КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-74-20147

НазваниеГеномные факторы перехода к паразитизму в эволюции нематод

РуководительСпиридонов Сергей Эдуардович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук, г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2022 

КонкурсКонкурс 2019 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Объект инфраструктуры Центр коллективного пользователя в области геномики

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-109 - Паразитология

Ключевые слованематоды, паразиты, патогены, таксономия, филогения, эволюция паразитизма, паразито-хозяинные отношения, специфичность, транскриптом, нуклеотидные последовательности

Код ГРНТИ34.33.23


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Хотя большинство нематод (Nematoda) – сапробионты, бактерио- или детритофаги, среди них много форм с тесными трофическими и иными экологическими связями с животными и растениями, и в том числе немало высокоспециализированных паразитов. Паразитические нематоды наносят существенный вред здоровью человека, приводят к потерям в животноводстве и других отраслях сельского хозяйства, а патогенные нематоды насекомых используются для борьбы с вредителями растениеводства. Распределение паразитических форм в отдельных таксонах нематод неравномерно: среди многих «морских» отрядов паразиты редки,а в пределах групп нематод, перешедших в процессе эволюции из моря в пресные воды и почву, паразиты многочисленны и разнообразны. «Переходы к паразитизму» среди нематод многочисленны и являются независимыми эволюционными событиями. Генетические основы феномена столь легкого перехода к паразитизму в отдельных эволюционных линиях нематод остаются неизвестными. Решение этой проблемы имеет фундаментальное значение для понимания закономерностей перехода животных к паразитизму и может иметь также прикладное значение, если удастся обнаружить новые мишени для фармакологического воздействия на гельминтов. На этом пути есть немало трудностей: 1) дефицит геномных данных по базальным группам – морским свободноживущим нематодам; 2) слабая разработка общего контекста геномной эволюции нематод (существующие представления о филогении типа основываются почти исключительно на маркерах рРНК и не верифицированы филогеномным анализом); 3) выбор объектов для геномных исследований среди немногих видов паразитов человека и экономически важных организмов. Обитание в разных хозяевах требует от паразита разных адаптаций. Для понимания эволюционных аспектов возникновения паразитизма необходимо исследование «генетического конструктора» этих адаптаций у разных паразитов. При выборе нематод для изучения мы выбрали три уровня их эволюции: 1) свободноживущие морские формы, которые в нашем анализе будут представлять предковое состояние (представители отрядов Chromadorida, Desmodorida, Selachinematida, Monhysterida, Araeolaimida); 2) энтомопатогенов, близких к хорошо изученным сапробиотическим формам (Caenorhabditis elegans, но значительно превосходящих последних по размерам, что позволит исследовать у них отдельно разные системы органов); 3) специализированных паразитов позвоночных и беспозвоночных хозяев, как «вершину» эволюции паразитизма. При выборе последних, будут отобраны удобные в методическом отношении крупные формы, не исследованные до настоящего времени геномными методами. Исследование свободноживущих морских форм геномными методами ранее не проводилось, и этот дефицит предполагается восполнить получением транскриптомов для как можно более широкого круга семейств и отрядов. Исследования по патогенным и паразитическим нематодам сосредоточатся на изучении двух основных и наиболее важных для жизнедеятельности паразита группах адаптаций: обеспечении питания (захвата питательных веществ) и обеспечения заражения последующих групп хозяев. Генетические основы особенностей питания будут исследованы путем получения транскриптома средней кишки на энтомопатогенных нематодах рода Heterorhabditis, близких к хорошо изученному C. elegans. В дальнейшем предполагается вовлечение в эти исследования двух групп специализированных полостных паразитов (мермитид, сферулярий). Изучение генетических основ формирования паразитами стадий, обеспечивающих переживание в наружной среде, будет начато с процессов формирования утолщенных оболочек на яйцах аскаридид и оксиурид. У этих двух групп нематод в дополнение к слоям оболочки, формируемым зиготой, на поверхности откладываются сложно устроенные маточные слои, что является поздним эволюционным «приобретением» этих нематод. Можно сказать, что аскаридиды и оксиуриды являются вершиной развития паразитизма в соответствующих линиях. Сравнительно крупный размер этих паразитов позволит исследовать транскриптом отдельных участков половой трубки, выделяющих дополнительные слои оболочки. В дальнейшем будут изучены другие (не родственные аскаридидам и оксиуридам) паразитические нематоды с утолщенными оболочками яиц. Сама возможность такого подхода определяется появлением методик single cell transcriptomics – получением транскриптомов отдельных клеток, что была успешно применена для свободноживущего C. elegans. Теперь стало возможным выявить специфическую экспрессию генов, обеспечивающих ключевые адаптации к паразитизму. Реализация проекта обещает перевести на более высокий уровень понимание паразитизма нематод, как общебиологического и генетического явления и поместить его в контекст геномной эволюции всего этого типа животных.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта ожидается получение комплексных результатов, значимых для геномики (установление набора молекулярных адаптаций к паразитическому образу жизни), общей биологии (закономерности формирования паразитизма у животных), частной зоологии (молекулярная эволюция типа нематод) и для практики (обнаружение новых молекулярных мишеней воздействия на паразитов). Методами современного высокопроизводительного секвенирования будут получены новые транскриптомные данные по слабо изученным или совершенно не изученным группам нематод, в том числе паразитам позвоночных и беспозвоночных, энтомопатогенным нематодам (используемым как агенты биологического метода борьбы с вредителями) и свободноживущим морским нематодам. Впервые будут получены геномные и транскриптомные данные по 4 отрядам нематод, сконструированы и секвенированы библиотеки кДНК, проверена их полнота и целостность сборки, построено филогенетическое дерево методами филогеномики, установлены ортологи генов, относимых у паразитических видов к «паразитому». Эти данные позволят реконструировать молекулярно-генетические характеристики анцестрального (базального) состояния для всей эволюционной линии типа Nematoda, ведущей от свободноживущих мейобентосных форм к высокоспециализированным паразитам. Обеспечение питания (захвата питательных веществ из тела хозяина) у нематод с различными формами взаимоотношений с хозяином (патогены, паразиты) будет изучено с помощью методов биоинформатики и прямых физиологических экспериментов. Будет установлена эволюция цис-петлевых рецепторов (cys-loop receptors), для чего на оригинальных данных будут создана электронная база и построены филогенетические деревья белков этих рецепторов. Будут исследованы различия в экспрессии генов, активных в половой трубке (в том числе таксонов, к которым относятся опасные паразиты человека и домашних животных). Будут получены профили экспрессии в трубках яйцевода и найдены гены-кандидаты, ассоциированные с формированием секретируемых оболочек яйца. Ожидаемые результаты реализации проекта позволят на уровне современной мировой науки понять адаптации к паразитизму, в том числе тех физиологических особенностей паразитов, которым ранее не уделялось должного внимания. Новые потенциальные мишени для фармакологического воздействия на паразитов, востребованные в медицинских и ветеринарных исследованиях и в разработке методов защиты растений от вредителей, могут быть найдены в процессе выполнения проекта.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году был проведен сбор морских свободноживущих нематод на Беломорской биологической станции им. Н.А.Перцова МГУ. Собраны и зафиксированы RNAlater (для сохранения РНК) , а также этиловым спиртом следующие виды свободноживущих морских нематод: Paracanthonchus caecus (семейство Cyatholaimidae) в количестве 40 экз., Halichoanolaimus robustus (семейство Selachinematidae) – две пробы в количестве 20 экз. и 30 экз., Richtersia inaequalis (семейство Richtersiidae) – две пробы в количестве 30 экз. каждая, Metachromadora vivipara (семейство Desmodoridae) – 50 экз., Monoposthia costata (семейство Monoposthiidae) – 50 экз., Odontophora sp. (семейство Araeolaimidae) – две пробы по 10 экз. При вскрытиях позвоночных и беспозвоночных хозяев были найдены и фиксированы этиловым спиртом 80% или заморожены при -70°С паразитические нематоды беспозвоночных животных: оксиуриды рода Severianoia от многоножек Pachyiulus krivolutskii, нематоды родов Heth и Rhigonema от вьетнамских многоножек-спироболид, теластоматиды Gryllophila skrjabini от медведки обыкновенной (Gryllotalpa gryllotalpa). Также собирали и вскрывали тараканов, что позволило собрать материал по теластоматидам Blatticola blattae от рыжих тараканов и Cranifera craniifer от тараканов рода Blaberus. При вскрытии лабораторных белых мышей были собраны оксиуриды Syphacia. Проведен сбор и фиксация аскаридид Contracaecum от рыбоядных птиц. Из замороженных образцов внутенних органов различных позвоночных были собраны крупные нематоды Dictyocaulus spp. из легких оленя и нематоды рода Trichinella из мышц различных хищных Дальнего Востока. ДНК получали с помощью набора QIAamp DNA Micro из всей пробы собранных нематод. Для нематод рода Heth проводилось раздельное выделение из стенки тела и только половой трубки. Из выделенной и амплифицированной ДНК были сконструированы библиотеки для дальнейшего чтения на секвенаторе второго поколения Illumina Hiseq 4000. Тотальную РНК выделяли с помощью набора Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, и после приготовления библиотеки кДНК готовили с помощью набора SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing (Clontech). Библиотеки секвенировали на геномном секвенаторе Illumina Hiseq 4000 в режиме парно-концевого прочтения. После фильтрации по качеству, из оставшихся чтений были удалены адаптеры от синтеза кДНК и сиквенсные адаптеры путем обработки программой Trimmomatic. Сборка транскриптомов была произведена программой Trinity. Полноту представленности кодируемых пептидов оценивали согласно сравнению со списком консервативных белков по BUSCO. В ходе исследования эволюционных адаптаций нематод к разным условиям жизни, включая паразитизм, было проведено исследование лиганд-зависимых ионных каналов с цистеиновой петлёй (cys-loop receptors) с помощью методов биоинформатики. С помощью программ HMMER (http://hmmer.org/), PFAM (https://pfam.xfam.org/) и при помощи алгоритма BLAST нами найдены и собраны в общую базу белки этого семейства из всех нематод с доступными базами данных. Полученные данные дополняют представления о разнообразии cys-loop рецепторов животных. Проведена полногеномная амплификация с помощью набора REPLI-g MIDI Kit материала по половым трубкам и стенке тела нематод рода Heth. Эту амплифицированную и нативную ДНК использовали для конструирования библиотек, которые были прочтены на платформе Illumina Hiseq 4000. Полученные последовательности были картированы на референсные митохондриальные геномы филогенетически близких нематод – Rhigonema thysanopora и Ascaris suum. Выявлена неравномерность распределения полученных прочтений по длине митохондриального генома. Для выявления среди представителей животного мира форм близких к предковым для всего типа Nematoda, было проведено полное геномное секвенирование и аннотация белков представителей типа Nematomorpha, как организмов по общему плану строения сходных с нематодами. В рамках выполняемого проекта было проведено и опубликовано исследование митохондриального генома нескольких видов Nematomorpha. Не выявлено очевидных признаков сходства нематод с волосатиками, но в процессе работы были обнаружены необычные точные длинные палиндромные последовательности длиной до ~250 нуклеотидов внутри кодирующих белки последовательностей митохондриальной ДНК. Такие палиндромы были найдены в семи типах митохондриальных генов четырех видов волосатиков, и существование этих палиндромов было подтверждено несколькими экспериментальными методами. Белки, кодируемые такими последовательностями, консервативны, что предполагает, что отбор одновременно сохраняет основу их аминокислотной последовательности и в то же время создаёт и поддерживает палиндромы в кодирующей их ДНК. Ещё более удивительно, что некоторые белки, кодирующие ДНК волосатиков, содержат не один, а два перекрывающихся палиндрома. Насколько нам известно, ничего подобного ранее не наблюдалось ни в митохондриальных, ни в ядерных генах. Наше открытие предполагает возможность существования нового неизвестного механизма геномной регуляции у животных. В соответствии с планами публикация по результатам изучения волосатиков были опубликована в журнале входящем в Q1.

 

Публикации

1. Бугмырин С.В., Спиридонов С.Э. First record on the infestation of small rodents by Baylisascaris transfuga (Ascaridoidea: Nematoda) in natural habitats. Russian Journal of Nematology, 27 (2) p. 146 (год публикации - 2019).

2. Михайлов К.В., Ефейкин Б.Д.,Панчин А.Ю.,Кнорре Д.А.,Логачева М.Д.,Пенин А.А.,Мунтян М.С.,Попова О.В.,Занегина О.Н.,Высоких М.Ю.,Спиридонов С.Э.,Алешин В.В.,Панчин Ю.В. Coding palindromes in mitochondrial genes of Nematomorpha Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 13, 26 July 2019, Pages 6858–6870 (год публикации - 2019).

3. Одоевская И.М., Середкин И.В., Спиридонов С.Э. The circulation of Trichinella invasions in woodland habitats of the Russian Far East. Russian Journal of Nematology, 27 (2) p. 152 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На Белом море были собраны свободноживущие морские нематоды семейств Comesomatidae и Xyalida. Из них, а также из образцов Campydora demonstrans и Xenella sp. сбора прошлого года были подготовлены геномные библиотеки и осуществлено полногеномное секвенирование на платформе Illumina NextSeq. Был собран и аннотирован митохондриальный геном Campydora demonstrans. Для представителей Comesomatidae и Xyalida было проведено изготовление библиотек кДНК и дальнейшее секвенирование на платформе Illumina NextSeq. На крупных самках нематод-оксиурид Gryllophila skrjabini и Leidynema spp., паразитирующих в в задней кишке насекомых была отработана методика анатомирования, с отделением средней кишки и половых трубок. Для геномных исследований были отобраны 4 вида нематод рода Leidynema и 2 вида нематод рода Hammerschmidtiella (семейство Thelastomatidae). Из выделенной ДНК были сконструированы библиотеки для дальнейшего чтения на секвенаторе второго поколения Illumina NextSeq. Удалось получить полные митохондриальные геномы для трех видов Leidynema и для двух видов нематод рода Hammerschmidtiella. Были обработаны геномные данные по оксиуридам, паразитирующим в задней кишке прямокрылых: нематодам родов Singhiella и Chitwoodiella из задней кишки вьетнамских медведок Gryllotalpa africana, и Gryllotalpa gryllotalpa из Краснодарского края. Впервые методами полногеномного секвенирования были исследованы нематоды рода Synoecnema из полости тела дождевых червей сем. Megascolecida (Вьетнам), и нематоды рода Dicelis от дождевых червей сем. Lumricidae средней полосы России. Для всех из них были получены и аннотированы митохондриальные геномы. Собранные и аннотированные митохондриальные геномы подтвердили гипотезу, что у большинства нематод класса Chromadoria гены всегда располагаются на одной цепи. Было проведено выделение РНК из половых трубок нематод Syphacia, Toxocara и Leidynema, дальнейшее конструирование библиотек и секвенирование. Было получено 20-25 млн. парноконцевых чтений для каждой библиотеки. С целью поиска новых доступных объектов для геномных исследований была изучена таксономическая принадлежность аскаридид рода Contracaecum – паразитов птиц и млекопитающих, развивающихся в водных экосистемах. Продолжено изучение адаптаций связанных со средней кишкой энтомопатогенной нематоды Heterorhabditis megidis. В 2020 году был проведен анализ функционирования средней кишки в разных группах свободноживущих и паразитических нематод, в том числе наличия у них дефекационной моторной программы (ДМП). Анализ связанных с ДМП генов (таких как гомологи PBO-5/PBO-6, NLP-40, AEX-2 и EXP-1) у разных нематод, включая данные, полученные в данном проекте, позволил предположить, что ДМП возникла у общего предка нематод, поскольку набор связанных с ДМП генов обнаруживается уже у базальной группы нематод – эноплид, но не отмечен за пределами класса нематод (у других Ecdysozoa). На основе предложенного нами модельного организма Heterorhabditis megidis мы разработали экспериментальную систему для исследования распространяющегося некротического сигнала смерти в кишке нематоды, позволяющую использовать стандартные методы электрофизиологии. Представляется важным проверить полученные нами для Heterorhabditis данные на других крупных рабдитидах. Для проверки полученных данных на других рабдитидах мы выбрали нематод рода Steinernema для дальнейшей работы и провели сравнение представителей этого семейства из России и южной части Италии.

 

Публикации

1. Клауси М.,Леоне Д., Спиридонов С.Э. Haplotype diversity of Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae) in Eurasia (1)] Redia, 103, 2020: 133-136 (год публикации - 2020).

2. Пронькина Н.В., Спиридонов С.Э. Third-stage juveniles of Contracaecum sp. (Anisakidae, Ascaridomorpha) from the round goby Neogobius melanostomus of the Black Sea Russian Journal of nematology, 2020, 28 (1), 45 – 52 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Были получены геномные данные по двум видам свободноживущих морских нематод из Белого моря: Thoracostomopsis barbata (семейство Thoracostomopsidae) и Thoracostoma sp. (семейство Leptosomatidae), а также по двум паразитическим морским нематодам: Marimermis maritima и Aborjinia sp. Ранее два этих вида паразитических нематод рассматривали как близкородственные формы и относили к отдельному отряду Marimermithida. Наши исследования 2021 года показали, что представители этих двух родов маримермитид хоть являются родственными, но не образуют монофилетической группы. Более того, изученный нами вид Marimermis maritima образовывал на полученных филограммах единую группу (был в «сестринских» отношениях) с видом свободноживущих нематод Thoracostomopsis barbata (семейство Thoracostomopsidae), а изученный нами вид Aborjinia sp. предсказуемо образовывал единую группу с изученным ранее видом Aborjinia corallicola. Два эти вида рода Aborjinia объединялись с изученными к настоящему времени видами семейство Leptosomatidae, и, в том числе, исследованными нами в 2021 году видами рода Thoracostoma. Таким образом переход к паразитизму на беспозвоночных животных происходил у свободноживущих морских нематод по крайней мере дважды даже в пределах только эноплид (Enoploidea). Также можно сделать вывод о необоснованности выделения морских паразитических нематод в отдельный отряд Marimermithida. Выделение и изучение ДНК и РНК от паразитических нематод лошадей Parascaris equorum дало около 30 млн. парно-концевых чтений для каждой из библиотек и позволило выявить в транскриптоме около 24 тысячи кодируемых белков. Был произведен поиск ортологичных генов для проведения сравнения полученных от Parascaris данных с белками от нематод рода Toxocara и данными по Ascaris suum и Сaenorhabditis elegans. Для поиска ортологов и паралогов использовали алгоритм BLAST, запуская белковые последовательности сравниваемых нематод друг против друга, а также программный пакет OrthoFinder2. Все полученные последовательности были просканированы на кодирующие области с помощью TransDecoder (http://transdecoder.sf.net). Идентифицированные белки были затем дополнительно охарактеризованы на основе сходства последовательностей с последовательностями из баз данных Uniref90 и SwissProt с использованием Blast. На основании сходства транскрипты были аннотированы с помощью GO, Kegg и EggNOG. HMMER и база данных Pfam использовались для идентификации белковых доменов. Для выяснения элементов строения сократительной средней кишки оксиурид была осуществлена двойная окраска препаратов кишки на клеточные ядра и сократительные элементы (актин). В передней и средней части кишки хорошо идентифицируются ядра кишечного эпителия и мышечные сократительные элементы, расположенные на поверхности кишки со стороны первично полости тела нематоды. При этом в средней части кишки не удается обнаружить ядер клеток, связанных с мышечными сократительными элементами. Таким образом, у оксиурид мышечные сократительные элементы средней кишки образованы клетками, расположенными в хвостовой части тела. В 2021 году были продолжены исследования сравнительной биологии пищеварительного тракта нематод с необычным строением и функцией средней кишки. Для проведения дальнейших транскриптомных исследований, в 2021 году была получена геномная сборка мермитид Hexamermis sp. от наземных моллюсков. У этих нематод средняя кишка превратилась в особый орган, содержащий запасные питательные вещества. В этом органе нет просвета кишечника, поскольку все питательные вещества поступают из полости тела хозяина. Эти нематоды поглощают питательные вещества из тела беспозвоночного–хозяина всей поверхностью тела. Также были исследованы нематоды-теластоматиды, для которых было отмечено наличие сокращений мышечных тяжей по всей длине средней кишки. Получены транскриптомные библиотеки разных тканей (включая среднюю кишку) нескольких видов. Так, было проведено выделение РНК, синтез библиотек кДНК и секвенирование половой трубки, кишки и стенки тела нематод родов Leidynema и Hammerscmidtiella. Было получено по 24-27 млн парноконцевых прочтений для каждой библиотеки. Удалось предсказать примерно 24 тысячи кодируемых пептидов транскриптома. Полнота кодируемых пептидов по списку BUSCO составила в среднем 88%. Анализ дифференциальной экспрессии между разными тканями выполняли с использованием DESeq2. Более 70% генов Leidynema и Hammerscmidtiella были разделены на три категории экспрессии. Проведено исследование филетических связей нематоды Synoecnema hirsutum с другими нематодами методом мультигенного филогенетического анализа. Все полученные по результатам анализа митохондриальных генов филограммы указывают на близкое родство этой нематоды с почвенной свободноживущей нематодой Acrobeloides varius. Группа, состоящая из Synoecnema, Acrobeloides, а также тиленхид, оказывалась ближе к базальной части всего «нематодного» древа, чем большая группа из рабдитид и двух изученных к настоящему времени плектид (Plectus aquatilis and P. acuminatus). Анализ филогении этих групп, опирающийся на отдельные митохондриальные гены показал, что в деревьях, построенных по результатам анализа генов atp6, coxI, cob, nad3, nad5 и nad6 такое базальное положение клады (tylenchids + Synoecnema + Acrobeloides) сохранялось, тогда как в анализе других митохондриальных генов (cox2, cox3, nad1 nad2, nad4 and nad4L) плектиды все же занимали традиционное базальное положение по отношению ко всем рабдитидам. В 2021 году были получены митохондриальные геномы мермитид и нематод родов Agfa, Phasmarabditis, Severianoia, Dicelis, Alloionema. Всего за время выполнения проекта было получено и аннотировано 16 митохондриальных геномов нематод. Для изучения генов, связанных с паразитизмом, начата работа по секвенированию транскриптомов разных стадий развития паразитических нематод Alloionema appendiculatum и Rhabdias buffonis, а именно, свободноживущих стадий, предшествующих заражению хозяина, паразитических стадий, и свободноживущих стадий после выхода из организма хозяина. В 2021 году получено 4 транскриптома Alloionema appendiculatum и 2 транскриптома Rhabdias buffonis. Во всех изученных в ходе выполнения проекта геномных и транскриптомных данных кластеризованы группы ортологов. Нами отобрано 280 ортологичных групп и создана матрица предсказанных белков. Была проведена реконструкция филогеномного древа нематод с использованием собственных последовательностей и данных Генбанка.

 

Публикации

1. Горелышева Д.И., Громов А.Р., Лавренченко Л.А., Спиридонов С.Э. Genetic diversity of Syphacia Seurat, 1916 (Nematoda: Oxyuridae) across the hybrid zone of their rodent hosts in Russia Parasitology Research, 120(6), 2017–2030. (год публикации - 2021).

2. Иванова Е.С., Ефейкин Б.Д., Спиридонов С.Э. The re-description of Synoecnema hirsutum Timm, 1959 (Synoecneminae, Ungellidae, Drilonematoidea) from a pheretimoid earthworm in Vietnam with the analysis of its phylogenetic relationships Zookeys, 1076:135-150 (год публикации - 2021).