Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Средства гранта РНФ в 2019 году позволили разработать новый подход селективной амплификации удлиненных CRISPR-кассет для увеличения чувствительности детекции CRISPR-адаптации и повышения эффективность анализа набора спейсеров. Новый подход не требует предварительной модификации ДНК в исследуемом организме, и может быть адаптирован для различных CRISPR-Cas систем без ограничений. Разработанный метод был применён для исследования процесса наивной адаптации в клетках E.coli с использованием олигонуклеотидов различной длины. Мы нашли примеры встраивания спейсеров нестандартной длины (30-32) из олигонуклеотидов. Мы разработали процедуру количественной амплификации CRISPR-кассет с использованием уникальных баркодов (UMI), которая понизила разнородность представленности спейсеров после амплификации в десятки раз. А также был найден фактор, вносящий количественную ошибку при использовании универсальных праймеров, комплементарных CRISPR повторам, при амплификации спейсеров. Использование биоинформатических подходов и машинного обучения помогло разработать алгоритм восстанавливающий CRISPR-кассеты de novo из данных секвенирования с точностью 80%. Для испытания разработанного алгоритма было поставлено несколько экспериментов по амплификации смесей C.difficile и E.coli в разном соотношении штаммов. Было показано, что алгоритм способен качественно различать и восстанавливать кассеты разных штаммов в одной смеси, а также может детектировать кассеты штаммов, присутствующих в минорном количестве. Разработанные методы и алгоритмы будут применяться для детекции редких событий CRISPR адаптации, для количественной оценки разнообразия CRISPR-кассет в метагеномных образцах и изучения эволюции CRISPR-кассет в сложных микробных сообществах, что позволит вывести исследования в данной области на новый уровень.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Средства гранта РНФ в 2020 году позволили разработать принципиально новый подход, который впервые позволил детектировать интермедиаты встраивания спейсеров в CRISPR-кассету in vivo. Применение этого подхода подтвердило гипотезу о неполном встраивании преспейсеров длиной меньше 33 п.о в I-E CRISPR-Cas системе E. coli. Кроме того, мы обнаружили большое разнообразие коротких интермедиатов встраивания (21-29 п.о.), вероятно образовавшимся в результате неправильного/избыточного процессинга преспейсеров клеточными нуклеазами. Мы проанализировали особенности праймированной и наивной адаптации вариантами Cas1 белка с различными мутациями в PAM-узнающем домене. Мы обнаружили варианты Cas1-Cas2 адаптационного комплекса, которые приводят к встраиванию спейсеров с измененной длиной и повышенной/пониженной РАМ специфичностью как при праймированной, так и при наивной адаптации. Мы продолжили разработку метода количественного анализа состава CRISPR-кассет в метагеномных образцах, и применили его для анализа микробиоты кишечника. Разработанные методы и алгоритмы будут использованы в следующем году для выяснения роли клеточных нуклеаз и мутаций Cas1 белка в генерации разнообразия спейсеров, а также для анализа микробиома кишечника человека и других природных сообществ.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Механизм образования преспейсеров в ходе наивной адаптации в системах CRISPR-Cas остаётся неизвестным. Благодаря разработанному нами ранее методу детекции полувстроенных интермедиатов адаптации in vivo, мы охарактеризовали интермедиаты, встроенные в верхнюю и нижнюю цепи CRISPR-кассеты, а также сравнили их с интермедиатами праймированной адаптации. Полученные результаты свидетельствуют о существовании двух различных механизмов образования преспейсеров в ходе наивной адаптации. Первый механизм сходен с механизмом образования преспейсеров в ходе праймированной адаптации и ведёт к накоплению интермедиатов, в которых длина AAG-ассоциированной цепи составляет ~33 н.. Второй механизм является уникальным для наивной адаптации и ведёт к накоплению интермедиатов, в которых длина AAG-ассоциированной цепи составляет ~28 н.. Мы показали, что экзонуклеазы RecJ и ExoVII генерируют 5’-концы 33-нуклеотидных интермедиатов нижней цепи CRISPR-кассеты и 5’-концы 33-нуклеотидных интермедиатов верхней цепи CRISPR-кассеты в ходе наивной адаптации. На основе полученных нами и литературных данных предложена модель образования преспейсеров в наивной адаптации в системе CRISPR-Cas I-E. Кроме того, были проведены работы по совершенствованию подхода к детекции полувстроенных интермедиатов адаптации, и был разработан количественный метод их учёта. Помимо изучения наивной адаптации, нами было показано прямое взаимодействие белков Cas1 и Cas3 в ходе праймированной адаптации в системе I-E Escherichia coli. Эти данные подтверждают существование адаптационного комплекса PAC, который ранее было продемонстрирован только для системы I-E Thermobifida fusca. На примере Pseudomonas aeruginosa PA14 и фага DMS3vir изучены факторы, влияющие на эффективность праймированной адаптации при фаговой инфекции. Показано, что бактериостатические антибиотики, замедляющие рост бактерий, приводят к замедленному размножению фага, обеспечивая достаточное для встраивания нового спейсера время и усиление защиты клетки от бактериофага. Также мы охарактеризовали разнообразие спейсеров в системах CRISPR-Cas архей Asgardarchaeota. Благодаря сравнению спейсеров с метагеномными данными, удалось выявить три новых семейства вирусов (Verdandiviruses, Skuldviruses и Wyrdviruses), предположительно заражающих Asgardarchaeota. Были продолжены работы по совершенствованию метода сборки CRISPR-кассет SCRAMBLER. Благодаря добавлению в SCRAMBLER возможности использования данных секвенирования по технологии Oxford Nanopore, удалось решить проблему склеивания CRISPR-кассет, содержащих одинаковые спейсеры.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году мы продолжили работать над развитием метода детекции полувстроенных преспейсеров (HIP). Метод был усовершенствован за счет фильтрации неспецифичных продуктов амплификации ДНК. Применение метода к наивной адаптации выявило новые данные о механизме образования преспейсеров. Мы показали, что, в отличие от праймированной адаптации, существуют два механизма образования преспейсеров в наивной адаптации. Первый механизм зависит от RecJ и ExoVII, второй механизм зависит от RecBCD и RecJ. В отсутствии RecBCD и RecJ образуется новый класс интермедиатов – 30-нуклеотидные интермедиаты верхней цепи, механизм образования которых остаётся неизвестным. Помимо полувстроенных интермедиатов, мы провели всесторонний анализ спейсеров, приобретённых в ходе наивной адаптации. Полученные данные согласуются с гипотезой о том, что RecBCD производит субстраты для наивной адаптации. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что в отсутствии RecBCD эту функцию берёт на себя RecJ. Нуклеазная активность RecBCD способствует преимущественному выбору спейсеров из плазмидной ДНК. Также получены данные о взаимодействии систем CRISPR-Cas и ретронов. Мы демонстрируем, что шпилька, образованная оцДНК ретрона Ec86, является горячей точкой выбора новых спейсеров в наивной адаптации. Финальные этапы встраивания спейсера являются плохо изученными. Известно, что в клетках E. coli имеются две лигазы – LigA и LigB. Мы разработали модификацию метода детекции HIP, в которой можно напрямую сравнивать количества исходных CRISPR-кассет, удлинённых CRISPR-кассет с одним новым спейсером и полувстроенных интермедиатов. Данный метод был применён к анализу продуктов адаптации в температуро-чувствильном мутанте ligA251, в котором LigA инактивируется при высоких температурах. Этот эксперимент показал, что при переносе клеток ligA251 на 42 градуса в клетках останавливается накопление удлинённых CRISPR-кассет, но происходит накопление полувстроенных интермедиатов. Эти данные однозначно указывают на то, что LigA является ответственной за финальный этап адаптации – интеграцию 5’-концов преспейсеров. LigB, по-видимому, не способна замещать LigA. Проведены обширные работы по изучению механизма праймированной адаптации. Впервые охарактеризованы полувстроенные интермедиаты праймированной адаптации в различных мутантах, включая мутантов ∆recB ∆recJ, ∆recB ∆recQ, где эффективность адаптации снижена в ~10 раз, а также мутанта ∆recJ ∆xseA, где эффективность адаптации снижена в 700 раз. Эти результаты продемонстрировали высокую чувствительность метода детекции HIP по сравнению с использованным ранее методом FragSeq. Одной из загадок праймированной адаптации является механизм выбора спейсеров с обеих сторон от праймирующего простойспера. Благодаря комбинации методов мы демонстрируем, что наиболее вероятным сценарием является одновременный выбор спейсеров с двух сторон от праймирующего протоспейсера. Cascade при этом остаётся связанным с Cas3, а две молекулы Cas3 движутся в разные стороны, что приводит к образованию петель ДНК.