Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведены подготовительные работы для изучения влияния ротационной и трансляционной ориентации сайтов связывания в составе нуклеосомной ДНК на эффективность и скорость связывания белка p53. На основе нуклеосом-позиционирующей последовательности s603-42А были разработаны и получены две ДНК-матрицы (R11 и R16), содержащие канонический сайт связывания p53 в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК. Каждая ДНК-матрица содержит две флуоресцентные метки: Cy3 в положении +67 п.н. и Cy5 в положении +150 п.н., которые необходимы для структурных исследований методом spFRET микроскопии. Разработаны методики сборки нуклеосом на полученных ДНК-матрицах и их очистки. Получены и охарактеризованы различными методами чистые (>90%) препараты нуклеосом. Разработана методика изучения связывания p53 с полученными нуклеосомами R11 и R16, а также со свободной ДНК. Проделанная за отчетный период работа является надежной основой для проведения структурных исследований, запланированных на следующие этапы проекта. Для определения механизма действия фактора FACT (дрожжевого и человеческого) на структуру нуклеосом были синтезированы ДНК-матрицы s603 c флуоресцентными метками Cy3-Cy5, ковалентно пришитыми в проксимальном, медиальном и дистальном положениях на нуклеосомной ДНК. C использованием октамеров гистонов Xenopus laevis были собраны строго позиционированные нуклеосомы. Проведен анализ структуры дрожжевого белка FACT и разработан дизайн мутантов для изучения роли С-концевых доменов комплекса в разворачивании нуклеосомы. Наработаны и очищены белки, необходимые для последующих экспериментов. Разработан подход для изучения интермедиатов разворачивания нуклеосом дрожжевым фактором yFACT с использованием методов электронной микроскопии. С помощью этого подхода изучен процесс разворачивания нуклеосомы фактором yFACT. Показано, что yFACT способен полностью разворачивать нуклеосомную ДНК с физическим разделением гистонов. Для изучения влияния модификаций гистонов на реорганизацию нуклеосом фактором FACT были получены ДНК-матрицы 603 с флуоресцентными метками Су3 и Су5 в положениях 35 и 112 п.н. Получены рекомбинантные дрожжевые гистоны дикого типа, а также гистоны H2A.Z и H3K56Q. Собраны гистоновые октамеры следующих типов: октамеры, содержащие интактные гистоны H2A, H2B, H3 и Н4; октамеры, содержащие гистон H2A.Z; октамеры, содержащие H3K56Q; октамеры, содержащие H2A.Z и H3K56Q. Эти октамеры гистонов были использованы для сборки серии флуоресцентно-меченых нуклеосом, отличающихся по составу гистонов. Проверено качество сборки нуклеосом и их пригодность для дальнейших структурных исследований, запланированных на последующие этапы проекта. Разработаны методики формирования всех видов субнуклеосом и полных нуклеосом и их транскрипции РНК полимеразой 2. Впервые показано, что дрожжевой фактор FACT значительно облегчает транскрипцию мононуклеосом РНК полимеразой 2 in vitro. Удаление каждого из С-концевых участков субъединиц фактора FACT приводит к существенному снижению эффективности действия фактора при транскрипции нуклеосом, но эффект удаления С-концевого участка Spt16 более выражен. Полученные данные подтверждают и позволяют уточнить модель FACT-зависимой транскрипции нуклеосом, предложенную нами ранее. Подготовлены материалы для экспериментов по изучению изменений в структуре октамера гистонов в процессе разворачивания нуклеосом под действием белкового фактора FACT. Получен гистон H2A(S113C), который затем был помечен по остатку С113 меткой Су5. Получены ДНК-матрицы s603, меченые Су3 в положении 13 п.н. или 57 п.н. Собраны мононуклеосомы, содержащие Су5-меченый гистон H2A и ДНК с меткой Cy3 в одном из двух положений. Предсказаны ожидаемые изменения в эффективности FRET при различных сценариях изменения в структуре октамера гистонов при разворачивании нуклеосом под действием белкового фактора FACT. В клетках насекомых SF9 был наработан и хроматографически очищен рекомбинантный димер Spt16/SSRP1. Методом электронной микроскопии макромолекул были исследованы структурные отличия между комплексами FACT дрожжей и человека в отсутствии нуклеосом. Установлено, что структура человеческого комплекса более компактная, чем дрожжевого комплекса. Таким образом, присутствие дополнительного HMGB-домена влияет на структуру комплекса, делая ее более компактной. Разработаны методы измерения квантовых выходов флуоресценции для меток при использовании малых объемов (10-30 мкл) образцов в режиме детекции одиночных молекул (концентрации менее 1 нМ). Для реализации данного метода разработано программное обеспечение с открытым исходным кодом. Разработанные методы позволили оценить изменения квантовых выходов флуоресценции меток в составе ДНК при формировании нуклеосом по сравнению с квантовыми выходами этих же меток в составе свободной ДНК. Были разработаны и получены короткие молекулы ДНК, позволяющие изучать структурные изменения в ДНК, вызванные взаимодействием с белками. Методом spFRET-микроскопии было подтверждено, что при связывании с ДНК дрожжевой белок Nhp6 – характерный представитель семейства HMGB-белков – вносит изгиб в молекулу ДНК. Продемонстрирована применимость разработанной экспериментальной модели для изучения влияния белков и других факторов на конформацию ДНК. Методом spFRET-микроскопии мононуклеосом в растворе установлено, что в присутствии 50-250 мМ КCl линкерная ДНК может принимать одно из двух конформационных состояний: «открытое» (линкеры находятся на значительном расстоянии друг от друга), или «закрытое» (линкеры сближены друг с другом на протяжении не менее 25 п.н.). Замена ионов калия на натрий приводит к увеличению расстояния между линкерами в «закрытой» конформации и уменьшает заселенность этой конформации. При увеличении концентрации КCl до 300 мМ и выше происходит увеличение расстояния между линкерами в «закрытой» конформации и снижение заселенности этой конформации. Был разработан экспериментальный подход, позволяющий вводить флуоресцентную метку в область оси симметрии нуклеосомной частицы для матриц, несущих длинные линкерные фрагменты. На основании широкого набора измеренных нами внутримолекулярных расстояний методами интегративного моделирования была построена модель, описывающая структурные особенности «закрытой» конформации линкерной ДНК. Была разработана и получена флуоресцентно-меченая ДНК-матрица для сборки динуклеосом, допускающая скольжение одной из формируемых на ней частиц. На этой ДНК-матрице были собраны динуклеосомы. Структурные особенности динуклеосом были охарактеризованы методами spFRET и электронной микроскопии. С помощью аналитической электронной микроскопии изучено кристаллическое строение и состав тонких ко-кристаллов ДНК c гистоноподобным белком Dps E.coli. Показано влияние двухвалентных катионов на стабилизацию и разрушение ко-кристаллов. Высказана гипотеза, что подобным образом белок может модулировать транскрипцию бактериальной хромосомы в клетке.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Получены новые данные о влиянии ротационной ориентации сайта связывания белка р53, расположенного вблизи входа ДНК в нуклеосому, на изменение структуры нуклеосом при взаимодействии с ДНК-связывающим доменом белка р53 (p53DBD) в растворе и в нативном геле, а также установлена обратимость этих изменений. Изменения в структуре нуклеосом в комплексе с р53, зависящие от ориентации сайта связывания, по-видимому, могут модулировать эффективность транскрипции и доступность нуклеосомной ДНК для взаимодействия с белковыми факторами. Получены флуоресцентно-меченые ДНК-матрицы с более глубоким расположением сайта связывания p53 на нуклеосомной ДНК (R21 и R26) с высоким общим выходом. Разработана методика сборки (реконституции) нуклеосом R21 и R26, содержащих одиночные сайты связывания p53 в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК. Получены очищенные препараты нуклеосом, содержащие незначительное количество свободной ДНК. Оптимизирована методика получения белка p53DBD и получен гомогенный устойчивый к агрегации белок с концентрацией 3,5 мг/мл. Отработана методика сборки комплексов р53DBD-нуклеосома с чистотой, соответствующей требованиям ПЭМ макромолекул. Были охарактеризованы изменения конформации мононуклеосом в присутствии белка-партнера Nhp6 и белкового комплекса дрожжевого FACT дикого типа или мутантных версий этого комплекса, содержащих делеции С-концевых участков субъединиц комплекса (Spt16/Pob3ΔCT, Spt16ΔCT/Pob3 и Spt16ΔCT/Pob3ΔCT). Установлено, что мутанты без обоих С-концов Spt16ΔCT/Pob3ΔCT и без одного Spt16ΔCT/Pob3 теряют способность образовывать комплекс с нуклеосомой. Потеря одного С-конца Pob3 не мешает образованию комплекса FACT-нуклеосома, однако разворачивание нуклеосомы проходит менее эффективно, чем в случае полноразмерного комплекса. Данные свидетельствуют, что С-конец Spt16 необходим для FACT-зависимого разворачивания нуклеосом, а С-конец Pob3 играет вспомогательную роль в этом процессе. Разработана оригинальная методика для изучения комплекса дрожжевого FACT с белком-партнером Nhp6 в отсутствии нуклеосом. Установлено, что каждая из субъединиц комплекса Spt16/Pob3 взаимодействует с Nhp6, и это взаимодействие происходит по С-концам субъединиц. Изучены нуклеосомы, включающие гистоновые октамеры, сшитые диметилсуберимидатом. Показано, что сшивка всех гистонов в один комплекс не вызывает изменения подвижности нуклеосом в нативном геле, что указывает на отсутствие существенных изменений в структуре нуклеосом. Изучены двумерные структуры белкового комплекса дрожжей FACT как без, так и в присутствии фактора Nhp6. Показано увеличение конформационной подвижности комплекса yFACT в присутствии Nhp6, а также увеличение доли частиц yFACT в развернутой конформации. Дифференциальные карты электронной плотности позволяют предположить, что молекулы Nhp6 присоединяются к краевым доменам yFACT. Получены нуклеосомы, содержащие дрожжевые гистоны дикого типа, а также нуклеосомы, содержащие неканонический гистон H2A.Z и мимик ацетилирования H3K56Q. Было определено, что присутствие обоих измененных гистонов сильно дестабилизирует нуклеосомы, в результате чего возрастает популяция нуклеосом с нарушенной укладкой ДНК на октамере гистонов. Таким образом, неканонический гистон H2A.Z и мимик ацетилирования H3K56Q сильно влияют на стабильность нуклеосомной структуры. Нуклеосомные и различные субнуклеосомные матрицы транскрибировались РНК полимеразой 2 (РНКП2) in vitro. Было показано, что тетрасома проходится РНКП2 значительно более эффективно, чем нуклеосома и другие субнуклеосомные комплексы. Полученные данные подтверждают предложеннyю нами гипотезу о том, что тетрасома – динамичная структура, которая эффективно проходится РНКП2. Было показано, что после инкубации в присутствии суберимидата все гистоны в октамере формируют один ковалентно сшитый комплекс; при этом подвижность нуклеосом в неденатурирующем геле не меняется. Была проведена транскрипция нуклеосом РНКП2 in vitro в присутствии тех же мутантных вариантов фактора FACT, которые были использованы для разворачивании нуклеосом этим фактором. Полученные данные подтверждают предложеннyю нами гипотезу о том, что в стимуляции транскрипции через нуклеосомы РНКП2 участвуют те же домены фактора FACT, что и при разворачивании нуклеосом этим фактором. Были отработаны методики получения комплексов FACT человека с нуклеосомами и противоопухолевыми препаратами кураксинами. Установлено, что в присутствии кураксинов yFACT приобретает способность к обратимому АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом. Кураксин-опосредованная реорганизация нуклеосом белковым комплексом yFACT является значительной и не уступает по масштабу реорганизации при участии белка-партнера Nhp6 (последняя сопровождается отворачиванием не менее 70% нуклеосомной ДНК). Аналогично, белковый комплекс FACT человека, который сам по себе не влияет на структуру нуклеосом, приобретает способность к масштабной АТФ-независимой реорганизации структуры нуклеосом в присутствии кураксинов или в присутствии белка Nhp6. Было установлено, что при разворачивании нуклеосом белковым ансамблем yFACT/Nhp6 димеры Н2A/H2B обратимо удаляются с нуклеосомальной ДНК, что не препятствует обратной сборке полной нуклеосомы при удалении yFACT/Nhp6 с нуклеосомы. Нами выдвинута гипотеза, что димеры Н2A/H2B переносятся при разворачивании нуклеосомы белковым ансамблем yFACT/Nhp6 с гистонового октамера на неструктурированные С-концевые домены субъединиц уFACT и остаются связанными, обеспечивая эффективное восстановление нуклеосом после удаления FACT. Определено строение белкового комплекса FACT человека с помощью электронной микроскопии. Показана конформационная подвижность hFACT (наличие «закрытого» и «открытого» состояний). Построена модель расположения доменов hFACT в закрытом комплексе на основе докинга атомных структур в электронную плотность. Предложено обоснование конформационной подвижности домена NTD субъединицы SPT16. Разработана методика измерения сигнала spFRET от нуклеосом и их комплексов в условиях чередующегося возбуждения донора и акцептора. Для реализации данного метода разработано программное обеспечение с открытым исходным кодом. Разработанные методы обеспечивают исследование распределения частиц не только по эффективности переноса энергии, но и по наличию флуоресцирующих донора и акцептора, позволяя исключать из анализа частицы, в которых донор или акцептор находятся в долгоживущем нефлуоресцирующем состоянии. Создана экспериментальная система для изучения структурных изменений, происходящих в ДНК при связывании белка р53 методом spFRET-микроскопии. Показано, что при связывании домен DBD белка р53 вносит изгиб в молекулу ДНК. Получены интегративные молекулярные модели изменения геометрии олигонуклеотидов ДНК при связывании белков Nhp6 и р53 (на примере домена DBD). Разработана методика электронной микроскопии, позволяющая с высоким разрешением выявлять компактизованную ДНК на срезах клеток. Методика была опробована на клетках прокариот: выявлены новые структуры, имеющие сходную с нуклеосомами морфологию, в клетках бактерий, подверженных стрессу. Высказано предположение, что они, так же как и нуклеосомы эукариот, являются промежуточными в процессе конденсации хроматина и защищают ДНК от повреждений. Разработана методика для определения влияния повреждений на гибкость молекулы ДНК. Механическая релаксация ДНК имеет важное биологическое значение для процессов транскрипции и репликации ДНК. Установлено, что делеции в хвостах гистонов Н2А и Н2В не влияют на структуру ДНК в коровой области нуклеосомы. Было определено, что участок 1-31 а.о. гистона Н2В (но не гистона Н2А) играет важную роль в стабилизации структуры нуклеосомного ядра, указывая, что структурно схожие гистоны Н2А и Н2В отличаются по своей роли в поддержании стабильности нуклеосом. Установлено, что хвосты гистонов Н2А и Н2В существенно влияют на конформацию линкерных фрагментов ДНК, удерживая их в сближенном состоянии. Показано, что хвосты гистонов Н2А и Н2В помогают линкерному гистону Н1 формировать стержень-подобную структуру линкерных фрагментов ДНК, и вследствие этого важны для эффективной и правильной компактизации нуклеосом при образовании фибрилл. Методами spFRET анализа, электронной микроскопии с негативным контрастированием и интегративного моделирования показано, что расстояния между мононуклеосомами в динуклеосоме изменяются скачком, с приращением ~10 п.н. (примерно один оборот двойной спирали ДНК). Таким образом, при вынужденном «столкновении» двух нуклеосом на ДНК может происходить ступенчатое отворачивание от 10 до 30 п.н. нуклеосомной ДНК от гистонового октамера. Полученные данные позволяют предположить, что динуклеосомы – динамические, асимметрично разворачивающиеся комплексы, имеющие вариабельную структуру. На примере природного пептида LANA, участвующего в интеграции генома герпесвируса человека 8 типа, проведены эксперименты по подбору условий формирования комплекса LANA с нуклеосомами и разработке методических подходов к определению константы связывания природного пептида LANA с нуклеосомами по подвижности комплексов методом гель-электрофореза.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Методами FRET в геле получены данные об изменении структуры нуклеосом R21 и R26 (сайты связывания белка p53 в положениях +21 и +26 п.н. от границы нуклеосомы) в комплексе с ДНК-связывающим доменом белка р53 (p53DBD). Охарактеризовано влияние ротационной ориентации сайта связывания белка p53DBD в составе нуклеосомы на эффективнось образования комплексов и их структуру. Методом футпринтинга с ДНКазой I были дополнительно охарактеризованы структуры нуклеосом R11 и R16 (центры сайтов связывания р53 в положениях +11 и +16 п.н.) в комплексе с p53DBD. Разработана методика получения флуоресцентно-меченых в области линкеров нуклеосом (NuR11-187 и NuR16-187) с различным расположением сайта связывания белка p53 на нуклеосомной ДНК. Оптимизирована методика получения комплексов белка p53DBD c этими нуклеосомами. Методами FRET в геле получены данные об изменении структуры нуклеосом в комплексе с p53DBD, установлена обратимость этих изменений. Получены данные о взаимодействии белка p53DBD с линкерной областью нуклеосом NuR11-187 и NuR16-187. Разработана методика, позволяющая анализировать взаимодействия белка p53DBD с нуклеосомами NuR11-187 и NuR16-187 в присутствии гистона H1. Получены новые данные о взаимодействии белка p53DBD и гистона H1. Исследована зависимость реорганизации нуклеосом шапероном гистонов FACT от присутствия в нуклеосомах химически-индуцированных ковалентных связей между гистонами. Было обнаружено, что дрожжевой FACT (yFACT) в присутствии фактора Nhp6 способен реорганизовывать нуклеосомы с искусственно усиленными гистон-гистоновыми взаимодействиями; охарактеризована эффективность этого процесса. Изучены двумерные структуры комплекса мутантного уFACTPob3dCT в различных конформациях. Обнаружено, что мутантный yFACT образует комплексы с нуклеосомой менее эффективно, чем интактный FACT. Определена роль домена Pob3-CTD в разворачивании нуклеосомы белковым фактором yFACT. Изучена зависимость эффективности реорганизации нуклеосом шапероном гистонов FACT от наличия в составе нуклеосомы вариантного гистона H2A.Z и ацетилированного гистона H3K56. Были получены три типа мононуклеосом с различным составом дрожжевых гистонов: помимо канонических гистонов в нуклеосомах присутствовали H2A.Z или миметик ацетилирования H3K56Q. Обнаружено, что введение таких гистонов в состав мононуклеосом существенно влияет на эффективность их реорганизации шапероном гистонов FACT. Обнаружены различия в диссоциации FACT из комплексов с разными типами нуклеосом. Cпособность кураксина CBL0137 дестабилизировать ДНК-гистоновые связи внутри нуклеосомы была исследована с использованием нуклеосом, содержащих флуоресцентную метку Су3 на ДНК-матрицах и флуоресцентную метку Су5 на гистоне Н2A с единичной аминокислотной заменой S113C. Анализ комплексов кураксин-нуклеосома методом spFRET микроскопии позволил заключить, что кураксин вызывает масштабное отворачивание нуклеосомной ДНК от октамера гистонов с сохранением структуры самого октамера и его взаимодействия с нуклеосомной ДНК. Изучены двухмерные структуры фактора FACT человека в апо-форме и его комплекса с нуклеосомой. Установлено расположение домена NTD-SPT16 в составе компактной формы hFACT. Предложена модель конформационной перестройки hFACT, происходящей при связывании этого белкового фактора с нуклеосомой, в основе которой лежит согласованное перемещение четырех доменов hFACT. Сделан вывод о том, что закрытый комплекс hFACT-нуклеосома удерживается консервативными взаимодействиями hFACT с ДНК и гистонами. Метод spFRET-микроскопии в геле апробирован для изучения локальных изменений в структуре ДНК при связывании белков. Сделан вывод, что в некоторых случаях (короткие фрагменты ДНК, наличие комплексов различной стехиометрии) такой подход оказывается наиболее информативным и предпочтительным. Этим методом была охарактеризована структура двух ДНК-белковых комплексов. Получены данные об отличиях конформации линкерного участка нуклеосомной ДНК, расположенного вблизи диадной оси нуклеосомы для нуклеосом, собранных с использованием гистонов G. gallus дикого типа и рекомбинантных гистонов X. laevis дикого типа. Установлено, что удаление N-концевого фрагмента гистона H2B X.laevis (Δ1-31) не оказывает влияния на конформацию линкерного участка нуклеосомной ДНК в области, отстоящей от границы нуклеосомы на 10 п.н. Вероятной причиной формирования конформации с большим расстоянием между линкерами для нуклеосом, собранных с применением мутантных димеров Н2А/H2BΔ1-31 и (глобулярный домен Н2А)/H2BΔ1-31, являются изменения в межлинкерном взаимодействии, вызываемые мутацией H2BΔ1-31. Синтезирован Су5-меченый природный пептид CENP-C 426–537 (далее CENP-C), взаимодействующий с нуклеосомами. Разработаны и оптимизированы методы определения константы связывания пептидов с нуклеосомами на основе метода гель-электрофореза с учетом неспецифических взаимодействий. Определены константы связывания пептидов CENP-C и LANA c нуклеосомами, установлено, что они находятся в субмикромолярном диапазоне. Пептид CENP-C по нашим данным обладает более высокой аффинностью к нуклеосомам, что может объясняться наличием дополнительных отрицательно заряженных аминокислот, взаимодействующих с гистоновым октамером вне кислотного лоскута. Была определена зависимость константы диссоциации комплексов пептид-нуклеосома от ионной силы раствора. Было показано, что связывание пептидов LANA и CENP-C влияет как на структуру нуклеосомы, так и на разворачивание нуклеосомы фактором FACT (в небольшой степени), а также приводит к стабилизации структуры нуклеосомы при ее восстановлении после диссоциации FACT.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Продолжено изучение взаимодействия онкосупрессора р53 с хроматосомой – комплексом нуклеосомы и линкерного гистона Н1.0. Определены условия для получения стабильных супрамолекулярных ДНК-белковых комплексов. Структурные изменения в нуклеосомной ДНК, сопровождающие связывание хроматосом с р53, охарактеризованы методом футпринтинга ДНК с использованием ДНКазы I. На основе компьютерного анализа были отобраны три пептида FN, FL и TG, нацеленные на взаимодействие с кислотным лоскутом (аcidic patch) димера гистонов H2A-H2B. Показано, что пептид FL не влияет на структуру нуклеосом и ингибирует нуклеосом-ремоделирующую активность белкового фактора FACT дрожжей (yFACT), а пептид TG дестабилизирует нуклеосомы, но не влияет на активность yFACT. Пептид FN обладает сразу двумя свойствами природных пептидов LANA и CENP-C, взаимодействующих с кислотным лоскутом нуклеосом: он способен стабилизировать структуру нуклеосом и ингибирует нуклеосом-ремоделирующую активность белкового фактора yFACT. Пептиды FL и FN, как ингибиторы про-опухолевого фактора FACT, выгодно отличаются от природных пептидов LANA и CENP-C: они короче, обладают меньшим общим положительным зарядом, что способствует снижению их неспецифических взаимодействий, и являются патентно-пригодными. Разработана экспериментальная система, позволяющая изучать структурные перестройки в тетрасомах по изменению расстояния между соседними супервитками ДНК в тетрасоме методом spFRET микроскопии. Установлено, что комплекс yFACT в присутствии белка Nhp6 способен вызывать обратимые АТФ-независимые масштабные изменения в структуре тетрасом, не сопровождающиеся диссоциацией тетрамера гистонов от тетрасомной ДНК. Предложена модель структурных изменений в тетрасоме под действием yFACT. Обратимая реорганизация тетрасом комплексом yFACT, предположительно, облегчает работу полимераз во время транскрипции и репликации, сопровождающуюся образованием субнуклеосом – гексасом и тетрасом, позволяя при этом сохранить структуру хроматина после завершения данных процессов. На основании полученных нами экспериментальных данных предложен механизм разворачивания нуклеосомы белковым комплексом yFACT. Установлено, что в процессе взаимодействия yFACT с нуклеосомой образуется ряд комплексов, отличающихся по степени раскручивания нуклеосомной ДНК, а HMGB-белок, Nhp6, играет несколько различных ролей в процессе взаимодействия yFACT с нуклеосомой. Изучены особенности реорганизации нуклеосом, содержащих вариантный гистон H2A.Z и миметик ацетилирования H3K56Q, шапероном гистонов FACT дрожжей (yFACT). Обнаружено, что ремоделирование H2A.Z/H3K56Q-содержащих нуклеосом белковым комплексом yFACT происходит менее эффективно, чем H3K56Q-содержащих нуклеосом, однако более эффективно, чем H2A.Z-содержащих или канонических нуклеосом. Обнаружены различия в диссоциации yFACT из комплексов с разными типами нуклеосом: H2A.Z и H3K56Q как по отдельности, так и вместе снижают вероятность восстановления исходной структуры нуклеосом после их ремоделирования комплексом yFACT. Установлено, что присутствие в составе нуклеосом вариантного гистона H2A.Z и миметика ацетилирования H3K56Q увеличивает до 25% долю ремоделированных нуклеосом, разрушающихся с высвобождением нуклеосомной ДНК после диссоциации ремоделера yFACT. Получены данные об образовании комплексов HMGB-содержащих регуляторных белков HMO1 и HMGB1 с нуклеосомами и охарактеризованы изменения в структуре нуклеосомных частиц, вызываемые данными взаимодействиями. Установлено, что HMO1, связываясь с нуклеосомами, вносит изменения в укладку суперспиральных витков ДНК в коровой области нуклеосом и разводит в пространстве спирали линкерной ДНК как в нуклеосомах, так и в хроматосомах. Доказано, что HMO1 способствует обратимой АТФ-независимой реорганизации нуклеосом белковым комплексом yFACT, однако с меньшей эффективностью, чем белок Nhp6. Показано, что HMGB1 образует комплексы только с нуклеосомами, имеющими линкерную ДНК, и не вносит изменений в конформацию нуклеосомной ДНК. HMGB1 способствует связыванию фактора FACT человека с нуклеосомами, но не способствует АТФ-независимой реорганизации нуклеосом данным фактором. Определено влияние сшивок гистонов в нуклеосоме на высоту нуклеосомного барьера. Определено влияние вариантного гистона Н2АZ и ацетилирования Lys56 гистона Н3 на FACT-зависимую и FACT-независимую транскрипцию хроматина. Полученные данные позволяют предположить механизмы действия вариантного гистона Н2АZ и ацетилирования Lys56 гистона Н3 при транскрипции хроматина РНК полимеразой 2. Изучено строение белкового фактора FACT человека (hFACT) и комплексов hFACT c нуклеосомой в присутствии противоопухолевого агента кураксина с помощью электронной микроскопии и обработки изображений. Получены 2D и 3D реконструкции ряда конформационных состояний изолированного hFACT и комплекса hFACT с нуклеосомой и кураксином. В реконструкциях впервые выявлено положение домена Spt16-NTD фактора hFACT. Подтверждено разворачивание нуклеосом фактором hFACT в присутствии кураксина. Предложен механизм кураксин-зависимого разворачивания нуклеосом белковым фактором hFACT.