Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Вирусы гепатита С и гриппа А являются широко распространенными и опасными патогенами человека. По данным ВОЗ ежегодно около 400 тыс. чел. умирают от осложнений, вызванных хроническим гепатитом С. Сезонный грипп А насчитывает в среднем около 4 млн тяжелых случаев год, из которых около 300 тыс. заканчиваются смертью больного. Исследования последних лет показали, что развитие широкого спектра патологий, включая рак, воспаление и фиброз, не просто включает, а зависит от изменения метаболизма клеток (в том числе метаболизм глюкозы и глутамина, полиаминов, пролина, цикл мочевины). Большинство известных данных касаются заболеваний неинфекционной природы, при этом влияние вирусных инфекций на статус метаболических путей и роль таких нарушений в патогенезе вирусов исследованы крайне мало. Существуют несколько свидетельств в пользу того, что некоторые вирусы способны влиять на процессы утилизации глюкозы, глутамина и метаболизм липидов. Однако статус других метаболических путей в инфицированных клетках остается неисследованным. Кроме того, даже имеющиеся данные получены в системах, в которых инфицированные клетки культивировали при использовании классических, но абсолютно не физиологических сред, сильно меняющих метаболизм. Данный проект направлен на изучение репликации вирусов гепатита С и гриппа А и влияния этих вирусов на метаболизм клетки-хозяина, при культивировании их на «физиологических» средах, состав которых приближен к плазме крови человека. Первый год исполнения проекта был посвящен исследованию различий в метаболизме пермиссивных к этим вирусам линий клеток, культивируемых в «стандартных» и «физиологических» средах. Нами было показано, что клетки линий карциномы печени (Huh7.5) и легкого (А549) в этой среде поддерживают рост в обеих типах сред, однако в случае культивирования на «физиологической» среде Plasmax скорость роста клеток снижена. В случае линии Huh7.5 показано изменение морфологии клеток при замене среды на Plasmax, для адаптации клеток к новой среде требуется около 6 суток. Найдено, что в культуральной среде Plasmax быстро истощаются компоненты, ввиду чего требуется ее ежедневная замена для предотвращения артефактных результатов. Нами было показано, что замена классических культуральных сред на среду Plasmax не влияет на процессы гликолиза линий карциномы, но усиливает процессы дыхания в митохондриях. Это сопровождается повышением чувствительности клеток к метаболическому ингибитору бромпирувату. Замена культуральной среды на Plasmax также приводит к изменению уровней экспрессии ряда ферментов метаболических путей, таких как гликолиз, глутаминолиз, цикл мочевины, метаболизм полиаминов. Кроме того, в рамках первого года исполнения проекта, нами было изучено влияние культуральных сред на кинетику развития инфекций вирусов гриппа А и гепатита С, а также влияние вируса гепатита С на метаболизм клетки. Установлено, что замена классических культуральных сред на Plasmax приводит к снижению уровней репродукции вирусов гепатита С и гриппа А, причем в случае первого это происходит в том числе на стадии репликации вирусного генома. В то же время, это не блокирует развитие инфекции полностью. Продемонстрировано, что вирус гепатита С действительно изменяет процессы цикла мочевины и метаболизма пролина, нарушая экспрессию ключевых генов этих путей. На первом году выполнения проекта нами были отработаны методики измерения концентраций полиаминов в клетках методами ТСХ и ВЭЖХ. С их помощью охарактеризованы изменения метаболизма полиаминов в клетках эндотелия, а также в клетках Huh7.5 при инфекции вирусом гепатита С. Показано, что что уже через несколько часов после внесения вируса уровень спермидина и спермина возрастает и к 5-7 дню значительно превышает контрольные концентрации неинфицированных гепатоцитов, за этим следует снижение уровней полиаминов в клетке, что сопровождается накоплением цитотоксического эффекта от репликации вируса и гибели клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Вирусные инфекции вызывают разнообразные острые и хронические заболевания человека, которые наносят вред сзоровью и создают риск гибели для пациентов. Среди таких инфекций можно выделить вирус гепатита С - один из двух основных этиологических агентов хронического заболевания печени, и вирус гриппа А, поражающий людей во всех странах. Оба вируса вызывают гибель огромного числа пациентов: в первом случае от цирроза и рака печени, во втором - от патологий дыхательной системы. Несмотря на огромный прогресс в их исследовании, механизмы их патогенеза остаются не полностью понятными. Считается, что развитие вирус-ассоциированных патологий является следствием в том числе нарушений редокс-систем и метаболических путей инфицированных клеток. Однако изучение таких нарушений затруднено вследствие отсутствия лабораторных моделей, которые бы воспроизводили редокс-статус и метаболизм клеток in vivo. В последние годы было показано, что одним из ограничивающих факторов являются общепринятые культуральные среды, которые сдвигают редокс-баланс в восстановленное состояние и кардинально меняют ряд метаболических путей (напр., цикла мочевины). В рамках данного проекта было предложено использовать культуральную среду Plasmax, состав которой имитирует состав плазмы крови человека. Для ее исследования были выбраны четыре клеточные линии: Huh7,5 (пермиссивна к вирусу гепатита С), А549 (поддерживает репликацию вируса гриппа), Hela (энтеровирусы) и VeroE6 (поддерживает репликацию SARS-CoV-2). Установлено, что замена стандартных культуральных сред меняет морфологию этих клеточных линий, снижая количество межклеточных контактов. Вместе с этим клетки, культивируемые в среде Plasmax, характеризуются заметно более высокой дыхательной активностью и продукции активных форм кислорода при отсутствии сходных изменений в процессах гликолиза. В соответствии с этим, клетки становятся более чувствительны к ингибиторам митохондриальных комплексов II и V. Установлено, что такие изменения в дыхании сопровождаются перестройкой митохондрий в протяженные сети, а также с повышением зависимости дыхания и жизнеспособности клеток от процессов окисления жирных кислот, вклад которых в цикл Кребса резко повышается. Наконец, продемонстрировано, что клетки в среде Plasmax поддерживают репликацию вирусов гепатита С, гриппа А и SARS-CoV-2, хотя и замедленную и на меньшем уровне. Тем не менее, такие клетки позволяют изучать вирус-индуцированные процессы метаболизма клеток. Кроме того, в проекте было найдено, что некоторые метаболические ингибиторы, включая ингибитор биосинтеза полиаминов DFMO и антиоксидант N-ацетилцистеин обладают иммуностимулирующим действием в мышах, иммунизируемых белком NS5B вируса гепатита С. Это может быть использовано в дальнейшем при разработке противовирусных вакцин.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Метаболизм клеток играет важную роль в поддержании их роста, дифференцировки и функционировании. Известно, что развитие широкого спектра патологий сопровождается перестройкой различных метаболических путей. В последнее десятилетие появились примеры того, то метаболические изменения являются не только следствием, но зачастую одним из факторов развития патологий. Так, найдено, что ряд опухолей нуждается в определенных метаболитов, в норме синтезируемых клетками (напр., серин, цистеин, аспарагин), что делает соответствующие метаболические ферменты мишенями для создания противораковых препаратов. Для аутоиммунных и других воспалительных заболеваний также имеются примеры ключевой роли метаболических ферментов в продукции определенных провоспалительных цитокинов или активации Т-клеток. Однако исследования метаболизма затруднены несовершеством лабораторных моделей. Одно из них заключается в изменениях метаболизма, вносимыми стандартными культуральными средами (ДМЕМ, ДМЕМ-F12, RPMI), отсутствие многих природных метаболитов в которых и нефизиологические концентрации других перестраивают метаболический ландшафт клетки. Основной целью настоящего проекта было использование плазма-подобной среды Plasmax для изучения метаболизма. В предыдущие годы мы продемонстрировали, что Plasmax вызывает усиление дыхательной активности митохондрий без изменения их массы, но при образовании сетевых структур. В отчетном году было установлено, что это изменение не было связано с повышением количества респирасом (суперкомплексов), нарушениями процессов биогенеза и утилизации митохондрий, а также их слияния/разобщения. Усиление дыхательной активности было следствием наличия в среде карнитина, который необходим для импорта продуктов окисления жирных кислот в митохондрии для их последующей утилизацией циклом Кребса. Другим результатом выполнения проекта стал факт более выраженного окислительного стресса в инфицированных РНК-вирусами клеток, культивируемых в среде Plasmax по сравнению с обычными средами. Это показывает, что среда Plasmax может быть востребована в редокс-биологии. Установлено также, что эта среда поддерживает репликацию различных онколитических вирусов, включая вирусы болезни Ньюкасла, Коксаки, полиомиелита и везикулярного стоматита. В отчетный период был проведен анализ транскриптома клеток, инфицированных вирусом гриппа. Установлено, что данная инфекция подавляет экспрессию генов гликолиза, метаболизма аминокислот и биосинтеза нуклеотидов и пиримидиновых оснований, но усиливает экспрессию ферментов биосинтеза полиаминов, ряда ферментов антиоксидантной защиты и белков лизосом и респираторных комплексов. В случае полиаминов показано повышение уровней полиаминов в инфицированных клетках, а также противовирусная активность ряда ферментов их метаболизма. Таким образом, все задачи проекта были выполнены.