Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Разработка подходов для создания биоинтерфейсов, позволяющих ускорить пролиферацию, обеспечить направленную дифференциацию и необходимую пространственную ориентацию клеток позволит добиться значительных успехов в решении ряда как фундаментальных проблем (модуляция функциональной активности клеток посредством микро и нанонагрева), так и практических задач, связанных с клеточной трансплантацией, реконструкцией костных повреждений и регенерацией поврежденных нервных проводников. Цель данного проекта – это получение принципиально новых материалов, обеспечивающих комплексное воздействие, основанное на механической и тепловой стимуляции, направленное на ускорение регенерации тканей. Реализация этого проекта создаст новое направление в разработке «умных» материалов в нейрохирургии, необходимой области высокотехнологичного здравоохранения. Для достижения поставленной цели на первом этапе были применены следующие новаторские подходы и оригинальные технические решения. - для получения ориентированных тонких (диаметром 300 нм) и ультратонких (диаметром 60 нм) нановолокон нейлона 4/6 разработан специальный барабан с подходящими геометрическими характеристиками. Исследования качества наноматов из нейлона, полученных электроформованием показало, что лучшие образцы получаются при использовании газофазной нейтрализации волокон противоионами, генерируемыми распылением этанола. как для ориентированных в одном направлении, так и для радндомно-ориетированных волокон. Получение ультратонких (менее 100 нм) ориентированных волокон в литературе не описано и разработано нами впервые. - для исследования фототермических эффектов наночастиц – абсорберов ближнего инфракрасного излучения (БИК) в микромасштабе была спроектирована камера, позволяющая изучать температурные профили и визуализировать воздействие излучения на одиночную клетку. Разработан позиционер для оптоволокна и доработан прототип установки для облучения клеточных препаратов БИК излучением. Известно, что морфологические изменения нейронов зависят от диаметра волокон, формирующих скаффолд. Диапазон диаметров волокон свыше 400-500 нм исследован достаточно подробно. Нижний порог диаметра волокон в 400-500 нм, выбранный исследователями ранее и описанныф в литературе, обусловлен с одной стороны техническими ограничениями в получении подложек с меньшим диаметром волокон, а с другой стороны обусловлен схожестью волокон по размеру со средним зрелым аксоном. Однако, практически не исследован диапазон волокон, имитирующих субмикронные структуры внеклеточного матрикса (ВКМ), размеры которых лежат в диапазоне 10 – 300 нм. В связи с этим разработка и исследование скаффолда, имеющего ультраструктурные характеристики соответствующие размерам структурных элементов ВКМ является актуальной задачей, решение которой было реализовано в рамках выполнения проекта. Были получены и охарактеризованы наноразмерные изотропные и анизатропные скаффолды ультраструктура, которых (средний диаметр 60, 100 и 300 нм) соответствует размерам коллагеновых волокон в составе ВКМ. Впервые было изучено влияние топологии поверхности данных матриксов на морфологию клеток. Показано, что полученные наноструктурированные скаффолды на основе волокон нейлона 4/6 являются биосовместимыми, поскольку в отсутствии дополнительной обработки (покрытий для создания положительного заряда поверхности или белковые молекулы, обеспечивающие формирование сайтов адгезии на поверхности) значительно улучшают пролиферацию и рост клеток нейробластомы IMR-32. Независимо от диаметра и направленности волокон наноструктурированные подложки демонстрируют значительное увеличение количества клеток с течением времени по сравнению с контролем. Важной характеристикой перспективных для нейроимплантации скаффолдов является способность управлять (направлять) ростом нейритов in vitro. Оценка углового распределения отростков нейронов культивированных на тонких ориентированных волокнах с диаметром 300 нм выявила, что отростки клеток растут по направлению (вдоль) волокон, т.е. тонкие волокна способны эффективно управлять ростом нейритов в заданном направлении. Ультратонкие анизатропные волокна (60 нм) также способствуют росту нейритов вдоль волокон, но этот рост не ограничен одним доминатным направлением. Средняя элонгация отростков на клетку, наблюдаемая при культивировании клеток на ультратонких нановолокнах значительно превышала длину нейритов клеток на волокнах с диаметром 100 и 300 нм независимо от способа укладки волокон. Эти результаты показывают, что скаффолды с ультратонкими волокнами эффективно стимулируют рост нейритов. Однако, волокна с малым диаметром оказывают меньшее влияние на ориентацию отростков, стимулируя быстрый рост более тонких отростков. Полученные результаты были подтверждены с использованием двух вариантов сканирующей электронной микроскопии (в присутствии контрастирующего агента и без контрастирования). Помимо исследования морфологических особенностей роста нейронов была показана способность выделенных нейронов гиппокампа формировать синапсин-положительные контакты на всех видах экспериментальных подложек. Количественное сравнение выявило, что скаффолды на основе нейлона увеличивают синаптогенез нейронов по сравнению с контролем. И это обусловлено не только увеличением средней элонгации нейритов на 3D подложках, о которых мы уже упоминали. Культивирование нейронов на тонких и ультратонких волокнах увеличивает плотность синапсин-положительных точек на поверхности нейритов контактирующих нейронов при росте на нановолокнах. Таким образом, нейлоновые волокна как со средним диаметром 60 нм, так и с диаметром 100 и 300 нм способствуют синаптогенезу и формированию связей нейронов гиппокампа крыс. Наноструктурированные скаффолды стабильны при хранении в течение 4 месяцев, не изменяют свою ультраструктуру и сохраняют целостность покрытия. При моделировании условий, приближенных к физиологическим, наблюдается характерное для полимерных волокон набухание и увеличение размера волокон с сохранением целостности покрытия. Заметных признаков деградации, таких как появление шероховатости поверхности волокна и разрывов между волокнами. Для создания скаффолда, обеспечивающего «активную» тепловую стимуляцию направленного роста поврежденных аксонов была оптимизирована методика получения свет-трансформирующих наночастиц для дальнейшей модификации ими нановолоконной подложки. Были получены металлокомпозитные наночастицы FeS2-БСА, CuS-БСА и проведен сравнительный анализ их фототермических характеристик. Кроме того, для исследования эффективности фотоконверсии ближнего инфракрасного излучения 808 нм в микромасштабе были синтезированы наночастицы с коньюгированным флуоресцентным термо-чувствительным зондом родамином В. Данный подход позволяет получить частицы, являющиеся одновременно нанонагревателями и нанотермометрами с возможностью регистрировать нагрев по изменению интенсивности флуоресценции термо-чувствительного зонда. Наночастицы CuS-BSA (размером 22,7±5,7 нм) и частицы CuS-BSA-Rhod, содержащие конъюгированный родамин В (размером 33,2±7,0 нм) характеризуются высокой коллоидной стабильностью в растворе HEPES, эффективностью фотоконверсии и фотостабильностью, позволяя многократно получать необходимые температурные градиенты. Полупроводниковые нанокристаллы CuS-BSA и CuS-BSA-Rhod имеют оптимальные параметры для инкорпорирования в скаффолд на основе нановолокон нейлона 4/6.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Данный проект направлен на исследование влияния свойств материала и наноструктурной организации имплантатов, в частности, нервных кондуитов, на функциональную активность нейронов. Целью данного проекта является разработка скаффолдов с топологией, близкой к внеклеточному матриксу (ВКМ) мозга,содержащих инкорпорированные частицы-нанонагреватели, способные конвертировать ближнее инфракрасное излучение (БИК) в тепло. Такой подход даёт возможность управлять ростом нервных клеток с помощью внешнего физического воздействия. Реализация этого проекта вносит вклад в развитие нового высокотехнологичного направления - разработки «smart» материалов для нейрохирургии. Для достижения поставленной цели на данном этапе исследования были предложены следующие подходы и оригинальные технические решения: - Усовершенствована установка с вращающимся коллектором для получения больших партий однородных по плотности наноматов из нейлоновых волокон с высокой степенью ориентации. - Разработаны новые методы нанесения частиц БИК-конвертирующих наночастиц (CuS-БСА) на скаффолды из нейлоновых волокон. В первом, «сухом»способе используется методика электрораспыления водного раствора частиц на поверхность нейлоновых волокон с электронейтрализацией. Данный подход позволяет наносить на волокна как отдельные одиночные наночастицы размером ~ 60 нм, так и крупные агрегаты, сравнимые по размеру с диаметром волокна. Достоинством метода является низкий фоновый сигнал, так как волокна во время модификации находятся не на подложке, а на проволочном каркасе барабана. Во втором,«мокром» способе впервые использована модификация тонких нейлоновых волокон для ковалентной пришивки наночастиц, заключающаяся в восстановлении амидных групп алюмогидридом лития. Данный способ обладает высокой эффективностью, при этом фоновый сигнал практически отсутствует. - Разработан способ получения паттернов наночастиц на поверхности волокон с помощью пневматического распылителя - крупных (200 – 1000 нм) агрегатов БИК-абсорбирующих наночастиц. При облучении таких образцов становится возможным получить градиент температуры, в перспективе способный обеспечить направленный рост нервных клеток. Данный способ также позволяет избежать появления фонового сигнала при получении температурных профилей фототермического нагревания композитных скаффолдов. В рамках проекта впервые показано, что ориентированные ультратонкие (~100 нм) волокна из нейлона способны обеспечить ускоренный и направленный рост нейритов. Выявлены разные механизмы взаимодействия нейритов с волокнами, зависящие от диаметра волокна. Показано, что ультратонкие волокна образуют многочисленные слабые незрелые β1-интегрин-положительные фокальные контакты (ФК), локализованные по всей поверхности клетки, в то время как субмикронные волокна (300 нм) инициируют формирование ФК только на соме клетки. Это указывает на то, что нанотопология скаффолда может влиять на сборку ФК с участием различных субъединиц интегрина. Полученные результаты опубликованы в статье «ECM-Mimetic Nylon Nanofiber Scaffolds for Neurite Growth Guidance» в Nanomaterials 2021, 11(2), 516; doi:10.3390/nano11020516. Полученные скаффолды с топологией, имитирующей по размеру компоненты ВКМ мозга, позволили разработать новый способ получения 3D нейрональных органоидов – нейросфер. Нейросферы представляют собой новую платформу для нейробиологов, более похожую на мозг in vivo по сравнению с 2D-моделью - монослойной культурой. Они используются в нейротоксикологии и исследованиях клеточной дифференцировки, моделировании нейродегенеративных заболеваний, а также для скрининга нейропротекторных препаратов. Показано, что на ультратонких нейлоновых волокнах происходит быстрое формирование прикрепленных к субстрату нейросфер уже на второй день культивирования. Исследовано влияние плотности волокон и концентрации клеток на динамику формирования и размер нейросфер, а также на скорость миграции нейронов на скаффолдах из нейлоновых волокон. Изучен популяционный состав нейросфер, впервые показано, что ультратонкие волокна (100 нм) способствуют выживаемости астроцитов. При исследовании синаптогенеза и функциональной активности нейросфер показано, что синапсы локализованы не только на поверхности нейритов, как в случае одиночных клеток, но и на соме клеток, составляющих нейросферу. Подтверждена высокая функциональная активность нейронов в нейросферах, полученных на таких скаффолдах. В работе опробованы разные способы пришивки БИК-абсорбирующих наночастиц, представляющих собой покрытое белком ядро из сульфида меди, к поверхности нейлоновых волокон. В первом варианте, для активации поверхности нейлоновые волокна обрабатывали плазмой и затем пришивали наночастицы, используя стандартный подход (EDC/NHS). Данный подход оказался малоэффективным. Поэтому в технологию ввели дополнительную стадию – обработку волокон полиэтиленимином (ПЭИ) с дальнейшей пришивкой частиц. В этом случае наблюдалась высокоэффективное покрытие волокон как частицами, так и их агрегатами. Однако значительное количество наночастиц адсорбировалось на стеклянной подложке. Поэтому был предложен новый способ модификации поверхности волокон с использованием алюмогидрида лития для восстановления амидных групп нейлона. Такой способ позволил не только получить высокоэффективную и прочную пришивку частиц с помощью глутарового альдегида, но и значительно уменьшить фоновый сигнал. В результате проведённой работы получены скаффолды из нейлоновых нановолокон с высокой степенью ориентации и диаметром, оптимальным для роста нервной ткани (50 – 100 нм), имеющих на поверхности различные паттерны химически закрепленных БИК-абсорбирующих наночастиц: одиночные наночастицы, сплошное покрытие наночастицами, плотное покрытие 100 нм агрегатами наночастиц, отдельные 200 – 1000 нм агрегаты, разделенные участками, не содержащими частиц для создания градиента температуры при фототермическом нагревании. Полученные нанокомпозитные скаффолды устойчивы к деградации при длительной инкубации в водном растворе.Это дает основание предполагать, что при применении разрабатываемых скаффолдов in vivo не будет происходить десорбции частиц с поверхности волокон. Кроме того, показано, что полученные композитные материалы биосовместимы и не влияют на жизнеспособность клеток. Разрабатываемые материалы, помимо подтвержденной в 1 год работы способности стимулировать и направлять рост отростков нервных клеток, должны конвертировать ближнее инфракрасное излучение в тепло для дополнительной стимуляции регенерации. Свет-конвертирующие наночастицы, представляющие собой полупроводниковые кристаллы CuS, синтезировали в присутствии бычьего сывороточного альбумина (БСА), в ряде опытов меченного родамином Б. Флуоресцентный маркер позволяет не только визуализировать частицы, в том числе при иммобилизации, но и детектировать температуру. Таким образом, используемые наночастицы служат и как нанонагреватели, конвертирующие инфракрасное излучение (808 нм) в тепло, и как нанотермометры, измеряющие степень нагрева. Оценку эффективности фотоконверсии иммобилизованных наночастиц проводили различными способами. В итоге, для фиксации локального нагрева было предложено использовать термочувствительный флуоресцентный зонд (родамин Б). Измерение температуры в результате фотоконверсии наночастицами инфракрасного излучения проводили по тушению флуоресценции связанного с частицами родамина Б на воздухе и в воде. В первом случае при облучении в течение 5 мин ультратонких волокон с наночастицами повышение температуры составило 9,4 ± 2,2 °С. Таким образом, удалось зафиксировать локальное повышение температуры при облучении свет-адсорбирующих наночастиц в составе нанокомпозитного материала. Несмотря на то, что вода вносит значительный вклад при фиксации нагрева данным методом, были проведены аналогичные измерения в водной фазе. Нагрев воды в контрольных опытах составил 4,1 ± 1,9 °С, тем не менее, в присутствии частиц локальное повышение температуры достигало 8°С. Таким образом, при дальнейших исследованиях in vitro и in vivo данная система позволит осуществить локальный нагрев, вызванный поглощением частицами БИК излучения. Кроме того, были получены нанокомпозитные материалы с кластерами наночастиц СuS-БСА и исследованы их фототермические свойства. Показано, что нанокомпозитные скаффолды с агрегатами наночастиц способны вызвать значительный локальный фототермический нагрев: так, облучение агрегатов в течение 5 мин приводило к повышению температуры на 27°С. Следовательно, такие паттерны модификации волокон являются перспективными кандидатами для практического применения. Исследование влияние режимов воздействия БИК на жизнеспособность клеток нейробластомы человека IMR-32 показало, что даже при длительном воздействии (15 мин) и плотности потока 6 Вт/см2 гибели клеток не происходит. Эти данные позволяют в дальнейшем использовать широкий диапазон параметров и режимов излучения в исследованиях фототермического действия БИК-трансформирующих скаффолдов. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту https://www.vesti.ru/nauka/article/2542219 https://www.osnmedia.ru/obshhestvo/rossijskie-uchenye-nashli-sposob-vosstanavlivat-nervy/?utm_source=yxnews&utm_medium=desktop&utm_referrer=https%3A%2F%2Fyandex.ru%2Fnews%2Fsearch%3Ftext%3D http://pushchinocity.ru/article/puschinskie-uchenye-sozdali-analog-naturalnoj-matritsy-dlya-rosta-nervnyh-okonchanij-251015 https://ai-news.ru/2021/03/uchenye_sozdali_analog_naturalnoj_matricy_dlya_rosta_nervnyh_okonchanij.html https://nauka.tass.ru/nauka/11003525 http://www.ras.ru/news/shownews.aspx?id=4f97c027-4e3e-49b9-bdad-259f4498021a#content https://riafan.ru/1414268-razrabotan-sposob-vosstanovleniya-nervnyh-kletok https://openscience.news/posts/2653-uchenye-sozdali-analog-naturalnoy-matritsy-dlya-rosta-nervnyh-okonchaniy

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Данный проект направлен на создание наноструктурированных скаффолдов для локальной тепловой модуляции клеточной активности действием ближнего инфракрасного излучения. Третий год работы по проекту был посвящен in vitro испытаниям созданных образцов клеточных подложек, состоящих из ориентированных биосовместимых нановолокон нейлона cо средним размером 100нм и нанонагревателей – свет-трансформующих наночастиц. Исследовались морфологические изменение культуры клеток нейробластомы человека и нейронов гиппокампа крысы, культивируемых на поверхности фототермической подложки под воздействием локального нагрева, вызываемого воздействием ближнего инфракрасного излучения. В ходе работы получены следующие результаты: 1. Получены экспериментальные образцы композитных клеточных скаффолдов обладающие фототермическими свойствами. Использованы два подхода включения нанонагревателей (CuS-БСА наночастицы) в состав волокнистого материала: химическая иммобилизация свет-конвертирующих наночастиц на поверхности волокон (материал AU2) и их внедрение внутрь волокон на стадии электроспиннинга (материал AU1). 2. Оценена эффективность фотоконверсии при облучении ближним инфракрасным (БИК) излучением для различных типов композитных скаффолдов. Оба типа композитных подложек демонстрируют близкую эффективность нагрева, существенно превышающую фоновый нагрев, возникающий при облучении немодифицированных подложек. 3. Исследована биосовместимость композитных скаффолдов на культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. В отсутствии стимуляции БИК излучением полученные композитные подложки не влияли на жизнеспособность дифференцированных клеток. Оценена минимальная интенсивность облучения, при которой начинал наблюдаться цитотоксический эффект повышения температуры. 4. Получены значения внутриклеточного изменения температуры нейронов гиппокампа крысы при БИК стимуляции на поверхности композитных скаффолдов. Максимальные значения внутриклеточной температуры были достигнуты на скаффолдах AU1. 5. Показано, что локальный нагрев на модифицированных волоконных подложках стимулирует нейрональную активность и приводит к высвобождению ионов кальция. Ранее подобный эффект был описан только для клеток с интернализованными нанонагревателями. 6. Проведен детальный анализ процесса дифференцировки клеток нейробластомы, связанной со стимуляцией нанотопологией поверхности. Показано, что в отсутствие БИК стимуляции скаффолды из модифицированных и немодифицированных нановолокон способствовали увеличению доли β3-тубулин-положительных клеток в популяции, однако, без существенного возрастания количества высокодифференцированных клеток. 7. Облучение клеток на фотоконвертирующих подложках усиливает рост отростков и обеспечивают нейрональное созревание. Показано, что топология волоконного материала увеличивает количество нейронов в процессе дифференцировки, а фототермическая стимуляция способствует удлинению нейритов и повышению доли высокодифференцированных клеток. 8. Исследовано нанотопологии и БИК стимуляции на поверхности композитных на удлинение и ветвление аксонов первичной культура гиппокампа крыс. Декорирование поверхности волокон наночастицами, как и в случае дифференцированных клеток нейробластомы, не влияет на ориентацию нейритов, которые остаются направленными вдоль волокон. При покрытии поверхности дополнительными наноразмерными элементами усиливается рост отростков даже в отсутствии термостимуляциию Эффект БИК стимуляции наиболее ярко выражен при культивировании нейронов на AU1 нановолокнах, для которых элонгация отростков увеличивалась в 2 раза по сравнению с необлученными образцами. 9. Для подробного исследования влияния ультраструктуры поверхности и на морфологию клеток были получены композитные подложки из ориентированных нейлоновых нановолокон, декорированные золотыми наночастицами с размером 5 нм с гидрофильным покрытием. Разработана методика и установка для эффективного напыления наночастиц на волокна, находящиеся на проводящей подложке 10. Исследование жизнеспособности дифференцированных клеток нейробластомы при культивировании на поверхности волокон с нанесенными 5 нм золотыми наночастицами показали, что полученные скаффолды улучшают адгезию клеток после покрытия поли-L-лизином и не оказывают цитотоксического действия. При анализе эффекта полученных нанотопологических стимулов обнаружено, что наночастицы золота способствуют появлению клеток с длинными отростками и, следовательно, способствуют дифференцировке. 11. Исследовано влияние фототермического воздействия на скорость протрузии мембраны при культивировании дифференцированных клеток нейробластомы на композитных скаффолдах: проанализирована скорость протрузии мембраны до начала воздействия БИК излучения и во время облучения. Показано, что при БИК-стимуляции клеток средняя скорость протрузии мембраны возрастает в 2 раза по сравнению со значениями, полученными до стимуляции. 12. Изучено влияние топологии поверхности композитного скаффолда и термо-индуцирующего воздействия нанонагревателей на рост аксонов органотипических эксплантатов (дорсальных корешковых ганглий крыс, ДКГ). Наличие наночастиц на поверхности скаффолда приводит к более эффективному разрастанию аксонов по сравнению с немодифицированными подложками. 13. БИК-облучение ДКГ, культивированных в гипергликемических условиях на немодифицированных скаффолдах, привело к снижению ингибирующего действия глюкозы и увеличению суммарной длины аксонов. При термостимуляции ДКГ, контактирующих с AU2 подложкой подавляющее рост аксонов действие высокой концентрации глюкозы полностью устраняется. Таким образом, фототермическая и механическая (нанотопология волокон, декорированных наночастицами) стимуляция способствует регенерации и росту аксонов ДКГ в модели метаболического повреждения нервов. 14. Изготовлены скаффолды из нейлоновых наноматов, содержащих два типа ориентированных нейлоновых волокон двух типов ультратонких и субмикронных. Комбинированный тип наноматериала (Mix) представляет интерес для дальнейшей работы, так как ультратонкие волокна способствуют ускорению направленного роста клеток, в то время как присутствующие субмикронные волокна выполняет армирующую функцию, улучшая механическую прочность получаемого наномата, что в перспективе представляется важным качеством ввиду необходимости формирования жгутов из наномата для заполнения искусственного нервного кондуита. 15. Изготовлен прототип искусственного нервного кондуита, состоящий из полимерной биоразлагаемой трубки из полилактид-ко-гликолида, заполненной жгутами, изготовленными из комбинированного Mix наноматериала, состоящего из ультратонких и субмикронных ориентированных нейлоновых нановолокон. 16. Разработана установка, позволяющая создавать паттерны из фотоконвертирующих наночастиц на клеточных подложках методом микропечати. Установка позволяет получать паттерны с различным размером и расстоянием между каплями как на ультратонких, так и на субмикронных волокнистых подложках. 17. Изготовлены полимерные пленки из поликапролактона, содержащие CuS-BSA наночастицы и обладающие фототермическими свойствами. Разработана методика получения, оценена эффективность фотоконверсии и термочувствительные свойства пленок, полученных при использовании меченных родмином Б нанонагревателей. В ходе работы за данный год опубликовано две работы в научных изданиях первого квартиля (Q1 по базе Scimago) и еще одна статья отправлена в редакцию. Также подана заявка на регистрацию патента на изобретение РФ. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту http://pushchinocity.ru/article/uchenye-sluchajno-sozdali-organoidy-mozga-na-skaffoldah-dlya-skrininga-lekarstv-285786 http://inpushchino.ru/novosti/nauka/uchyonye-sluchayno-sozdali-organoidy-mozga-na-skaffoldah-dlya-skrininga-lekarstv