Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Сигнальный каскад mTOR регулирует клеточный рост, отвечает на стрессовые воздействия, доступность питательных веществ и энергии. Нарушения в работе этого сигнального пути приводят к злокачественной трансформации клеток, развитию ожирения, диабета и других заболеваний. Регуляция трансляции – один из ключевых этапов mTOR-опосредованного ответа. Изучением молекулярного механизма mTOR-зависимой регуляции трансляции занимаются десятки лабораторий во всем мире уже более 30 лет, однако сложность этой многоуровневой регуляторной системы до сих пор не позволила определить все ключевые элементы. Ранее, мы обнаружили, что промоторные области генов вовлечены в mTOR-опосредованный трансляционный ответ. Однако детальный механизм данного процесса и его взаимосвязь с LARP1 не известны. Мы выдвинули гипотезу о том, что транскрипционные факторы связываются с m6A РНК-метилазами или деметилазами и регулируют метилирование вновь синтезированной мРНК. В цитоплазме метильные метки в мРНК определяют ее взаимодействие с LARP1 и/или трансляционный mTOR-зависимый ответ. В ходе выполнения проекта в отчетном году было обнаружено, что вовлеченность промоторных областей в mTOR-опосредованный трансляционный ответ наблюдается не только для классических мишеней, таких как рибосомный белок RPL32, но и для неканонической мишени бета-актина (ACTB). Кроме того, была проведена подготовительная работа для изучения влияния промоторных областей на m6A метилирование и его взаимосвязь с LARP1 и mTOR-опосредованным трансляционным ответом. Были получены клеточные линии нокаутные по белку LARP1, а также по m6A деметилизам FTO и ALKBH5. Оптимизированы условия для определения степени метилирования репортерных мРНК, синтезированных с разных промоторов. Влияние m6A метилирования на трансляцию активно изучается и были выдвинуты гипотезы о его вкладе в скорость элонгации трансляции, события прочтения через стоп-кодон и функционировании коротких регуляторных рамок в 5’ нетранслируемой области. Однако эксперименты были проведены на единичных примерах и было не понятно, насколько данные механизмы реализуются в масштабах транскриптома. Мы постарались ответить на данный вопрос и провели детальный анализ опубликованных данных рибосомного профайлинга в клетках со сниженным количеством белков метилирующего комплекса (METLL3, METLL14, WTAP) и повышенным количеством деметилазы FTO. Оказалось, что в масштабах транскриптома снижение m6A метилирования в клетках не приводит к изменению полярности расположения рибосом вдоль транскрипта, или другими словами к изменению скорости элонгации. Наблюдаемые изменения в количестве рибосом на 5’ и 3’ нетранслируемых областях не согласуются между различными экспериментами и, вероятно, являются следствием особенностей экспериментальных протоколов, а не снижением m6A метилирования в клетках. Таким образом, результаты, полученные в ходе детального анализа данных Ribo-Seq, заставляют задуматься о том, что m6A метилирование играет слабую роль в регуляции трансляции в нормальных условиях роста клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Сигнальный каскад mTOR регулирует клеточный рост, отвечает на стрессовые воздействия, доступность питательных веществ и энергии. Нарушения в работе этого сигнального пути приводят к злокачественной трансформации клеток, развитию ожирения, диабета и других заболеваний. Регуляция трансляции – один из ключевых этапов mTOR-опосредованного ответа. Изучением молекулярного механизма mTOR-зависимой регуляции трансляции занимаются десятки лабораторий во всем мире уже более 30 лет, однако сложность этой многоуровневой регуляторной системы до сих пор не позволила определить все ключевые элементы. Ранее, мы обнаружили, что промоторные области генов вовлечены в mTOR-опосредованный трансляционный ответ. Однако детальный механизм данного процесса не изучен. Мы выдвинули гипотезу о том, что транскрипционные факторы E2F1 и YY1 связываются с m6A РНК-метилазами или деметилазами и регулируют метилирование вновь синтезированной мРНК. В цитоплазме метильные метки в мРНК определяют трансляционный mTOR-зависимый ответ. В ходе выполнения проекта в отчетном году была проверена гипотеза об участии деметилаз в промотор-опосредованной mTOR-зависимой регуляции трансляции. Для этого была получена клеточная линия нокаутная по деметилазам FTO и ALKBH5. На примере репортерной мРНК RPL32, мы показали, что ингибирование трансляции репортерных мРНК, синтезированных с промотора дикого типа и с мутациями в сайтах связывания транскрипционных факторов E2F и YY1 происходит в той же степени, что и в исходных клетках, что исключает участие деметилаз в mTOR-зависимой регуляции трансляции мРНК RPL32. Для того, чтобы выяснить влияют ли транскрипционные факторы E2F1 и YY1 на уровень m6A-метилирования РНК мы провели эксперимент по иммунопреципитации РНК за антитела против m6A. Оказалось, что репортерная мРНК RPL32, синтезированная как с исходного промотора, так и с промотора с мутациями в сайтах связывания E2F1 и YY1 не содержит модификации m6A. В совокупности, эксперименты по иммунопреципитации РНК и исследованию регуляции трансляции в клетках, нокаутных по деметилазам FTO и ALKBH5, позволяют сделать вывод о том, что m6A-метилирование не участвует в промотор-опосредованной mTOR-зависимой регуляции трансляции мРНК RPL32, и вероятно, других классических мРНК-мишеней. Известно, что белок LARP1 – один из главных регуляторов mTOR-зависимой трансляции. Мы проверили, как его нокаут влияет на промотор-опосредованную mTOR-зависимую регуляцию трансляции. Оказалось, что при нокауте LARP1 mTOR-зависимая регуляция трансляции репортерной мРНК RPL32 снимается не полностью. Однако, для мРНК, синтезированной с промотора с мутациями в сайтах связывания E2F1 и YY1, mTOR-зависимая трансляции полностью исчезает. Таким образом, существуют два независимых механизма. Один - при участии белка LARP1, а другой через ко-транскрипционную модификацию мРНК, модулируемую E2F1 и YY1. Был оптимизирован метод гель-шифт для изучения влияния мутаций в ДНК на связывание транскрипционных факторов. Мы показали, что внесенные мутации в изучаемый сайт связывания YY1, действительно, ухудшили связывание YY1. В процессе оптимизации метода мы выяснили, что другой транскрипционный фактор, CEBPB, лучше связывается с одноцепочечной заменой C>T в CpG-паре в составе двуцепочечного ДНК-сайта. Это явление объясняет, почему в сайтах связывания белков семейства C/EBP чаще, чем ожидается, обнаруживаются соматические мутации в стволовых и раковых клетках. Для выяснения, как нокаут деметилаз повлиял на трансляцию в масшатабах всего транскриптома, были получены и отсеквенированы библиотеки RNA-Seq и Ribo-Seq для контрольных клеток HEK293T и клеток HEK293T с двойным нокаутом деметилаз ΔFTO ΔALKBH5. Ранее мы предположили, что m6A метилирование, и метилазы METTL3 и METTL14 в частности, играют слабую роль в регуляции трансляции в нормальных условиях роста клеток. Были проанализировано, как изменяется количество ферментов метильного обмена в различных стрессовых условиях.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Сигнальный каскад mTOR регулирует клеточный рост, отвечает на стрессовые воздействия, доступность питательных веществ и энергии. Нарушения в работе этого сигнального пути приводят к злокачественной трансформации клеток, развитию ожирения, диабета и других заболеваний. Регуляция трансляции – один из ключевых этапов mTOR-опосредованного ответа. Изучением молекулярного механизма mTOR-зависимой регуляции трансляции занимаются десятки лабораторий во всем мире уже более 30 лет, однако сложность этой многоуровневой регуляторной системы до сих пор не позволила определить все ключевые элементы. Ранее, мы обнаружили, что промоторные области генов вовлечены в mTOR-опосредованный трансляционный ответ, но детальный механизм данного процесса не был изучен. Мы выдвинули гипотезу о том, что транскрипционные факторы E2F1 и YY1 связываются с m6A РНК-метилазами или деметилазами и регулируют метилирование вновь синтезированной мРНК. В цитоплазме метильные метки в мРНК определяют трансляционный mTOR-зависимый ответ. В ходе выполнения проекта в отчетном году была проверена гипотеза об участии метилаз в промотор-опосредованной mTOR-зависимой регуляции трансляции. Для этого в клетках с помощью siRNA понижали количество METTL3 и METTL14. На примере репортерной мРНК RPL32, мы показали, что в таких клетках ингибирование трансляции репортерных мРНК, синтезированных с промотора дикого типа и с мутациями в сайтах связывания транскрипционных факторов E2F и YY1 происходит в той же степени, что и в исходных клетках. Это исключает участие метилаз в mTOR-зависимой регуляции трансляции мРНК RPL32. Однако, трансляция контрольной репортерной мРНК SLU7 в клетках с пониженным количеством METTL3 и METTL14 ингибировалась значительно сильнее, чем в клетках дикого типа. Мы предполагаем, что мРНК SLU7 содержит m6A-метки, которые обеспечивают устойчивость ее трансляции к ингибированию mTOR в клетках дикого типа. Для выяснения, как нокдаун метилаз повлиял на трансляцию в масшатабах всего транскриптома, были получены и отсеквенированы библиотеки RNA-Seq и Ribo-Seq для контрольных клеток HEK293T и клеток HEK293T с двойным нокдауном метилаз METTL3 и METTL14 в нормальных условиях роста и в условиях ингибирования mTOR. Кроме того, были выявлены группы мРНК, чье количество, трансляция или альтернативный сплайсинг регулируется при нокауте деметилаз ΔFTOΔALKBH5. Большинство изменений произошло на уровне количества РНК (изменилось около 20% транскриптома). Однако доля метилированных мРНК была наибольшей среди тех, чья трансляция возросла. Можно предположить, что именно они являются основными мишенями деметилаз. Кроме того, было обнаружено, что группа альтернативно-сплайсируемых мРНК обогащена теми, чьи продукты вовлечены в 2’О-метилирование рибосомальной РНК. Мы предполагаем, что в клетках с нокаутом деметилаз рибосомы имеют другой паттерн 2’О-метилирования рРНК, что может влиять на трансляцию ряда мРНК в клетках.