных групп, 388 с количеством карбоксильных и карбонильных групп, 249 с количеством карбоксильных и фенольных групп. Результаты исследования были представлены в виде устного доклада на международной конференции (5я международная конференция МГО СНГ по гуминовым инновационным технологиям HIT-2019) и опубликованы в сборнике тезисов (doi: 10.36291-HIT.2019.zherebker.052). 4) Для фармакокинетического исследования был получен меченый препарат BP-Cx-1, причем дейтериевая метка вводилась в скелетные положения, чтобы избежать обратного обмена при проведении экспериментов. Были получены препаративные количества меченого дейтерием образца BP-Cx-1 и проведены совместные исследования с ФГБУ «НМИЦ Онкологии им. Н.Н. Петрова» по его введению лабораторным мышам. Во всех экспериментах использовались мыши-самки линии Balb/c. В эксперименте участвовали 29 мышей, разделенных на 5 групп: 1. - интактный контроль (3 мыши), 2. - в/в введение исходного образца BP-Cx-1 (3 мыши), 3. - п/о введение исходного образца BP-Cx-1 (3 мыши), 4. - в/в введение меченого образца BP-Cx-1 (10 мышей), 5. - п/о введение меченого образца BР-Cx-1 (10 мышей). Внутривенно исходный и меченый препараты вводились в дозе 20 мг/кг, перорально – в дозе 100 мг/кг. После введения препаратов мыши были помещены в метаболические клетки для сбора мочи и кала. Животные были подвергнуты эвтаназии методом декапитации согласно времени введения препаратов – группы 1 и 2 – через 6 часов после введения, группа 3 – через 12 часов после введения, группы 4 и 5 – через 2 часа после введения для достижения наибольшей концентрации меченого образца во внутренних органах. Для обнаружения компонентов BP-Cx-1 в физиологических жидкостях и внутренних органах были разработаны и применены процедуры выделения компонентов препарата из мочи, крови и печени. Для повышения удельной концентрации компонентов BP-Cx-1 в растворе для анализа, была предложена процедура фракционирования общего экстракта на твердофазном сорбенте PPL за счет последовательной сорбции при понижении рН. Полученные метанольные растворы для всех групп образцов анализировали методом МСИЦР ПФ с прямым введением образца с помощью электрораспыления. 5) Был предложен способ регистрации масс-спектров ИЦР ПФ с квадрупольной изоляцией на массе 410 Да с шириной окна 120 Да. Это позволяет получить наибольшую относительную интенсивность основных меченых компонентов препарата на фоне метаболома, так как такое аналитическое окно совпадает с максимумом распределения интенсивности в масс-спектре материнского образца. После парентерального и перорального введения в печени мышей было обнаружено 74 молекулярных компонентов BP-Cx-1, причем 65 из них были общими для обоих путей введения. Поиск в базе ChEMBL показал наличие 600 возможных структур, но только 60 имели индекс достоверности 2. Дальнейший поиск структур с гепатопротекторной активностью показал 57 записей активностей в базе для 13 структур, из которых 2 структуры имели индекс достоверности 2. Активности, описанные для данных структур включают: антиоксидантную активность, гепатопротекторные свойства против разрушения печени, вызванного введением лекарств, ингибиторная активность против токсического эффекта липополисахаридов на клетки печени. 6) Совместно с Лабораторией канцерогенеза и старения ФГБУ «НМИЦ Онкологии им. Н.Н.Петрова» проведены эксперименты по оценке гепатопротекторной активности препарата BP-Cx-1 на модели неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБЛ) у крыс, вызванной предварительным введением фруктозы. В исследовании использовали 97 самцов альбиносов крыс Wistar. Эффективность и безопасность препарата оценивали по следующим показателям: летальность животных, общий клинический анализ крови и биохимический анализ крови. Было показано положительное влияние введения препарата на основные биохимические показатели по сравнению с крысами с НАЖБЛ, не проходящими терапию. Так, был остановлен рост общего билирубина в биохимическом анализе крови относительно контроля на уровне ниже по сравнению с коммерческим препаратом Гептрал: 30% и 36% для BP-Cx-1 и Гептрала, соответственно. Для крыс без лечения показатель вырос на 52% за 38 дней. Также был показан положительный эффект на активность ферментов печени, аланинаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу: использование препаратов в течение 10 дней способствовало снижению содержания АЛТ на 11,0% при использовании BP-Cx-1 и на 9,4% при использовании Гептрала. Таким образом было показано, что ежедневное использование полифенольного препарата BP-Cx-1 в течение 10 дней после развития НАЖБП способствует снижению тяжести нарушений до уровня, сопоставимого с применением Гептрала, а в некоторых случаях полной нормализации изученных показателей. 7) Была проведено оценка фото-стабильности препарата BP-Cx-1. Для этого были проведены три эксперимента по фото-облучению растворов препарата на трех длинах волн: 254, 460 и 525 нм с одинаковой дозой облучения. Облученные и исходный образцы анализировали методом МСИЦР ПФ в одной концентрации. Было обнаружено, что облучение на 460 и 525 нм приводит к небольшим изменениям молекулярного состава. В то же время, на 254 нм наблюдалось исчезновение 967 молекулярных составов. Облучение видимым светом приводило к образованию новых конденсированных и менее окисленных компонентов, а облучение на 254 нм - к окислению образца и образованию 362 новых ионов с более высокими атомными отношениями О/С. В то же время ароматический каркас в основном сохранялся во всех случаях. Таким образом образец BP-Cx-1 является фото-лабильным и может претерпевать значительные превращения при облучении в зависимости от мощности и дозы облучения. 8) Для оценки реакционной способности компонентов BP-Cx-1 от длины волны облучения, была проведена реакция дейтерометилирования для определения количества карбоксильных групп. Рассмотрение наиболее интенсивных ионов, которые исчезали после облучения показало, что при длине волны 254 нм подвергаются изменению компоненты как с одной карбоксильной группой, так и ароматические поликарбоновые кислоты. В то же время, облучение на 525 нм приводило к превращению только поликарбоновых кислот. Были предложены механизмы превращения компонентов в зависимости от длины волны. В обоих случая инициатором являются активные радикалы кислорода. Результаты работы представлены в виде публикации в журнале European Journal of Mass Spectrometry (Zherebker et al., Photoreactivity of humic-like polyphenol material under irradiation with different wavelengths explored by FTICR MS and deuteromethylation, EJMS, 2020, doi: 10.1177/1469066720917067) 9) Разработанные методы фракционирования на картриджах PPL и дейтерометилирования были использованы для исследования природных объектов – растворенного органического вещества (РОВ) двух почв умеренного региона и одной вечномерзлотной почвы Арктического региона. Все фракции были исследованы методом МСИЦР ПФ. Результаты были представлены в виде диаграмм ван Кревелена. В случае почв умеренной зоны наблюдалось смещение интенсивности от насыщенных компонентов с H/C > 1.2 и O/C < 0.4, выделяемых при рН 7, до окисленных ненасыщенных соединений с H/C < 1 и O/C > 0.7, выделяемых при рН 2. В случае РОВ вечной мерзлоты градиент также наблюдался, однако при рН 2 доминировали компоненты с H/C ≈ 1 и O/C 0.5, что указывало на меньшую степень гумификации данного РОВ. Метод дейтерометилирования в комбинации с МСИЦР ПФ позволил определить количества карбоксильных групп в каждой фракции. Обнаружено, что фракции РОВ дерновоподзолистой почвы, выделенные при рН 7 состояли из компонентов без или с одной карбоксильной группой. По мере понижения рН компоненты с тем же молекулярным составом состояли из большего количества карбоксильных групп, доходя до поликарбоновых кислот с 5 карбоксильными группами при рН 2. В дополнение, фракции Арктического РОВ так же были исследованы методом изотопного мечения. Было обнаружено, что его компоненты, выделенные при рН 5 уже являются поликарбоновыми кислотами – количество кислотных групп доходило до 4. Так как эти соединения выделялись при рН 5, можно предположить, что карбоксильные группы в них не сопряжены с ароматической системой. Более того, для некоторых из соединений эквивалент двойной связи (DBE) после учета карбоксильных групп был меньше 4, что делает невозможным присутствие ароматического кольца (ароматическое кольцо требует DBE 4). Таким образом, предложенный метод позволил впервые явно продемонстрировать неароматические поликарбоновые кислоты – алициклические поликарбоновые кислоты (CRAM), которые отсутствовали в образцах почв умеренного региона. Результаты работы представлены в виде публикации в высокорейтинговом журнале Environmental Science and Technology (WoS, Scopus, IF 7.149)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За второй год работы проведены все запланированные работы и получены следующие результаты: 1) Разработан алгоритм для полностью автоматического подсчета интересующих серий изотопного или химического мечения на языке Python. Для каждого типа реакции был сформулирован набор эвристических правил, которые учитывались в компьютерном коде, для удаления возможных артефактов анализа: шума, пиков с разницей значений m/z меньшей, чем допустимая ошибка вычисления, погрешности калибровки. Это позволило увеличить количество определяемых компонентов за счет полного удаления необходимости ручной обработки выделяемых серий. Результаты определения в образце BP-Cx-1 количества карбоксильных, карбонильных и фенольных групп опубликована в высокорейтинговом журнале (Zherebker et al., Anal. Chem. 2020, 92, 13, 9032–9038). 2) Применение методов выделения компонентов BP-Cx-1 из внутренних органов, разработанный на предыдущем этапе выполнения проекта, получения масс-спектров ИЦР ПФ с квадрупольной изоляцией ионов и алгоритм обработки серий H/D обмена позволили надежно определить молекулярные составы в плазме крови, почках и печени мышей. Также были обнаружены компоненты образца BP-Cx-1 в кале и моче после 6 часов содержания в метаболических камерах. Примерно по 150 молекулярных составов было определено в крови и почках после внутривенного и перорального введения образца мышам. В кале были обнаружены 189 и 223 компонента после внутривенного и перорального введения, соответственно, из которых 102 (≈50%) были обнаружены в обоих случаях. В моче были надежно обнаружены 224 и 241 компонента после внутривенного и перорального введения, соответственно, из которых 42 (≈18%) были обнаружены в обоих случаях. Все компоненты являлись низкоокисленными (O/C<0.5), как и в исходном образце. Содержали как конденсированные (H/C<1), так и более насыщенные компоненты. Низкое количество общих компонентов (18%) указывало на более низкие концентрации образца в моче (близко к порогу чувствительности) по сравнению с калом. Был сделан вывод о более длительном периоде выведения образца из организма. В печени было определено значительно больше молекулярных составов: 600 и 450 после внутривенного и перорального введения. Большее количество компонентов в печени согласуется с предыдущими экспериментами по введению меченого тритием образца – в печени и легких было зафиксировано максимальное содержание образца. Похожие результаты были получены для метаболитов образца – молекулярных составов, которые отсутствовали в исходном образце, присутствовали в образце после введения образца и подтвержденные изотопной меткой. Около 100 метаболитов было обнаружено в крови, почках, моче. В печени было получено 270 новых метаболитов образца. Во всех случаях метаболиты отличались большей насыщенностью по сравнению с компонентами исходного образца. Это указывало на разрушение ароматических колец в результате действия энзимов, предположительно, пероксидаз. Причем количества метаболитов и путь метаболизма практически не отличался в зависимости от пути введения. 3) Была разработана методика генерации природоподобных структур, обладающих гепатопротекторной активностью с помощью алгоритма глубокого обучения. Для генерации была выбрана архитектура рекуррентной нейронной сети. Методика включала обучение сети на стандартизированных химических соединениях из базы данных COCONUT (100 эпох) с последующим дообучением на структурах из базы ChEMBL (10 эпох), обладающих гепатопротекторной активностью. В результате было сгенерировано 100 тысяч релевантных структур, записаны в локальную базу в виде SMILES. Для всех сгенерированных структур было рассчитано распределение скаффолдов Бемис-Мурко. Наиболее часто встречающие скаффолды соединений соответствовали известным природным соединениям: флавоноидам, кумаринам и стероидам. Для всех структур были посчитаны основные физико-химические параметры и индексы природоподобия, причем сгенерированные соединения в среднем имели больший индекс природоподобия и больше акцепторов водородной связи (метоксильные группы), чем структуры из обучающей выборки. 4) Для отобранных структур были предложены потенциальные белковые мишени гепатопротекторного действия. Для этого адаптировали метод анализа сетей химического сходства CSNAP. С использованием данных о структурах была построена сеть химического подобия. Это позволило создать взвешенный граф (сеть химического подобия) с вершинами, соответствующими соединениям, и ребрами, соответствующим химическому подобию между ними. Сгенерированная топология сети CSNAP использовалась для поиска наиболее вероятных мишеней действия соединений с использованием двух методов оценки: оценка Швиковски (S-оценка) и оценку Хишигаки (H-оценка). В итоге для 657 соединений, которые удовлетворяли бы результатам изотопного мечения, нашелся хотя бы один структурный аналог в базе ChEMBL. Для этих соединений было доступно 17389 записей о биологической активности, 4418 описаний биологических экспериментов и 1056 записей о мишенях. Всего 11 белков-мишеней, участвующих в патогенезе и прогрессировании НАЖБП были спрогнозированы как вероятные мишени действия сгенерированных структур. Из предсказанных биологических мишеней были отобраны три наиболее вероятные, которые были бы связаны с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП) и структуры, которые были бы активны по отношению к этим ишеням. Среди наиболее вероятных мишеней действия соединений были: Кельч-подобный ECH-ассоциированный белок 1 (KEAP1), отвечающий за связь с Nrf2, Гамма-рецептор, активированный пролифератором пероксисом (PPARg), участвующий в метаболизме липидов и глюкозы в печени, и АМФ-активированная протеинкиназа (AMPK), участвующая в окислении жиных кислот. Результаты были представлены на международной конференции в виде постерного доклада (68я конференция американского масс-спектрометрического сообщества АСМС, проводилась онлайн). 5) Был разработан метод фракционирования препарата BP-Cx-1 основанный на экстракции в аппарате Сокслета с градиентом полярности – метанол (100%), метанол-вода (3-1), метанол-вода (1:1), метанол-вода (1:3). Анализ методом МСИЦР ПФ фракций показал ещё большую сложность образца – было определено 4529 молекулярных составов, что почти в два раза больше исходного образца. Был сделан вывод о конкуренции при ионизации методом прямого ввода и подавлении ионизации минорных образцов. Было определено, что метанольная фракция имеет больше всего молекулярных составов – 3335. Было определено, что метанольная фракция обогащена компонентами, обнаруживаемыми в печени, как при пероральном, так и при внутривенном введении. Получили 5 г метанольной активной фракции для проведения дальнейших биологических испытаний. 6) Был разработан метод определения количества ароматических колец в составе индивидуальных компонентов метанольной фракции с помощью реакции с N-бромсукцинимидом (NBS) в ацетонитриле с последующим анализом методом МСИЦР ПФ. Была получены информация о количестве ароматических колец в компонентах метанольной фракции BP-Cx-1 по сериям H-Br: 773 не содержали ароматических колец, 513 содержали одно, 94 содержали 2 и один компонент содержал 3 ароматических кольца. С помощью полученных данных о количестве ароматических колец были отобраны 76 наиболее надежных структур, для которых предсказали потенциальное фармакологическое действие с помощью программы PASS (http://www.way2drug.com). Для всех структур были предсказаны следующие вероятные свойства: антиоксидантная активность, ловушка свободных радикалов, антивоспалительные. Для более чем 20 структур была предсказана гепатопротекторная активность и ингибирование пролиферации. Для части структур было также предсказано ингибирующая активность против киназ и антигиперхолестеринемические свойства, ингибирование синтеза холестерина. Был сделан вывод о перспективности использования образца BP-Cx-1, особенно активной фракции, для поддерживающей терапии печени. 7) Была проведена индукция сахарного диабета 2 типа (СД2, сочетанного поражения печени и поджелудочной железы) 29 мышам-самкам линии BALB/c. Было проведено подробное исследование гепатопротекторной активности образца BP-Cx-1 и его активной фракции на этой модели. В результате патоморфологического исследования печени был выявлен выраженный стеатоз печени у всех мышей, получивших высокожировую, высокофруктозную диету и стрептозотоцин. На данной модели индекс стеатоза не различался между опытными группами. Были получены данные о выживаемости животных в выбранной модели. Данные свидетельствуют о том, что в начальные сроки опыта выживаемость в группах была примерно равной. Однако после 39 дня опыта в контрольной группе СД2 выживаемость снижалась. То же наблюдалось и для группы животных, получавших BP-Cx-1. На последний день опыта (52-й) в группе СД2 процент выживаемости животных составил 62,5% (5 особей); в группе BP-Cx-1 – 50% (4 особи); в группе выделенной фракци BP-Cx-1 – 87,5%. Таким образом, активная фракция продемонстрировала некоторое увеличение выживаемости. Значимое влияние было отмечено для биохимического анализа крови подопытных животных. Воздействие стрептозотоцина в сочетании с ВЖД и ВФД приводило к нарушению обмена белков во всех группах, получавших экспериментальное воздействие. При этом применение выделенной фракции BP-Cx-1 значимо снижало по сравнению с группой СД2 содержание общего белка с 60,9±3,33 г/л до уровня сопоставимого с группой интактного контроля -46,8±1,52 г/л, за счет снижения содержания всех фракций. Применение выделенной фракции BP-Cx-1, в отличие от исходного препарата, также значимо снижало по сравнению с группой СД2 уровень общего и прямого билирубина. Уровень холестерина, характеризующего липидный обмен, также был значимо повышен по сравнению с группой здорового контроля во всех группах, где применялось экспериментальное воздействие. При этом применение выделенной фракции BP-Cx-1 значимо снижало уровень холестерина по сравнению с группой СД2. В ходе проведенного исследования в используемой модели выявлены преимущества выделенной потенциально более активной фракции BP-Cx-1. По сравнению с исходным препаратом, она способствовала не только нормализации содержания гемоглобина и гематокрита, активности каталазы, но также несколько увеличивала выживаемость экспериментальных животных и оказывала положительное влияние на показатели обмена белков, билирубина и холестерина. В целом, можно заключить, что выделенная более активная фракция BP-Cx-1 является хорошим кандидатом для разработки гепатопротектора, предназначенного для лечения повреждений печени средней и тяжелой степени.