Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведен анализ профиля миРНК в опухолевой ткани мышей линии C57Bl6 с карциномой легких Льюис, гомологичной немелкоклеточному раку легких человека, с фокусировкой на миРНК, которые могут быть связаны с развитием хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), воспалительными заболеваниями и заболеваниями, сопровождающимися подавлением/активацией иммунного ответа. Обнаружено восемь миРНК, гиперэкспрессирующихся при ХОБЛ и при LLC, и 26 миРНК, для которых при ХОБЛ и LLC характерен низкий уровень экспрессии. Таким образом, наблюдается сходство профиля экспрессии миРНК при карциноме легких Льюис и ХОБЛ. Обнаружены миРНК карциномы легких Льюис, типичные и для других опухолевых заболеваний, а также миРНК, опосредующие иммуносупрессивные свойства антиген презентирующих клеток, что свидетельствовует о том, что развитие этой опухоли сопровождается иммуносупрессией. Для выявления общих механизмов запуска воспаления и опухолевой трансформации реконструирован регулом на основе данных кДНК микрочипирования, полученных на моделях астмы, колита, колит-ассоциированного рака? и NGS анализа опухолевой ткани мышей с LLC. Выявлены Топ-6 ключевых миРНК, наиболее представленных в кДНК библиотеке из опухолевой ткани LLC, способных по данным литературы контролировать воспалительные процессы, иммунyосупрессию и метастазирование: mir-125a-5p, mir-31, mir-10b, mir-451 и mir-15b. Идентифицированные микроРНК представляют высокий интерес в качестве перспективных мишеней для разработки новых высокомолекулярных ингибиторов, способных подавлять злокачественную трансформацию, ассоциированную с хроническим воспалением, на ранних стадиях, а гены-мишени этих миРНК могут представлять собой перспективные молекулярные мишени для малых интерферирующих РНК. Показано, что антисмысловые гапмерные конструкции, содержащие в центральной части дезокси- или фосфотиоат-модифицированное олигонуклеотидное «окно», фланкированное фосфорилгуанидин-модифицированными олигонуклеотидами, являются перспективными инструментами для снижения уровня биологически релевантных мРНК и кодируемых ими белков (мРНК MDR1 человека и белка р-гликопротеина). Показано, что эффективную доставку в клетки обеспечивает конкатемерная система, сформированная олигонуклеотидом, несущим остаток холестерина, присоединенный к его 5’-концу через аминогексанольный линкер, и немодифицированным антисмысловым олигонуклеотидом. Доказана высокая эффективность доставки в клетки олигонуклеотидов с модифицированным рибозофосфатным остовом с помощью новой системы, состоящей из транспортного олигонуклеотида, содержащего три додецильных остатка, и доставляемого олигонуклеотида. Разработаны и синтезированы новые аналоги антисмысловых олигодезоксирибонуклеотидов, несущие на межнуклеотидном атоме фосфора додецилбензольные или гексадецильные остатки, введенные в состав олигонуклеотида путем модификации межнуклеотидных N-(сульфонил)-фосфорамидных групп. Отработана и охарактеризована модель острого воспаления в кишечнике (декстран-индуцированный колит), которое приводит к развитию опухолевого процесса (колит-ассоциированный рак), а также модель острого воспаления в легких (овальбумин-индуцированная астма), которое приводит к развитию фиброза. Отработаны ряд моделей общего и местного острого воспаления, которые могут быть использованы в качестве воспалительного фона, усугубляющего течение опухолевого процесса и ухудшающего ответ на противоопухолевую терапию: модель общего воспаления – ЛПС-индуцированная эндотоксемия; модели местного воспаления – каррагинан-индуцированный перитонит, каррагинан-индуцированный острый отек лап. Показано, что сочетанное применение исРНК и цитостатика дакарбазина эффективно подавляет рост меланомы В16, вызывает снижение агрессивности опухолевого процесса за счет снижения митотической активности и индукции апоптоза в ткани опухоли, а также эффективно активирует иммунную систему, стимулирует регенерацию и не вызывает дополнительного повреждения печени. Проведена оценка фенотипа профессиональной ХОБЛ (ПХОБЛ) в зависимости от воздействия неорганической пыли. Показано, что ПХОБЛ отличалась от ХОБЛ у курильщиков табака гиперреактивностью бронхов, легочной гипертензией, низкими значениями DLCO (однократного вдоха с задержкой дыхания), низкой толерантностью к физической нагрузке, тяжелой одышкой, выраженной десатурацией после физической нагрузки (преимущественно при ХОБЛ от действия металлической пыли), сочетанием с легочным фиброзом, активацией моноцитарно-макрофагального звена в период обострения, малоклеточным типом воспаления дыхательных путей. Проведен анализ факторов воздуха рабочей зоны (состава промышленных аэрозолей, образующихся в ходе распространенных технологических процессов с позиции наличия наночастиц) и физико-химическое исследование наночастиц аэрозоля. Установлен элементный химический состав аэрозолей воздуха, который представлен Al, Ba, Ca, Cr, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, P, S, Si, Sr, W и Zn . Содержание найденных элементов варьирует от 5 до 625 нг/л воздуха. Наибольшее содержание характерно для элементов Ca, Fe, K, S и Si. Размер идентифицированных частиц варьирует от 1 до 20 мкм.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведен биоинформационный анализ и идентифицированы ключевые РНК, уровень которых значительно меняется при развитии воспаления, опухолевой трансформации и дисфункции иммунной системы. Показано, что основными генами, контролирующих развитие острого повреждения легких на мышиных моделях in vivo, являются Il-6, Cxcl13, Timp1, Ccl2, Adam8, Thbs1, Serpina3n, Tnc, Serpine1 и Plaur. Среди перечисленных генов наибольшего внимания заслуживают Timp1, Adam8, Ccl2, Cxcl13 и Plaur участвующие в регуляции воспаления. Развитие легочного фиброза на мышиных моделях in vivo контролируют гены Ccna2, Spp1, Timp1, Cxcl10, Igf1, Fn1, Tyrobp, Ccr5, Ccl9 и Col1α1. Среди перечисленных генов наибольшего внимания заслуживают Timp1, Cxcl10, Igf1, Col1α1 и Tyrobp, участвующие в регуляции синтеза и деградации внеклеточного матрикса и иммунного ответа. Установлено, что основными маркерами/потенциальными мишенями острого воспаления являются мРНК генов TIMP1, TYROB, Zfp281, ADAM8, TREM2, C3, IRF8, TREM2, ZNF281, SERPINA3 (в разных комбинациях в зависимости от использованной модели), а в случае хронического воспаления этот список генов дополняется ELANE. Методом ПЦР в реальном времени определены уровни экспрессии мРНК генов Timp1, Adam8, C3, Trem2, Tyrobp, Irf8, Elane, Serpina3, Zfp281, при развитии у экспериментальных животных острого и хронического воспаления. Выявлено, что наибольшее изменение экспрессии при развитии острого воспаления наблюдается у генов, участвующих в регуляции внеклеточного матрикса и межклеточных взаимодействий (Timp1 и Adam8 в 10.5-109 раз и в 2.7-78 раз, соответственно, C3 в 4-20 раз). Принимая во внимание как данные по валидации генов мастер-регуляторов, так и данные гистологического исследования тканей легкого оптимальными моделями фиброза легких представляются LPS-индуцированный и блеомицин-индуцированный фиброз легких, а перспективными мишенями для действия терапевтических нуклеиновых кислот для терапии фиброза легких – мРНК генов Timp1, Adam8, C3, Elane или контролирующие их экспрессию миРНК. Получены селективно модифицированные нуклеазоустойчивые siРНК, направленные на мРНК генов мыши TREM2, ADAM8 и TIMP1. Показано, что siРНК, направленные на TIMP1 подавляют его экспрессию на 85%, что соответствует его уровню экспрессии в не активированных клетках. Эффективность подавления экспрессии гена TIMP1 составила 52 и 46% для siTREM2_1m и siTREM2_2m, соответственно. Активность siРНК, направленные на ADAM8 мРНК, составила 25 – 28%. Исследовано биораспределение комплексов Cy7-siРНК/ F (F - катионные липосомы, содержащие остатки фолиевой кислоты на поверхности липосом) in vivo на здоровых мышах SCID и животных-опухоленосителях с ксенографтными опухолями KB-3-1, KB-8-5 и L1210 с высокой экспрессией фолатных рецепторов (FR) и LLC с низким уровнем его экспрессии. Показано, что уровень накопления Cy7-siРНК в опухолях уменьшается в ряду L1210 > KB-3-1 >> КВ-8-5 >>> LLC, что хорошо коррелирует с уровнем экспрессии FR этих клетках. Показано, что siРНК в комплексе с фолат-содержащими липосомами F при внутривенном введении распространяется глубоко в ткани и присутствует в цитоплазме практически всех клеток почки и опухоли и большинстве клеток печени. Показано, что солоксолон метил (СМ) на модели воспаления in vitro обладает выраженной способностью усиливать экспрессию провоспалительного IL-6 как на уровне мРНК, так и на уровне белка, при этом природа воспалительного стимула не влияет на наблюдаемый эффект. Показало, что NF-kB сигнальный путь не участвует в регуляции IL-6-активирующей активности СМ, а данный эффект тритерпеноида обусловлен активацией AP-1(c-Jun) транскрипционного фактора и способностью СМ влиять на систему TLR рецепторов. Проведенный анализ in silico показал, что в качестве молекулярных мишеней СМ могут рассматриваться OGT, MerTK и CD36. Показано, что СМ способен эффективно ингибировать эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) меланомы В16 in vivo, идентифицированы ключевые регуляторы этого процесса. С помощью модели «низкомолекулярный ингибитор – опухолевые клетки с эпителиально-мезинхимальным переходом» установлено, что TGF-β, STAT3 и mTOR являются перспективными мишенями для блокировки трансформации опухолевых клеток в высокоагрессивный фенотип. Исследована кинетика подавления пролиферации опухолевых клеток меланомы В16 под действием миРНК-направленных аналогов антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих N-(метансульфонил)фосфорамидную (μ-) модификацию межнуклеотидных связей, введённых по отдельности и в составе ансамблей (коктейлей). Показано, что наибольшая эффективность подавления пролиферации клеток В16 (на 50%) наблюдается под действием ансамбля из трех олигонуклеотидов: μ-miR-17+μ-miR-155+μ-miR-21. Эффективность такого коктейля совпадает с антипролиферативным эффектом олигонуклеотида μ-miR-21, использованного в режиме монотерапии в значительно большей концентрации. Полученные данные, вне сомнения свидетельствуют о наличии сочетанного действия олигонуклеотидов в композиции и демонстрируют перспективность использования комбинаций таких препаратов. Отработаны и охарактеризованы модели острого и хронического воспаления в легких, которые приводят к развитию легочного фиброза: LPS-индуцированное острое повреждение легких, LPS-индуцированный фиброз легких, блеомицин-индуцированное острое повреждение легких, блеомицин-индуцированный фиброз, овальбумин-индуцированное острое повреждение легких, овальбумин-индуцированный фиброз. За два года включено в проспективное когортное клиническое исследование 50 больных профессиональной хронической обструктивной болезнью легких (ПХОБЛ), 45 здоровых рабочих, подвергающихся воздействию многокомпонентных промышленных аэрозолей, и 48 (в 2020 г – 9) больных ХОБЛ, курильщиков табака, без профессиональных рисков здоровью. Методом линейной регрессии определены взаимосвязи массовой концентрации наночастиц в воздухе рабочей зоны и фенотипа профессиональной ХОБЛ. Показано, что массовая концентрация наночастиц металлов влияла на индекс эмфиземы, эозинофильный тип воспаления, объем форсированного выдоха за первую секунду. Массовая концентрация наночастиц диоксида кремния была взаимосвязана с распространенностью легочного фиброза, парциальным напряжением кислорода в артериальной крови, диффузионной способностью легких по монооксиду углерода, определенному методом одиночного вдоха, пауцигранулоцитарным типом воспаления. В многофакторном анализе с концентрацией наночастиц диоксида кремния были ассоциированы диффузионная способность легких и пауцигранулоцитарный тип воспаления дыхательных путей. Выявлено, что у больных, подвергавшихся воздействию наночастиц металлов, ХОБЛ развивалась при стаже 7 (6; 9) лет, наночастиц диоксида кремния – при стаже 9 (8; 10,5) лет. Основываясь на анализе литературных данных выбрано семь генов, дифференциально экспрессирующиеся в дыхательном эпителии при развитии ХОБЛ у пациентов: TTTY15, кодирующий длинную некодирующая РНК (lncРНК); NLGN4Y, кодирующий нейрогилин-4, относящийся к адгезионным молекулам; CLCA1, кодирующий белок, участвующий в формировании кальций-зависимых хлорид-ионных каналов; TBL1Y, кодирующий мастер-регулятор; FETUB, кодирующая фетуин‐B, являющийся ингибитором цистеиновых протеаз и участвующий в системном воспалении; CLC, кодирующий галектин, участвующий в воспалительных реакциях; SH3RF2, кодирующий белок, действующий в качестве анти-апоптотического регулятора сигнального пути JNK. Проведена оценка антропогенной нагрузки, которой подвержен персонал цеха авиационного завода, показано, что в различных производственных участках потенциально опасные элементы в виде наночастиц, такие как Fe и Mn находятся в пределах допустимого уровня концентрации. Определено содержание P, S и Si, а так же размеров, морфологии и химического состава неорганических наночастиц (ИНЧ) воздуха рабочей зоны. Результаты исследований ИНЧ, обнаруженных в воздухе рабочей зоны цеха, показали, что ИНЧ относятся к диапазону 50-200 нм. В отличие от микрометровых, эти частицы беспрепятственно проходят через средства индивидуальной защиты и далее через носоглотку в легкие человека.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате проведенного in vitro скрининга мРНК/миРНК направленных siРНК/антисмысловых олигонуклеотидов выбраны мишени и определены последовательности РНК-направленных препаратов, обеспечивающих значительное (до 90%) снижение уровня РНК-мишени в культуре клеток: синтезированы модифицированные siРНК, направленные к мРНК генов C3, Irf8, Serpina3, Zfp281, Timp1. Проведен анализ биологической активности и выбраны наиболее активные последовательности для получения конъюгатов. Показано, что siTimp1 с 2’F/2’OMe паттерном химических модификаций и её конъюгат с холестерином, содержащий дополнительно PS модификации эффективно, селективно и длительно подавляет экспрессию Timp1 (IC50 0.41 нМ). Установлено, что миРНК-направленные антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие N-(метансульфонил)фосфорамидную (мезил, или µ-) модификацию межнуклеотидных связей, обеспечивают эффективное и длительное (от 48 до 144 ч) снижение уровня соответствующих миРНК-мишеней в опухолевых клетках различного гистогенеза: на 55-75% для миРНК-21, 80% для миРНК-17 и 90% для миРНК-155. Выяснены молекулярные и клеточные механизмы, опосредующие взаимосвязь между воспалением, иммуносупрессией и онкотрансформацией, на моделях хронического воспаления и опухолевого роста in vitro и определены наиболее перспективные мишени для подавления онкотрансформации и иммуносупрессии. Установлены клеточные линии и временные интервалы, в которых воспалительный ответ сопровождается максимальным увеличением уровней экспрессии генов мишеней: для TIMP1 клетки RAW 264.7 (16-18 ч), J774 и Hepa 1-6 (6-24 ч); для ADAM 8 – клетки J774 (16-20 ч); для Serpinа3a и С3 – Hepa 1-6 (16 и 20 ч, соответственно); для DAP12 такой линии не найдено. Проведена валидация ключевых генов, связанных с острым повреждением легких и выявленных с помощью in silico подхода, на мышиной модели острого повреждения легких (ОПЛ). Показано, что паттерн экспрессии генов на модели ОПЛ in vivo полностью соответствует их экспрессионному профилю, выявленному in silico, а введение противовоспалительных препаратов снижает экспрессию выявленных генов и подавляет воспалительные изменения в легких, ассоциированные с ОПЛ. Установлено, что ряд ОПЛ-ассоциированных узловых генов, выявленных в мышином транскриптоме, гиперэкспрессированые в тканях легких мышей с ОПЛ и чувствительные к действию дексаметазона, играют важную регуляторную роль в повреждении легких человека, вызванном SARS-CoV-2. Обнаружено, что RSAD2, IFI44 и RTP4 могут являться новыми маркерами вирус-индуцируемого ОПЛ у человека. Установлено, что ап- или даун-регуляция 14 ОПЛ-связанных генов в тканях легких достоверно коррелирует с низкой выживаемостью больных с аденокарциномой (LUAD) и плоскоклеточным раком (LUSC) легких. Учитывая доказанное развитие ОПЛ у онкологических больных при химиотерапии или лобэктомии при немелкоклеточном раке легкого, выявленная панель ОПЛ/LUAD/LUSC-связанных генов может быть использована в качестве молекулярных маркеров для контроля тяжести рецидивов рака легкого после хирургического иссечения опухоли или химиотерапии. Определено влияние воспалительного фона и TLR4 антагониста LPS на эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) клеток аденокарциномы легких человека А549. Установлено, что именно воспалительный фон, а не LPS-стимулированная активация TLR4 сигнального пути участвует в запуске ЭМП в клетках А549; LPS на данной модели обладает синергическим действием. Исследование совместного действия миРНК-21-направленного антисмыслового олигонуклеотида µ-21-ON и цитостатика доксорубицина на жизнеспособность клеток лимфосаркомы RLS40 мыши показало, что все комбинации доксорубицина c µ-21-ON действуют в 1.5 раза эффективнее по сравнению с монотерапией цитостатиком, в 2.5 - 3 раза - по сравнению с монотерапией µ-21-ON. Установлено, что комбинация доксорубицина (½ IC50) и µ-21-ON в концентрации 25 нМ обеспечивает 70%-ное подавление жизнеспособности клеток RLS40, что указывает на синергическое действие препаратов. Таким образом, совместная обработка опухолевых клеток миРНК-направленными олигонуклеотидами значительно увеличивает чувствительность клеток к химиопрепаратам и позволяет снизить эффективную дозу олигонуклеотида, что является перспективной стратегией увеличения эффективности проводимой терапии. Изучено влияние состава катионных липосом на эффективность действия иммуностимулирующей РНК (исРНК). Показано, что увеличение длины ПЭГ в составе липоконъюгата, включенного в состав липосом 2Х3-DOPE, положительно влияет на эффективность иммуностимулирующего действия исРНК, при этом ди-конъюгаты предпочтительнее моноконъюгатов. Наиболее эффективная секреция интерферонов α, β и γ, а также, MCP-1 наблюдалась после внутривенного введения мышам CBA исРНК в комплексе с липосомами P2000 и diP2000, при этом не происходило резкого повышения уровня про-воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-6, -10, -1α, -27. Исследована биологическая активность разработанных РНК-направленных препаратов in vivo на релевантных моделях острого и хронического воспаления, иммуносупрессии и моделях высоко агрессивных метастазирующих опухолей различного гистогенеза и разной степени злокачественности: На моделях ЛПС-индуцированного острого повреждения и фиброза легких показано, что интраназальное введение комплексов Ch-siTimp1/2X3-DOPE приводит 1) к снижению числа лейкоцитов в БАЛ, 2) снижает активность воспалительного процесса в легких как по сравнению с контролем, так и по сравнению с Mock, что может свидетельствовать о противовоспалительном эффекте данной комбинации; 3) уменьшает в легких содержание стромального компонента до уровня здоровых животных и 4) подавляет воспалительную инфильтрацию легких. Таким образом, подавление экспрессии Timp1 с помощью siРНК предотвращает как развитие воспалительных изменений в бронхолегочной системе, вызванных введением LPS, так и отдаленных последствий в виде фиброза. Проведена валидация потенциальных мишеней для ген-направленной терапии на in vivo модели колита и колит-ассоциированного рака (КАР). Показано, что наиболее up-регулированными генами в тканях кишечника при остром колите были Timp1 и Adam8, при КАР – Timp1 и Tyrobp, в прилегающих к КАР тканях – Timp1, что делает ген Timp1 наиболее перспективной мишенью для ген-направленной терапии как воспалительных процессов, так и опухолевой трансформации, возникающей на фоне хронического персистирующего воспаления. В результате проведенного анализа выбраны miR-129, miR-149, miR-155, miR-494, miR-223, miR-142, miR-17 и miR-21 как наиболее тесно ассоциированные с развитием острого воспаления кишечника и КАР. Установлено, что острый колит сопровождается значительным повышением уровня miR-142 – в 4 раза, miR-129 – в 10 раз, miR-21 – в 13 раз, miR-149 – в 13 раз, miR-155 – в 14 раз, miR-494 – в 16 раз и miR-223 – в 52 раза по сравнению со здоровым кишечником, что делает эти миРНК потенциальными терапевтическим мишенями при воспалительных заболеваниях кишечника. Показано, что уровень миРНК miR-17 и miR-21 при колите близок к уровню миРНК, наблюдаемому в тканях, прилегающих к опухоли и в самой опухоли, что может свидетельствовать о прямом участии miR-17 и miR-21 в молекулярной трансформации острого воспалительного процесса в злокачественный рост. Проведена оценка противоопухолевой активности миРНК-направленных препаратов на модели лимфосаркомы RLS40 in vivo. Установлено, что перитуморальное введение мышам-опухоленосителям µ-21-ON в комплксе с липосомами F12 вызывает торможение роста первичного опухолевого узла в 2.8 раз по сравнению с группой, получавшей катионные липосомы F12. Совместное использование µ-miR-21 с ПХТ привело к снижению противоопухолевой активности по сравнению с µ-21-ON и ПХТ, применяемым по отдельности. Таким образом, высокодозная ПХТ не дает реализоваться противоопухолевому действию миРНК-направленных препаратов, что делает необоснованным их совместное применение. На модели лимфосаркомы RLS40 показано, что развитие опухоли приводит к индукции иммуносупрессии, уровень которой напрямую зависел от массы опухоли. При снижении размеров опухоли под действием µ-miR-21 наблюдалось снижение количества иммуносупрессивных моноцитарных миелоидных клеток до уровня здоровых животных. Исследован иммунологический статус экспериментальных животных и тип запускаемого Т-хелперного ответа на мышиной модели лимфосаркомы RLS40 при лечении дендритно-клеточными, липосомальными и везикулярными вакцинами. Показано, что все типы исследованных вакцин снижали размеры опухоли в 4-5 раз относительно контрольной группы. Вакцинация дендритно-клеточными, липосомальными или везикулярными вакцинами приводит к переключению с гуморального иммунитета на клеточный путем активации Th1/Th17 клеток, а также индукции позитивного иммунологического чек-пойнта 4-1BBL и даунрегуляции супрессорных иммунологических чек-пойнтов в ряду PD-1>>>TIGIT>CTLA4>TIM3. Все наблюдаемые иммунологические изменения лежали в основе значительного снижения скорости роста опухоли RLS40. Выявлены новые потенциальные терапевтические мишени, вовлеченные в развитие острого повреждения легких (ОПЛ). Network pharmacology анализ показал, что матриксная металлопротеиназа Mmp13, киназа Mapk14 и индуцибельная NO-синтаза (Nos2), потенциально блокируемые тритерпеноидом солоксолон метилом, могут рассматриваться в качестве новых терапевтических мишеней для лечения ОПЛ. Завершен набор больных профессиональной ХОБЛ и здоровых доноров; выполнен забор крови, забор образцов бронхоальвеолярной жидкости, выделение альвеолярных макрофагов и создание банка РНК из крови больных ХОБЛ и здоровых доноров. С помощью ре-анализа данных транскриптомных исследований периферической крови пациентов с ХОБЛ и здоровых доноров, депонированных в базе данных GEO (GSE100153), идентифицированы гены IFIT1, RSAD2 и KIR3DL1, связанные с ХОБЛ-регуломом и имеющие отношение к хроническим заболеваниям легких, которые могут быть обнаружены в периферической крови человека и рассматриваются нами как перспективные маркеры развития ХОБЛ. Идентифицированы 47 ключевых астма-ассоциированных дифференциально экспрессированных генов (ДЭГ), которые вовлечены в регуляцию воспаления и астма-специфичный регулом. Для 14 ключевых генов, ассоциированных как с астмой, так и с фиброзом, проведена верификация на модели OVA-стимулированной астмы/фиброза у мышей. Установлено, что 8 из 14-ти астма/фиброз-связанных генов up- (Fn, Igf1, Ccl2, C3, Timp1, Muc5b) либо down- (Cat, Cyp2e1) регулированы в тканях легких мышей не только при острой астме, но и при развитии астма-ассоциированного фиброза. Анализ генных сетей, text-mining подход и верификация найденных генов на релевантных моделях воспаления и фиброза легких мышей с помощью qRT-PCR и иммуногистохимического окрашивания позволили заключить, что гены, кодирующие коллаген IV типа (Col4a1, Col4a2 и Thbs2), могут являться новыми маркерными генами, ассоцированными с развитием пост-астматического фиброза. Определены экспериментально ключевые маркерные РНК развития ХОБЛ. Показано, что экспрессия ключевых генов, идентифицированных на моделях астмы, пост-астматического фиброза и блеомицин индуцированного фиброза легких мышей, изменена и у пациентов с различными хроническими заболеваниями легких. Полученные данные позволяют сделать вывод о ключевой роли генов CCL2, CXCL12, SPP1, MMP12, MMP9, COL1A1, COL3A1 и THBS2 в развитии фиброза легких не только на мышиных моделях, но и у пациентов, что позволяет нам рассматривать данные гены в качестве перспективных маркеров хронизации легочных заболеваний и развития легочного фиброза. Показано, что при формировании профессиональной ХОБЛ (ПХОБЛ) в условиях воздействия аэрозолей с наночастицами металлов вентиляционная функция легких отличалась наибольшей тяжестью бронхообструкции и скоростью снижения ОФВ1. По данным однофакторного регрессионного анализа массовая концентрация наночастиц металлов была взаимосвязана с долей «классических» моноцитов, экспрессией моноцитами рецептора CCR5 и с фенотипическими характеристиками ПХОБЛ. В свою очередь, «классические» моноциты были достоверными предикторами DLco, ФОЕ, СДЛА, воспаления с эозинофилией. Массовая концентрация наночастиц кремния была взаимосвязана с долей «неклассических моноцитов», экспрессией моноцитами рецептора CCR2, фенотипом ХОБЛ. Одновременно «неклассические» моноциты были взаимосвязаны с DLco, ОФВ1 и пауцигранулоцитарным воспалением. Особенностью ПХОБЛ в условиях воздействия аэрозолей, содержащих наночастицы кремния, является повышенная частота выявления бронхоэктазов по сравнению с больными ПХОБЛ в условиях воздействия наночастиц металлов и курильщиками табака. Найдены взаимосвязи уровня моноцитов крови у больных ПХОБЛ и тяжести бронхообструкции по классификации GOLD. Показано, что уровень классических CD14+CD16- моноцитов при ПХОБЛ от воздействия аэрозолей, содержащих наночастицы металлов, уровень неклассических CD14DimCD16+ моноцитов при ПХОБЛ от воздействия аэрозолей, содержащих наночастицы кремния, не зависел от ОФВ1, что определяет перспективы применения данного показателя для ранней диагностики ПХОБЛ. Проведена оценка функциональных маркеров риска развития ХОБЛ у работающих в условиях воздействия наночастиц металлов и пыли. В обеих группах с наличием ХОБЛ были ассоциированы скорость снижения ОФВ1, DLco/Va, скорость снижения дистанции теста шестиминутной ходьбы. Таким образом, оценка динамики функции легких является перспективным маркером группы риска ХОБЛ, нуждающейся в более активном наблюдении. Разработана методика АЭС-ИСП определения 34 элементов-примесей в субстратах легочных тканей. Анализ легочных тканей мышей после интраназального введения угольной пыли с размером частиц <50мкм позволил обнаружить содержание 20 микроэлементов, включая такие тяжелые металлы, как Ba, Cd, Cr, Sn, Sr и Ti на уровне n.10-5 - n.10-6 % мас. На основании полученных данных сделан предварительный вывод о том, что при интраназальном введении мелкой фракции угольной пыли в легочные ткани мышей проникают такие токсичные металлы, как Cd, Cr и Sn. Проведен анализ эффективности удаления из воздуха НЧ, относящихся к диапазону более 100 нм, с помощью различных фильтров, полученных путем иммобилизации соединений металлов или одностенных углеродных нанотрубок. Показано, что максимальная эффективность фильтрации до 99,99% НЧ наблюдалась при применении защитных систем на основе одностенных углеродных нанотрубок.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Подтверждена роль TIMP1 как одного из мастер-регуляторов воспаления и потенциальной мишени в противовоспалительной терапии. Показано, что полностью модифицированная siРНК снижает уровень мРНК Timp1 в LPS-активированных макрофагах до уровня в покоящихся клетках. Впервые показана возможность снижения уровня экспрессии провоспалительного цитокина Il6, с помощью siРНК-опосредованного подавления экспрессии Timp1. Другими словами, Timp1 является одним из регуляторов воспалительного процесса и перспективной мишенью для его подавления. Показано, что siРНК, направленная к гену Timp1, эффективно подавляет ЛПС-индуцированное воспаление легких in vivo: siTimp1_2m/2X3-DOPE снижая уровень экспрессии TIMP1 на 25% вызывает 2.5-кратное подавление уровня патологических изменений в легких и значительно снижает тяжесть острого воспаления легких. Обнаружено, что среди первых соседей гена Timp1 в генных сетях значительную часть составляют гены матриксных металлопротеиназ (Mmps), которые представляют значительную часть интерактома Timp1 и связаны с ним прямыми функциональными связями. Показано, что из всех проанализированных Mmps, только Mmp3 и Mmp7 характризуются профилем экспрессии наиболее близким к Timp1, тогда как профили экспрессии Mmp8, Mmp9 и Mmp14 были менее схожи с профилем Timp1 Анализ влияния состава катионных липосом на биологическую активность доставляемой ими siРНК в печени и легких здоровых мышей показал, что в печени наибольшее биологическое действие оказывает siРНК в комплексе с липосомами P1500* и 2X3-DOPE. Показано, что несмотря на эффективное накопление в легких липосом diP1500, биологическое действие комплексов anti-TIMP1-siРНК/diP1500 было незначительным, в то время как наилучшие результаты (17,7 и 20% ингибирование, соответственно) показали комплексы anti-TIMP1-siРНК с липосомами P1500* и P2000. Валидация биологической активности разработанных миРНК-направленных препаратов – антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих N-мезилфосфорамидные (мезильные, µ-) модификации межнуклеотидных связей (µ-ON) и направленных к миРНК-21, миРНК-17 и миРНК-155, показала, что µ-ON-опосредованное снижение уровня миРНК в опухолевых клетках является специфическим, перекрестного влияния на уровень других миРНК выявлено не было, и способствует опосредованному воздействию на уровни мРНК и белков, являющихся мишенями этих миРНК. Показано, что µ-ON в составе парных комбинаций значительно более эффективно подавляют пролиферативные и миграционные свойства клеток меланомы В16, чем по отдельности; при этом биологические эффекты различных пар олигонуклеотидов (µ-17-ON/µ-155-ON, µ-21-ON/µ-155-ON и µ-21-ON/µ-17-ON) проявляет разный характер взаимодействий (аддитивное действие, синергизм или антагонизм). Для пар µ-21-ON/µ-155-ON и µ-21-ON/µ-17-ON обнаружено синергическое ингибирование роста клеток B16 во всем диапазоне концентраций 0 – 100 нМ, а устойчивый синергизм наблюдается уже при концентрации каждого µ-ON 25 нМ. Показано, что полихимиотерапии (ПХТ, включающей циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизолон) в 2 раза замедлят рост лекарственно устойчивой лимфосаркомы RLS40 у мышей, тогда как монотерапия µ-21-ON приводит к 3-кратному подавлению, а коктейль µ-21-ON/µ-17-ON/µ-155-ON вчетверо замедляет рост опухоли. При этом в опухоли происходит снижение пролиферативной активности клеток (число митозов) в 1.8- (ПХТ), 4- (ПХТ+µ-21-ON), 18 (µ-21-ON) и 230 (тройной коктейль) раз по сравнению с контролем. Более того, терапия с использованием µ-ON-21 или тройного коктейля приводит к снижению % MDSC в селезенке животных до уровня здоровых животных (5.8 и 2.2%, соответственно). Таким образом, можно заключить, что миРНК-направленные µ-ON обеспечивают выраженный противоопухолевый эффект, который сочетается с низкой токсичностью, эффективным гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием этих соединений. Жизнеспособность клеток меланомы В16 снижается в 15 раз по сравнению с контролем под действием комплексов иммуностимулирующей РНК (исРНК) – катионные липосомы 2X3-DOPE, при этом наблюдается 5 – 7 кратное увеличению уровня мРНК Pkr - маркера стимуляции системы врожденного иммунитета. Внутривенное ведение комплексов исРНК/2X3-DOPE и исРНК/P2000 вызывало 2-кратное снижение массы опухоли меланомы B16 по сравнению с контролем, в то время как значительного снижения массы опухоли лимфосаркомы RLS40 не наблюдалось. Кроме того, терапия с использованием комплексов исРНК/2Х3-DOPE и исРНК/Р2000 приводит к 2-кратному уменьшению объемной плотности общих деструктивных изменений в паренхиме печени по сравнению с контролем (животные, не получавшие лечение). Установлено, что солоксолон метил (SM) способен блокировать развитие острого повреждения легких, оказывая цитопротекторный эффект в отношении пневмоцитов и ингибируя ферментативную активность тромбина. Установлено, что экспрессионные профили Mmp3, Mmp7, Mmp9 и Mmp13 можно использовать в качестве генных сигнатур для диагностики злокачественной трансформации тканей кишечника на фоне колита. Показана трансляционная связь между хабовыми генами (С3, Tyrobp, Timp1, Adam8, Mmp3, Mmp7, Mmp9, Mmp13), выявленными у мышей с колитом и колит-ассоциированных раком, и воспалительными заболеваниями кишечника и аденокарциномой легких у человека. С помощью глубокого биоинформатического анализа выявлены новые потенциальные мастер-регуляторы эпителиально-мезенхимального перехода пневмоцитов ADAMTS6 и JUND. Проведенный анализ выявил коллаген IV типа в качестве нового потенциального биомаркера раннего фиброза легких. Методом многофакторного логистического регрессионного анализа с последовательным включением факторов в модель, определены наиболее значимые факторы прогноза ПХОБЛ. Помимо молекулярных факторов, в анализ были включены параметры – доля классических, промежуточных и неклассических моноцитов. Показано, что перспективными дополнительными маркерами диагностики ПХОБЛ от воздействия аэрозолей с наночастицами металлов являются сывороточные концентрации IL5, PIIINP, ММР-9, с наночастицами кремния – сывороточные концентрации FGF 2, sVCAM, PIIINP, ММР-9. Показано, что при значении решения уравнения, равном 0.364 и более, диагностическая чувствительность метода составляет 93.5 %, специфичность – 89.2 %. Площадь под кривой чувствительность-специфичность равняется 0.95, 95% ДИ 0.93 – 0.99, р<0,001. Проверка по методу Хосмера-Лемешова показала достаточную согласованность модели, χ2=2.5, р=0.95. Исходя из результатов исследования фенотипа и эндотипа ПХОБЛ в условиях воздействия аэрозолей с наночастицами сформулированы рекомендации по профилактике. Анализ эффективности базисной терапии у больных ПХОБЛ в реальной клинической практике показал, что в подгруппе подвергавшихся воздействию наночастиц металлов терапия ингаляционными глюкокортикоидами (ИГКС) уменьшала вероятность обострений на 81%, а при формировании ПХОБЛ в условиях воздействия наночастиц кремния ИГКС не влияли на вероятность обострений. В группе сравнения ИГКС также были фактором, снижающим вероятность обострений. Оценка воздействия наночастиц как предикторов обострений ХОБЛ на фоне терапии ИГКС показала, что факт формирования заболевания в условиях воздействия наночастиц металлов увеличивал вероятность обострений на 24%, факт воздействия наночастиц кремния – увеличивал вероятность обострений на 63%. Охарактеризованы 10 образцов пылей (УП), выделенных с фильтров воздуховодов действующих шахт Кемеровской области. Изучен гранулометрический состав УП, показано, что наиболее опасная для человека фракция размером <30 мкм не превышает 0,045 % от общей массы образцов Важным итогом данного исследования можно считать обнаружение во всех образцах УП марганца, поскольку соединения марганца являются сильными ядами с выраженным кумулятивным эффектом. Фазовый состав минеральных включений состоит в основном из оксидов, силикатов и алюмосиликатов.