Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году был проведен сбор морских свободноживущих нематод на Беломорской биологической станции им. Н.А.Перцова МГУ. Собраны и зафиксированы RNAlater (для сохранения РНК) , а также этиловым спиртом следующие виды свободноживущих морских нематод: Paracanthonchus caecus (семейство Cyatholaimidae) в количестве 40 экз., Halichoanolaimus robustus (семейство Selachinematidae) – две пробы в количестве 20 экз. и 30 экз., Richtersia inaequalis (семейство Richtersiidae) – две пробы в количестве 30 экз. каждая, Metachromadora vivipara (семейство Desmodoridae) – 50 экз., Monoposthia costata (семейство Monoposthiidae) – 50 экз., Odontophora sp. (семейство Araeolaimidae) – две пробы по 10 экз. При вскрытиях позвоночных и беспозвоночных хозяев были найдены и фиксированы этиловым спиртом 80% или заморожены при -70°С паразитические нематоды беспозвоночных животных: оксиуриды рода Severianoia от многоножек Pachyiulus krivolutskii, нематоды родов Heth и Rhigonema от вьетнамских многоножек-спироболид, теластоматиды Gryllophila skrjabini от медведки обыкновенной (Gryllotalpa gryllotalpa). Также собирали и вскрывали тараканов, что позволило собрать материал по теластоматидам Blatticola blattae от рыжих тараканов и Cranifera craniifer от тараканов рода Blaberus. При вскрытии лабораторных белых мышей были собраны оксиуриды Syphacia. Проведен сбор и фиксация аскаридид Contracaecum от рыбоядных птиц. Из замороженных образцов внутенних органов различных позвоночных были собраны крупные нематоды Dictyocaulus spp. из легких оленя и нематоды рода Trichinella из мышц различных хищных Дальнего Востока. ДНК получали с помощью набора QIAamp DNA Micro из всей пробы собранных нематод. Для нематод рода Heth проводилось раздельное выделение из стенки тела и только половой трубки. Из выделенной и амплифицированной ДНК были сконструированы библиотеки для дальнейшего чтения на секвенаторе второго поколения Illumina Hiseq 4000. Тотальную РНК выделяли с помощью набора Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, и после приготовления библиотеки кДНК готовили с помощью набора SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing (Clontech). Библиотеки секвенировали на геномном секвенаторе Illumina Hiseq 4000 в режиме парно-концевого прочтения. После фильтрации по качеству, из оставшихся чтений были удалены адаптеры от синтеза кДНК и сиквенсные адаптеры путем обработки программой Trimmomatic. Сборка транскриптомов была произведена программой Trinity. Полноту представленности кодируемых пептидов оценивали согласно сравнению со списком консервативных белков по BUSCO. В ходе исследования эволюционных адаптаций нематод к разным условиям жизни, включая паразитизм, было проведено исследование лиганд-зависимых ионных каналов с цистеиновой петлёй (cys-loop receptors) с помощью методов биоинформатики. С помощью программ HMMER (http://hmmer.org/), PFAM (https://pfam.xfam.org/) и при помощи алгоритма BLAST нами найдены и собраны в общую базу белки этого семейства из всех нематод с доступными базами данных. Полученные данные дополняют представления о разнообразии cys-loop рецепторов животных. Проведена полногеномная амплификация с помощью набора REPLI-g MIDI Kit материала по половым трубкам и стенке тела нематод рода Heth. Эту амплифицированную и нативную ДНК использовали для конструирования библиотек, которые были прочтены на платформе Illumina Hiseq 4000. Полученные последовательности были картированы на референсные митохондриальные геномы филогенетически близких нематод – Rhigonema thysanopora и Ascaris suum. Выявлена неравномерность распределения полученных прочтений по длине митохондриального генома. Для выявления среди представителей животного мира форм близких к предковым для всего типа Nematoda, было проведено полное геномное секвенирование и аннотация белков представителей типа Nematomorpha, как организмов по общему плану строения сходных с нематодами. В рамках выполняемого проекта было проведено и опубликовано исследование митохондриального генома нескольких видов Nematomorpha. Не выявлено очевидных признаков сходства нематод с волосатиками, но в процессе работы были обнаружены необычные точные длинные палиндромные последовательности длиной до ~250 нуклеотидов внутри кодирующих белки последовательностей митохондриальной ДНК. Такие палиндромы были найдены в семи типах митохондриальных генов четырех видов волосатиков, и существование этих палиндромов было подтверждено несколькими экспериментальными методами. Белки, кодируемые такими последовательностями, консервативны, что предполагает, что отбор одновременно сохраняет основу их аминокислотной последовательности и в то же время создаёт и поддерживает палиндромы в кодирующей их ДНК. Ещё более удивительно, что некоторые белки, кодирующие ДНК волосатиков, содержат не один, а два перекрывающихся палиндрома. Насколько нам известно, ничего подобного ранее не наблюдалось ни в митохондриальных, ни в ядерных генах. Наше открытие предполагает возможность существования нового неизвестного механизма геномной регуляции у животных. В соответствии с планами публикация по результатам изучения волосатиков были опубликована в журнале входящем в Q1.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На Белом море были собраны свободноживущие морские нематоды семейств Comesomatidae и Xyalida. Из них, а также из образцов Campydora demonstrans и Xenella sp. сбора прошлого года были подготовлены геномные библиотеки и осуществлено полногеномное секвенирование на платформе Illumina NextSeq. Был собран и аннотирован митохондриальный геном Campydora demonstrans. Для представителей Comesomatidae и Xyalida было проведено изготовление библиотек кДНК и дальнейшее секвенирование на платформе Illumina NextSeq. На крупных самках нематод-оксиурид Gryllophila skrjabini и Leidynema spp., паразитирующих в в задней кишке насекомых была отработана методика анатомирования, с отделением средней кишки и половых трубок. Для геномных исследований были отобраны 4 вида нематод рода Leidynema и 2 вида нематод рода Hammerschmidtiella (семейство Thelastomatidae). Из выделенной ДНК были сконструированы библиотеки для дальнейшего чтения на секвенаторе второго поколения Illumina NextSeq. Удалось получить полные митохондриальные геномы для трех видов Leidynema и для двух видов нематод рода Hammerschmidtiella. Были обработаны геномные данные по оксиуридам, паразитирующим в задней кишке прямокрылых: нематодам родов Singhiella и Chitwoodiella из задней кишки вьетнамских медведок Gryllotalpa africana, и Gryllotalpa gryllotalpa из Краснодарского края. Впервые методами полногеномного секвенирования были исследованы нематоды рода Synoecnema из полости тела дождевых червей сем. Megascolecida (Вьетнам), и нематоды рода Dicelis от дождевых червей сем. Lumricidae средней полосы России. Для всех из них были получены и аннотированы митохондриальные геномы. Собранные и аннотированные митохондриальные геномы подтвердили гипотезу, что у большинства нематод класса Chromadoria гены всегда располагаются на одной цепи. Было проведено выделение РНК из половых трубок нематод Syphacia, Toxocara и Leidynema, дальнейшее конструирование библиотек и секвенирование. Было получено 20-25 млн. парноконцевых чтений для каждой библиотеки. С целью поиска новых доступных объектов для геномных исследований была изучена таксономическая принадлежность аскаридид рода Contracaecum – паразитов птиц и млекопитающих, развивающихся в водных экосистемах. Продолжено изучение адаптаций связанных со средней кишкой энтомопатогенной нематоды Heterorhabditis megidis. В 2020 году был проведен анализ функционирования средней кишки в разных группах свободноживущих и паразитических нематод, в том числе наличия у них дефекационной моторной программы (ДМП). Анализ связанных с ДМП генов (таких как гомологи PBO-5/PBO-6, NLP-40, AEX-2 и EXP-1) у разных нематод, включая данные, полученные в данном проекте, позволил предположить, что ДМП возникла у общего предка нематод, поскольку набор связанных с ДМП генов обнаруживается уже у базальной группы нематод – эноплид, но не отмечен за пределами класса нематод (у других Ecdysozoa). На основе предложенного нами модельного организма Heterorhabditis megidis мы разработали экспериментальную систему для исследования распространяющегося некротического сигнала смерти в кишке нематоды, позволяющую использовать стандартные методы электрофизиологии. Представляется важным проверить полученные нами для Heterorhabditis данные на других крупных рабдитидах. Для проверки полученных данных на других рабдитидах мы выбрали нематод рода Steinernema для дальнейшей работы и провели сравнение представителей этого семейства из России и южной части Италии.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Были получены геномные данные по двум видам свободноживущих морских нематод из Белого моря: Thoracostomopsis barbata (семейство Thoracostomopsidae) и Thoracostoma sp. (семейство Leptosomatidae), а также по двум паразитическим морским нематодам: Marimermis maritima и Aborjinia sp. Ранее два этих вида паразитических нематод рассматривали как близкородственные формы и относили к отдельному отряду Marimermithida. Наши исследования 2021 года показали, что представители этих двух родов маримермитид хоть являются родственными, но не образуют монофилетической группы. Более того, изученный нами вид Marimermis maritima образовывал на полученных филограммах единую группу (был в «сестринских» отношениях) с видом свободноживущих нематод Thoracostomopsis barbata (семейство Thoracostomopsidae), а изученный нами вид Aborjinia sp. предсказуемо образовывал единую группу с изученным ранее видом Aborjinia corallicola. Два эти вида рода Aborjinia объединялись с изученными к настоящему времени видами семейство Leptosomatidae, и, в том числе, исследованными нами в 2021 году видами рода Thoracostoma. Таким образом переход к паразитизму на беспозвоночных животных происходил у свободноживущих морских нематод по крайней мере дважды даже в пределах только эноплид (Enoploidea). Также можно сделать вывод о необоснованности выделения морских паразитических нематод в отдельный отряд Marimermithida. Выделение и изучение ДНК и РНК от паразитических нематод лошадей Parascaris equorum дало около 30 млн. парно-концевых чтений для каждой из библиотек и позволило выявить в транскриптоме около 24 тысячи кодируемых белков. Был произведен поиск ортологичных генов для проведения сравнения полученных от Parascaris данных с белками от нематод рода Toxocara и данными по Ascaris suum и Сaenorhabditis elegans. Для поиска ортологов и паралогов использовали алгоритм BLAST, запуская белковые последовательности сравниваемых нематод друг против друга, а также программный пакет OrthoFinder2. Все полученные последовательности были просканированы на кодирующие области с помощью TransDecoder (http://transdecoder.sf.net). Идентифицированные белки были затем дополнительно охарактеризованы на основе сходства последовательностей с последовательностями из баз данных Uniref90 и SwissProt с использованием Blast. На основании сходства транскрипты были аннотированы с помощью GO, Kegg и EggNOG. HMMER и база данных Pfam использовались для идентификации белковых доменов. Для выяснения элементов строения сократительной средней кишки оксиурид была осуществлена двойная окраска препаратов кишки на клеточные ядра и сократительные элементы (актин). В передней и средней части кишки хорошо идентифицируются ядра кишечного эпителия и мышечные сократительные элементы, расположенные на поверхности кишки со стороны первично полости тела нематоды. При этом в средней части кишки не удается обнаружить ядер клеток, связанных с мышечными сократительными элементами. Таким образом, у оксиурид мышечные сократительные элементы средней кишки образованы клетками, расположенными в хвостовой части тела. В 2021 году были продолжены исследования сравнительной биологии пищеварительного тракта нематод с необычным строением и функцией средней кишки. Для проведения дальнейших транскриптомных исследований, в 2021 году была получена геномная сборка мермитид Hexamermis sp. от наземных моллюсков. У этих нематод средняя кишка превратилась в особый орган, содержащий запасные питательные вещества. В этом органе нет просвета кишечника, поскольку все питательные вещества поступают из полости тела хозяина. Эти нематоды поглощают питательные вещества из тела беспозвоночного–хозяина всей поверхностью тела. Также были исследованы нематоды-теластоматиды, для которых было отмечено наличие сокращений мышечных тяжей по всей длине средней кишки. Получены транскриптомные библиотеки разных тканей (включая среднюю кишку) нескольких видов. Так, было проведено выделение РНК, синтез библиотек кДНК и секвенирование половой трубки, кишки и стенки тела нематод родов Leidynema и Hammerscmidtiella. Было получено по 24-27 млн парноконцевых прочтений для каждой библиотеки. Удалось предсказать примерно 24 тысячи кодируемых пептидов транскриптома. Полнота кодируемых пептидов по списку BUSCO составила в среднем 88%. Анализ дифференциальной экспрессии между разными тканями выполняли с использованием DESeq2. Более 70% генов Leidynema и Hammerscmidtiella были разделены на три категории экспрессии. Проведено исследование филетических связей нематоды Synoecnema hirsutum с другими нематодами методом мультигенного филогенетического анализа. Все полученные по результатам анализа митохондриальных генов филограммы указывают на близкое родство этой нематоды с почвенной свободноживущей нематодой Acrobeloides varius. Группа, состоящая из Synoecnema, Acrobeloides, а также тиленхид, оказывалась ближе к базальной части всего «нематодного» древа, чем большая группа из рабдитид и двух изученных к настоящему времени плектид (Plectus aquatilis and P. acuminatus). Анализ филогении этих групп, опирающийся на отдельные митохондриальные гены показал, что в деревьях, построенных по результатам анализа генов atp6, coxI, cob, nad3, nad5 и nad6 такое базальное положение клады (tylenchids + Synoecnema + Acrobeloides) сохранялось, тогда как в анализе других митохондриальных генов (cox2, cox3, nad1 nad2, nad4 and nad4L) плектиды все же занимали традиционное базальное положение по отношению ко всем рабдитидам. В 2021 году были получены митохондриальные геномы мермитид и нематод родов Agfa, Phasmarabditis, Severianoia, Dicelis, Alloionema. Всего за время выполнения проекта было получено и аннотировано 16 митохондриальных геномов нематод. Для изучения генов, связанных с паразитизмом, начата работа по секвенированию транскриптомов разных стадий развития паразитических нематод Alloionema appendiculatum и Rhabdias buffonis, а именно, свободноживущих стадий, предшествующих заражению хозяина, паразитических стадий, и свободноживущих стадий после выхода из организма хозяина. В 2021 году получено 4 транскриптома Alloionema appendiculatum и 2 транскриптома Rhabdias buffonis. Во всех изученных в ходе выполнения проекта геномных и транскриптомных данных кластеризованы группы ортологов. Нами отобрано 280 ортологичных групп и создана матрица предсказанных белков. Была проведена реконструкция филогеномного древа нематод с использованием собственных последовательностей и данных Генбанка.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Определенный в ходе выполнения проекта митохондриальный геном свободноживущей нематоды Campydora demonstrans отличается рядом необычных особенностей. Гены в митохондриальном геноме C. demonstrans расположены на разных цепях. Среди опубликованных митохондриальных геномов нематод гены расположены на обеих цепях только у паразитических представителей семейств Mermithida, Dorylaimida и Trichinellida, относящихся к классу Dorylaimia. У нематод класса Chromadoria, за исключением вимдов рода Plectus, гены всегда располагаются на одной цепи мтДНК. Для нематод класса Enoplia до проведения наших работ не было известно ни одного полного митохондриального генома. За определением митохондриального генома C. demonstrans последовали сборки других митохондриальных геномов видов Enoplia, ведущих свободный и паразитический образ жизни. Они показали быструю эволюцию митохондриальных генов Enoplia, включая порядок генов, но при этом подтвердили гипотезу филогенетическорй близости паразитической эноплиды Marimermis maritima и свободноживущего вида Thoracostomopsis barbata (Enoplia, Thoracostomopsidae). Совершенные обращенные повторы, подобные найденным в некодирующей области мтДНК немтоды Campydora demonstrans, были обнаружены в массе в мтДНК разных видов Nematomorpha – группы, внешней по отношению к нематодам и считающейся сестриной некоторыми авторами. Однако у Nematomorpha совершенные повторы пересекаются с белоккодирующими генами, накладывая своеобразные ограничения на кодируемые митогеномом белки и их эволюцию (требующую до трех одновременных аминокислотных замен в случае наложения повторов). Ранее такие особенности организации генетического материала описаны не были. Благодаря полученным новым данным сконструировано первое мультигенное филогенетическое дерево видов Nematomorpha. Предсказано, какие митохондриальные гены пригодны, а какие непригодны (из-за препятствующим ПЦР повторам) для молекулярной экспресс-диагностики видов Nematomorpha. В работе по проекту получена новая информация, решающая значимую проблему паразитологии – происхождения морских паразитических нематод. В результате реконструкций было установлено, что «отряд Marimermithida» является парафилетичным: вид Marimermis maritima оказался в составе семейства Thoracostomopsidae, а Aborjinia sp. – в составе семейства Leptosomatidae. Полученные результаты доказывает независимый переход к паразитизму на беспозвоночных животных в группе родственных семейств морских нематод Enoploidea. Паразитические виды конвергентно приобрели такие общие признаки, как гигантский размер (увеличение по сравнению со свободноживущими родственниками свыше чем в 10 раз в линейном измерении, свыше чем в 1000 раз по массе) и высокую продукция яиц с соответствующей модификацией женской половой системы (прямые яичники). Эти преобразования морфологии аналогичны таковым у аскаридид и других паразитических Chromadoria, но здесь они происходят на существенно более низком таксономическом уровне, при существенно меньшем уровне генетической дивергенции маркерных генов. Это делает морские паразитические виды, несмотря ни их редкость и трудность добычи для исследования, потенциально более выигрышным модельным объектом для поиска генетической обусловленности адаптаций к паразитизму, чем моделей среди Chromadoria, где паразиты и их ближайшие свободноживущие родственники разделены существенно большими генетическими дистанциями. Филогенетическая реконструкция показала, что в семействе Phanodermatidae эноплий произошел необычный переход морских нематод к тесному сожительству с одноклеточными из группы фораминифер, также, как в семействе Camacolaimidae (класс Chromadoria). За пределами эноплий, новые последовательности из морских паразитических нематод Nematimermis enoplivora – паразитов свободноживущих литоральных и сублиторальных нематод – были сгруппированы с паразитами наземных членистоногих в составе паразитического семейства Mermithidae (класс Dorylaimia). Незначительные генетические дистанции между паразитами литоральных и сухопутных хозяев доказывает, что морские Mermithidae являются недавними вселенцами в море с суши. Это первый обоснованный молекулярными данными сценарий перемещения представителей Dorylaimia с суши в море. Полученные по проекту данные также согласуется с ранее высказанной гипотезой о наземном происхождении современной фауны паразитических морских нематод класса Chromadoria. Было отобрано 280 ортологичных групп и создана суперматрица предсказанных белков. Была проведена реконструкция филогеномного древа нематод с использованием собственных последовательностей и данных Генбанка. Это позволило провести ревизию филогенетических отношений различных групп нематод. Филогенетический анализ поддержал разделение трихинелл на инкапсулированные и неинкапсулированные виды. Значительная поддержка имеется у клады, образованной видами из Ascaridomorpha и Spiruromorpha, однако, группа Dracunculoidea имеет низкие поддержки. Анализ группы Tylenchina поддержал кладу, включающую все виды из Tylenchomorpha и ее сестринское положение к Cephalobomorpha и Panagrolaimomorpha, подтверждая гипотезу единого происхождения стоматостилета. В группу Rhabditina попадают все Diplogastridae, а также парафилетическая группа Rhabditidae, единственный представитель Heterorhabditidae и клада из представителей Strongylida с высокими поддержками. На общем дереве нематод клада Enoplia находится в сестринском положении по отношению к Dorylaimia и Chromadoria. Для изучения генов, связанных с паразитизмом, проведена работа по секвенированию транскриптомов разных стадий развития паразитических нематод Alloionema appendiculatum и Rhabdias buffonis, а именно, свободноживущих стадий, предшествующих заражению хозяина, паразитических стадий, и свободноживущих стадий после выхода из организма хозяина. Были успешно секвенированы транскриптомы всех стадий развития Alloionema appendiculatum в нескольких повторностях. Сравнительный анализ показал, что гены, которые специфически экспрессируются на паразитических стадиях Alloionema и у Strongyloides располагаются в пределах геномных кластеров, сконцентрированных в областях хромосомы II. Это согласуется с идеей о том, что внутрихозяинные стадии паразитических нематод используют специфическую биологию, которая позволяет им быть успешными паразитами. По нашим данным, гены, кодирующие астацин и SCP/TAPS, занимают главное место среди генов, связанных с паразитизмом. Это согласуется с ранее опубликованными данными по исследованию протеома Strongyloides. Сравнение Alloionema, Strongyloides, Rhabdias, а также данных из Генбанка позволяет нам утверждать, что паразитические нематоды имеют увеличенное количество генов, кодирующих протеазу в своем геноме, которые также, по-видимому, используются преимущественно на стадиях, проходящих внутри хозяина. У Alloionema мы также обнаружили геномную кластеризацию этих и других, вероятно, ассоциированных с паразитизмом генов, которая, вероятно, была инициирована во время адаптации к паразитизму с последующей повторной дупликацией генов, связанной с адаптацией к разным хозяевам. Такая структура генома может способствовать экспрессии паразитарной программы транскрипции этими паразитами.