КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-74-10055

НазваниеСравнительная геномика, филогеографические паттерны и патогенный потенциал современных вариантов вирусов семейства Pneumoviridae.

РуководительШаршов Кирилл Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины», Новосибирская обл

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2022  , продлен на 07.2022 - 06.2024. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словабиогенные угрозы, ортопневмовирус человека, метапневмовирус человека, генетическое разнообразие, филогеографические паттерны, патогенный потенциал, клеточные модели культивирования, маркеры патогенности

Код ГРНТИ34.25.21


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Значительная генетическая изменчивость РНК-содержащих вирусов и, вследствие этого, гетерогенность популяции циркулирующих вирусов одного вида обусловливает опасность таких инфекционных агентов. Накопление мутаций в антигенных сайтах обеспечивает "ускользание" вирусов от существующего популяционного иммунитета, что приводит к возможности многократного заражения различными вариантами одного и того же вируса в течение жизни, а также вызывает сложности в разработке вакцин. Увеличивающееся в геометрической прогрессии число доступных в базах данных нуклеотидных последовательностей обусловливает необходимость анализа и усовершенствования классификации вирусных патогенов, в частности, пневмовирусов. Накопленные данные о генетическом разнообразии циркулирующих в мире пневмовирусов человека уже привели к пересмотру существовавшей классификации и к выделению в 2016 г. нового семейства РНК-содержащих вирусов – Pneumoviridae, в которое вошли метапневмовирус человека и ортопневмовирус человека (ранее – респираторно-синцитиальный вирус). Актуальность обозначенной проблемы, помимо огромного фундаментального значения знаний о механизмах формирования филогеографических паттернов патогенов, обусловлена той социальной значимостью, которую имеют вирусы семейства Pneumoviridae для общественного здравоохранения во всем мире. Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) и метапневмовирус человека (HMPV) - наиболее значимые инфекционные агенты для детей раннего возраста. Оба вируса вызывают инфекцию верхних и нижних отделов респираторного тракта, которая может привести к бронхиолиту или пневмонии. В последние годы стало известно о различиях в патогенном потенциале основных генотипов/субтипов, что обусловливает тяжесть течения заболевания и выбор диагностической и лечебной тактики. Известно также, что заболевания, вызванные ортопневмовирусом человека, занимают ведущее место в структуре острой респираторной патологии, и приводят к значительному числу тяжелых случаев течения заболевания с развитием осложнений, особенно у детей раннего возраста. Так, в 2015 году было подсчитано, что RSV привел к 33,1 миллионам эпизодов инфекции нижних дыхательных путей (бронхиолит и пневмония), что повлекло за собой 3,2 миллиона госпитализаций и около 120 000 смертей во всем мире у детей младше пяти лет. Информация о генетическом разнообразии пневмовирусов человека, циркулирующих на территории России и большинства стран категории развивающихся, отсутствует. По состоянию на начало 2019 г. детальная информация известна только для территорий Китая, Австралии и США. В связи с этим решение проблемы выявления различных филогеографических паттернов и оценка генетического разнообразия основных вариантов вируса представляется крайне затруднительной. Не представляется возможным масштабно оценить эволюционную динамику основных генотипов нового семейства Pneumoviridae на территории Северной Евразии. Актуальность и перспективность разработки данной проблемы очевидна. Таким образом, научной проблемой на решение которой направлен проект, является недостаток актуальных данных об изменчивости и генетическом разнообразии циркулирующей в Евразии популяции вирусов семейства Pneumoviridae, что обусловливает сложность диагностики, изучения биологических свойств, классификации и вакцинопрофилактики этих патогенов. В целом, проект направлен на выявление фундаментальных особенностей формирования филогеографических паттернов распространения нового семейства Pneumoviridae. Выше перечисленные факты позволяют рассматривать выбранный объект исследования как чрезвычайно информативный. Предлагаемое исследование позволяет решать другие фундаментальные задачи – анализировать эволюционную динамику и паттерны распространения РНК-содержащих вирусных патогенов под влиянием природных и антропогенных факторов, а также практические задачи диагностики и прогнозирования эпидемий. В целом это даст уникальную возможность получить целостное представление о глобальной схеме распространения вирусов семейства Pneumoviridae. Важнейшая составляющая проекта — это международная коллаборация в рамках впервые создаваемого в данном Проекте международного консорциума по исследованию Pneumoviridae. В него войдут Национальный Центр по гриппу на базе ФГБУ «НИИ гриппа им. Смородинцева» Минздрава России, участвующий в международных проектах Глобального госпитального надзора за гриппом, и Институты Китая и Японии, с которыми у организации имеются договоры о сотрудничестве. Международные коллаборации имеют решающее значение для реализации отдельных подзадач проекта и повлияют положительно на достижение цели Проекта. Дополнительно планируется детальная вирусологическая характеризация созданной коллекции. Планируемая в ходе выполнения проекта оптимизация биологических моделей культивирования пневмовирусов необходима для совершенствования подходов к разработке вакцин и новых препаратов для лечения и профилактики пневмовирусной инфекции у человека. Полученные данные могут быть использованы в области контроля распространения эпидемических штаммов вируса. Подобное фундаментальное исследование является базовым и перспективным для международного сообщества и имеет огромное прикладное значение в области здравоохранения и биобезопасности. Исполнители имеют многолетний результативный опыт работ и значительный задел в области вирусологии, что послужит базой для эффективного выполнения заявляемого Проекта.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены следующие основные результаты: 1) Будет создана уникальная, комплексно охарактеризованная коллекция (предположительно 100 изолятов) современных штаммов пневмовирусов, циркулирующих на территории Евразии (Сибирский федеральный округ, Восточная Сибирь, Приморский край, Европейская часть России, Республика Казахстан), в том числе: - будут проведен молекулярно-биологический анализ полногеномных последовательностей выделенных нами пневмовирусов, циркулирующих на территории Евразии. Полученные данные будут уникальны, поскольку в международных базах данных отсутствует информация о вирусах в России, Казахстане; Преимуществом проекта является включение в масштабный анализ оригинальных последовательностей, полученных от коллабораторов в рамках создаваемого Консорциума (Институт микробиологии, Пекин; Международный центр по исследованию и раннему предупреждению гриппа, Пекин, Китайская Академия Наук (CAS Center for Influenza Research and Early-warning - CASCIRE). - будут изучены антигенные характеристики белка F (белок слияния) орто- и метапневмовирусов, ответственного за проникновение вируса в клетку хозяина, на основании картирования антигенных сайтов, а также будут получены данные о генетической вариабельности антигенных сайтов выделенных нами штаммов пневмовирусов. Такие данные позволят сделать вывод о возможной роли данных сайтов как «мишеней» для вакцин против пневмовирусов и специфических лечебных и профилактических препаратов. Полученные штаммы могут быть использованы для создания диагностических тест-систем, а также для выполнения работ по изучению патогенеза вирусных инфекций и тестированию новых лекарственных препаратов с противовирусной активностью на моделях in vitro и in vivo. 2) По результатам анализа полногеномных последовательностей пневмовирусов как выделенных нами штаммов, так и доступных в международной базе данных GenBank, будет предложена альтернативная классификация пневмовирусов человека. Проблема несовершенства обнаружена при анализе литературы последних лет, до 2018г. (см пункт "Состояние".) 3) В ходе анализа генетического разнообразия пневмовирусов, циркулирующих в России, будут выявлены генотипы, ассоциированные с тяжелым течением заболевания (на основании анализа данных о клиническом течении заболеваний у пациентов, от которых получен клинический материал). 4) Впервые будет проверена гипотеза о существовании филогеографических паттернов современных вариантов пневмовирусов в Евразии. Подобная попытка была осуществлена в 2018 г. Vicente Mas с соавт. (приложение), однако она имеет существенный недостаток: в данной работе для анализа использованы последовательности генов штаммов орто- и метапневмовирусов, циркулирующих в ограниченном количестве стран - преимущественно в США и в Китае. В настоящее время в генбанке доступно 1686 последовательностей респираторно-синцитиального вируса (полногеномные и частичные, но близкие к полногеномным по размеру), при этом нет ни одной полногеномной последовательности штаммов из России. Таким образом, данные, полученные в настоящем проекте, значительно расширят представления о филогеографических паттернах пневмовирусов человека, что крайне необходимо при реализации программ по контролю заболеваемости, вызванной данными патогенами. 5) Впервые будут получены результаты скрининга различных клеточных культур для выделения и культивирования современных природных изолятов орто- и метапневмовирусов, будут подобраны оптимальные условия культивирования и будет предложена наиболее оптимальная клеточная модель. 6) Поскольку последовательности геномов будут получены как из первичного клинического материала, так и для штаммов, выделенных в различных клеточных культурах, будут проведена сравнительная оценка изменчивости генов вирусов при культивировании. Это позволит выбрать систему культивирования вируса, приводящую к наименьшим генетическим изменениям, и оптимизировать условия наработки штаммов для последующего их использования в диагностических тест-системах и в производстве вакцины. 7) Будут получены Будет проверена адекватность модели культивирования современных вараинтов вирусов Pneumoviridae на ранее известной модели in vivo (мыши-сосунки). 8) Впервые будет разработан сет праймеров и оптимизирована схема амплификации для определения генетической группы ортопнвмовируса человека 9) Будут получены РИД (заявки на патенты), а именно: - на штамм ортопневмовируса человека для создания диагностических, вакцинных препаратов - праймеры для определения субтипов ортопневмовируса человека. 10) По результатам проекта будет опубликовано не менее 8 статей в следующих журналах, индексируемых в Scopus/Web of Science: Virus genes, импакт фактор - 1.769 Virus research, импакт фактор – 2.745 PLOS One, импакт фактор – 3.730 Virology journal, импакт фактор – 2.09 Journal of general virology, импакт фактор – 3.127 Archives of Virology, импакт фактор - 2.255 Journal of Clinical Microbiology, импакт фактор - 2.44 Emerging Infectious Diseases, импакт фактор – 7.42 11) Полученные результаты обязательно будут представлены международных конференциях, в том числе: - на основной крупной международной конференции, посвященной вопросам изучения РСВ-инфекции, - International Respiratory Syncytial Virus Symposium; - на международной конференции, посвященной проблемам инфекционной патологии в педиатрии, - World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases. Основной результат -это проверка рабочей гипотезы (пункт 4). Эти фундаментальные данные, полученные в ходе заявляемого проекта внесут вклад в усовершенствование и оптимизацию диагностической тактики, а также мероприятий по контролю и профилактике респираторных вирусных инфекций, для прогнозирования распространения эпидемического процесса. Данные о генетическом разнообразии циркулирующих в России респираторных вирусов, а также оптимизация способов их культивирования являются важной информацией для разработки вакцин и новых препаратов для лечения и профилактики ОРВИ. Подобные разработки позволят существенно повысить эффективность профилактических и лечебных мероприятий, сократить показатели временной нетрудоспособности населения, частоту осложнений, включая смертельные исходы болезни. Таким образом, ожидаемые научные результаты будут соответствовать мировому уровню и внесут значительный вклад в решение конкретных ключевых задач в рамках приоритета. Будут иметь большое фундаментальное значение для таксономического статуса и классификации вируса внутри семейства. Создаваемый задел и полученные результаты будут востребованы в экономике и социальной сфере, поскольку тема Проекта полностью соответствует научному приоритету и интересам РФ в области здравоохранения и противодействия биогенным угрозам.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках первого этапа Проекта был организован систематизированный и стандартизованный сбор клинического материала в различных регионах Сибири (Новосибирская и Иркутская области, Республика Якутия). Всего в трех регионах Сибири собрано 1752 образца - мазков из носа и зева от пациентов с симптомами ОРВИ. Сформирована коллекция образцов. С врачами из партнерских организаций были проведены обучающие он-лайн семинары, в ходе которых были обсуждены цели и задачи настоящего исследования, проведено обучение технике взятия образцов, условиям хранения и транспортирования собранного материала. В собранном клиническом материале от больных с симптомами ОРВИ выявлен генетический материал респираторных вирусов, включая орто- (hRsv) и метапневмовирусы (hMpv) человека, а также вирусы гриппа (hIfv) А и В, риновирус (hRv), вирусы парагриппа (hPiv), коронавирусы человека (hCov) – OC43, 229E, NL63, HKU1, аденовирус (hAdv) и бокавирус (hBov). В Республике Якутия генетический материал респираторных вирусов был обнаружен в 61%, причем в 46% случаев выявлена моноинфекция, а в 15% - вирусная ко-инфекция. Наиболее часто встречающимися вирусами оказались бокавирус и вирусы парагриппа, составив 31% и 24% из всех проанализированных образцов. Метапневмовирус был выявлен у одного пациента. Хотя бы один из перечисленных вирусов был выявлен в 970 из 1325 (73,2%) образцов, собранных в г. Новосибирске. Показано, что ведущим этиологическим агентом у взрослых пациентов в период с января по апрель 2020 г. явился вирус гриппа, составив 63,9% (163/255) случаев у обследованных пациентов. При этом наблюдалась совместная циркуляция вируса гриппа В (68,7% от всех случаев гриппа) и вируса гриппа A(H1N1)pdm09 (27%), в то время как вирус гриппа A(Н3N2) был выявлен у одного пациента (0,6%), в 3,7% случаев вирус гриппа А не типировался. ОРВИ негриппозной этиологии у взрослых были вызваны преимущественно риновирусом (в 5,1% случаев) и вирусами парагриппа (в 4,3% случаев). Ортопневмовирус человека был выявлен у 2,3% обследованных пациентов, метапневмовирус – у 0,4% пациентов. Ортопневмовирус человека был выявлен у 227 (21,2%) обследованных детей и обнаруживался в течение всего периода наблюдения. Метапневмовирус человека в течение сезона 2019 – 2020 гг. был выявлен только у 1,6% (17/1070) обследованных детей и 0,4% (1/255) взрослых пациентов. При этом наиболее часто он выявлялся у детей возрастной группы 4 – 6 лет. Все образцы клинического материала, собранные в ходе выполнения проекта в 2019 – 2020 гг., а также в течение двух предыдущих эпидемических сезонов, и положительные в ПЦР на ортопневмовирус человека, использовали для выделения штаммов вируса в культурах клеток. Наиболее выраженный цитопатический эффект вируса мы обнаружили при инфицировании суспензии культур клеток HeLa и Hep2 с последующей обработкой инфицированных клеток нейраминидазой, причем некоторые штаммы были выделены в обеих культурах клеток, в то время как другие вызывали цитопатический эффект только в какой-то одной клеточной линии. Таким образом, было принято решение в дальнейшем для выделения штаммов респираторно-синцитиального вируса использовать обе культуры клеток. Было выделено 15 штаммов респираторно-синцитиального вируса, вызывающих устойчивый цитопатический эффект в виде образования синцития клеток в ходе пассирования. Создана Коллекция штаммов вирусов семейства Pneumoviridae; штамм RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2018 принят на патентное депонирование под номером V-902 в Государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Получено более 50 изображений при исследовании методами световой и конфокальной микроскопии, анализ и публикация которых запланированы на второй этап Проекта. Была оптимизирована система ПЦР-диагностики RSV. В результате ПЦР в реальном времени для дифференциального выявления RSV субтипов А и В было показано, что контрольные штаммы RSVсубтипов А и В специфично идентифицируются соответствующими праймерами и флуоресцентными зондами. Впервые получены единственные в РФ нуклеотидные последовательности полных геномов 12 штаммов RSV субтипов А и В. Все последовательности геномов задепонированы в международную базу данных GenBank. Впервые описаны делеции и инсерции в генах структурных и функциональных белков. Согласно BLAST-анализу полногеномных последовательностей штаммов субтипа В, выделенных в Новосибирске в течение двух эпидемических сезонов (2018-2019 и 2019-2020 гг), все штаммы более чем на 90% (99,35-99,70%) схожи с одними и теми же вариантами RSV, выделенными в Японии, Китае, Филиппинах, Аргентине, США и в Великобритании с 2013 по 2019 гг. Таким образом, пул ортопневмовирусов незначительно генетически отличающихся от выделенных в Новосибирске, территориально широко распространен по различным географическим регионам и циркулирует в течение нескольких эпидемических сезонов. Нуклеотидные последовательности геномов штаммов RSV субтипа А схожи с последовательностями вариантов ортопневмовирусов, выделенных в 2011-2013 гг. и 2018-2019 гг. в Азиатском регионе (Филиппины, Китай, Таиланд, Индия) и в США. В целом, согласно анализу генетических дистанций и BLAST-анализу, исследованные штаммы характеризуются значительным (вплоть до 100%) сходством между собой в пределах субтипов (А и В), а также со штаммами, выделенными в различных странах в течение нескольких лет. Кроме того, согласно результатам анализа генетических дистанций (данные не представлены вследствие превышения допустимого объема иллюстративного материала) рассматриваемых штаммов от штаммов, определенных в результате BLAST-исследования, показано, что генетические дистанции среди российских штаммов не превышают таковые между ними и BLAST-вариантами. Сходство штаммов RSV, выделенных в Новосибирске со штаммами, выделенными в разных, географически отдаленных регионах мира в течение нескольких эпидемических сезонов, указывает на существование консервативных генетических кластеров схожих вариантов вируса, сохраняющихся в течение нескольких лет и распространяющихся в человеческой популяции на значительные расстояния. Согласно анализу аминокислотных последовательностей, G белки всех исследованных штаммов RSV содержат дупликации фрагментов 239-258 и 259-279 (Okamoto и др., 2018). При этом штаммы 66Hi и 66Hp в этих участках содержат 240G, 251Y и 265P, в то время как остальные штаммы содержат аминокислотные остатки 240R, 251D и 265S. Штамм RSVB/Novosibirsk/242/2019 содержит в G-белке аминокислотные замены R260G и T253A (потенциально может влиять на сайты O-гликозилирования, что в свою очередь может обуславливать избегание патогеном антител организма-хозяина (Collins, Karron, 2013)). Штаммы RSVB/Novosibirsk/50Hl/2018 и RSVB/Novosibirsk/50Hp/2018 содержат замены T279A и T254S. В антигенном сайте I F-белка у штамма RSVB/Novosibirsk/242/2019 наблюдается замена в сайте S380N, которая потенциально может снижать эффективность иммунного ответа. Остальные антигенные детерминанты остаются консервативными внутри групп (субтипов А и В) исследованных штаммов. Впервые показано, что согласно филогенетическому исследованию, все выделенные в Новосибирске в течение двух эпидемических сезонов (2018-2019 и 2019-2020 гг) штаммы субтипа В относятся к генотипу ВА10, при том, что доминирующим генотипом RSV субтипа В является более ранний ВА9. Все новосибирские штаммы RSV субтипа принадлежат к доминирующему в мире с эпидемического сезона 2011-2012 гг. генотипу ОN1. Проведены детальные филогенетические исследования генов F и G. В целом, согласно филогенетическому анализу, штаммы RSV, выделенные в Новосибирске в течение двух эпидемических сезонов и исследованные в рамках работы по проекту принадлежат к обоим известным субтипам (А и В) как по результатам анализа полных геномов, так и G и F генов. Все штаммы субтипа А схожи (до полной идентичности нуклеотидных последовательностей нескольких штаммов) между собой и представлены генотипом ON1, который с 2011 г. является доминирующим в пределах субтипа. Все штаммы субтипа В также филогенетически родственны и принадлежат к генотипу ВА10, который известен с 2013 г., получил распространение в 2015-2017 гг., но, в отличие от ON1 не является доминирующим в пределах соответствующего субтипа По результатам первого этапа опубликовано 3 статьи, основные результаты представлены на международных конференциях. В публикациях на начальном этапе представлены предварительные результаты по эпидемиологии респираторных вирусов и оптимизации методов их исследований in vitro, в том числе на модели вируса гриппа. Подготовлен проект патента на штамм для диагностики – РИД в следующем этапе. Результаты представлены на трех международных и российских конференциях. Результаты Проекта освещены в научно-популярном издании Сибирского отделения РАН «Наука в Сибири». Опубликовано интервью основного исполнителя Проекта к.м.н. Курской О.Г. об исследованиях распространенности штаммов вирусов ОРВИ и гриппа (http://www.sbras.info/articles/science/sibirskie-uchenye-issleduyut-rasprostranennost-shtammov-virusov-orvi-i-grippa). Таким образом, получены все запланированные результаты, соответствующие общему плану выполнения Проекта; они позволят эффективно реализовать последующие этапы в соответствии с планом.

 

Публикации

1. - Сибирские ученые исследуют распространенность штаммов вирусов ОРВИ и гриппа «Наука в Сибири» — газета Сибирского отделения РАН, Интервью от 29 апреля 2020 г. основного исполнителя Проекта, кандидата медицинских наук по специальности медицинская вирусология Курской О.Г. Присутствует ссылка на Проект. Опубликовано 6 мая 2020. (год публикации - ).

2. Курская О.Г., Аношина А.В., Леонова Н.В., ..... Алексеев А.Ю., Даниленко Д.М., Комиссаров А.Б., Столяров К.А., Фадеев А.В., Соминина А.А., Шестопалов А.М., Шаршов К.А. Этиология гриппоподобных заболеваний у г. Новосибирска во время эпидемического сезона 2018 – 2019 гг. Инфекция и иммунитет, - (год публикации - 2020).

3. Прокопьева Е.А, Курская О.Г., Соболев И.А., Соломатина М.В., Мурашкина Т.А., Суворова А., Алексеев А.Ю., Даниленко Д.М., Комиссаров А.Б., Фадеев А., Edward Ramsay, Шестопалов А.М., Дыгай А.М., Шаршов К.А. Experimental Infection Using Mouse-Adapted Influenza B Virus in a Mouse Model Viruses, Viruses 2020, 12, 470; doi:10.3390/v12040470 (год публикации - 2020).

4. Прокопьева Е.А., Курская О.Г., Соломатина М.В., Соболев И.А., Мурашкина Т.А., Дёрко А.А., Корчагина К.В., Юнусова А.Ю., Алексеев А.Ю., Шестопалов А.М., Сысолятин С.В., Ворожцов А.Б., Ваизова О.Е., Шерстобоев Е.Ю., Шаршов К.А., Дыгай А.М. Вариант вируса гриппа В, адаптированный к мышам, для изучения лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo ЖУРНАЛ ИНФЕКТОЛОГИИ, Том 11, № 4, 2019, с. 53-62 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе этого этапа работы пришлось скорректировать по причине распространения вируса SARS-Cov2. Этиологическая структура респираторных вирусов изменилась, изменилось соотношение основных и минорных патогенов (см спец. раздел отчета). В связи с этим в работе сместились некоторые акценты, что, однако, сделало результаты проекта еще более важными и актуальными. Расширился спектр изучаемых респираторных вирусов в проекте. Так, нами впервые в режиме он-лайн отслеживается изменение структуры ОРВИ во время возникновения пандемии нового респираторного вируса, это наиболее ценный результат на данном этапе проекта. Также в апреле 2020 впервые изучены штаммы SARS-Cov2, циркулирующие в Новосибирске, получены и проанализированы полногеномные нуклеотидные последовательности 5 штаммов. Получены запланированные результаты мониторинга вирусов, создана коллекция образцов и проведена оптимизация вирусологических работ и моделей. Среди респираторных вирусов наиболее часто встречались вирусы парагриппа – 11,8% (19/161), риновирус – 10,6% (17/161), метапневмовирус – 6,2% (10/161), коронавирус (NL 63, 229E, HKU-1,OC 43) – 4,3% (7/161) и аденовирус – 3,7% (6/161), бокавирус и ортопневмовирус – по 2,5%, соответственно (4/161 и 4/161). У 15/161 (9,3%) детей наблюдалась вирусная ко-инфекция. Возрастных и половых различий в частоте встречаемости респираторных вирусов выявлено не было. При сравнении структуры ОРВИ в разных регионах Сибири в ПРЕДПАНДЕМИЧЕСКОМ сезоне 2019 – 2020 гг. были выявлены отличия, которые проанализированы в ходе работ на втором этапе. Кроме того, оценивая распространение респираторных вирусов в течение сезона 2020 – 2021 гг., следует отметить, что риновирус наиболее часто выявлялся в ноябре (21,1%) и апреле (22,7%), в то время как метапневмовирус наиболее активно циркулировал в феврале (41,6%) и марте (41,3%). Сезонные коронавирусы человека также наиболее часто выявлялись в феврале (19,2%) и марте (18,1%). Таким образом, во время второй волны пандемии нового коронавируса мы наблюдали значительной изменение структуры ОРВИ по сравнению с предпандемическим сезоном, а именно: • более низкий уровень выявления респираторных вирусов в целом, особенно в ноябре-декабре 2020 г., • отсутствие случаев ОРВИ, вызванных вирусами гриппа, а также крайне низкий уровень выявления ортопневмовируса человека (0,2%), являвшихся ведущими этиологическими агентами в сезоне 2019-2020 гг., • - доминирующими вирусами в структуре ОРВИ в текущем сезоне оказались метапневмовирус (27,3%), риновирус (15,2%) и сезонные коронавирусы человека (не SARS-Cov2)(13,3%). Впервые проведена работа по визуализации in vitro штаммов респираторно-синцитиального вируса и метапневмовируса методом световой и флуоресцентной микроскопии. Анализ в режиме DIC-contrast показал морфологическое строение синцития, образованного инфицированными штаммом RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2019 с характерным расположением ядер по периферии образования и центральной зоной. При окраске меченными флуоресциином специфическими антителами обнаружена яркая окраска центральной зоны, что свидетельствует о локализации вирусного материала РСВ в этой части образования. Важнейшим результатом явилось изучение в апреле 2020 штаммов SARS-Cov2, циркулирующих в Новосибирске, получены полногеномные нуклеотидные последовательности 5 штаммов. Проведена работа по оптимизации культивирования SARS-Cov2 и использование их в прикладных исследованиях по фотодинамической инактивации и разработки метода дезинфекции. Опубликована статья Sharshov et al., 2021в сотрудничестве с МГУ им Ломоносова. Впервые показано, что выделенные в начале пандемии COVID-19 (апрель 2020 г.) в Новосибирске штаммы SARS-CoV-2, отличались от прототипа hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 и принадлежали к двум генетическим линиям B.1 и В.1.1, что указывает на гетерогенность пула циркулировавших в Новосибирске в апреле 2020 г. штаммов SARS-CoV-2. В гене S (кодирует белок S) рассматриваемых новосибирских штаммов SARS-CoV-2, обнаружены 4 нуклеотидные замены. В результате трансляции нуклеотидных последовательностей в аминокислотные показано, что все замены являются несинонимичными. Одна замена является общей для всех 5 новосибирских штаммов и отличает их от прототипа hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019, а остальные встречаются в отдельных штаммах и, следовательно, отличают их от прочих изолятов. Результаты секвенирования позволили провести BLAST-анализ и определить принадлежность изолятов RSV к субтипам А и В (указано в названиях штаммов). Таким образом, субтипирование было осуществлено двумя методами: посредством ПЦР со специфическими праймерами, а также в результате полного и частичного секвенирования геномов выделенных изолятов. Исходя из совпадения полученных результатов, можно заключить, что оптимизированный протокол ПЦР со специфическими субтипирующими праймерами был успешно применен для дифференцированного выявления RSV субтипов А и В. В базе данных GenBank, в результате выполнения работ по проекту размещены полногеномные последовательности 20 (включая данные, полученные на первом этапе) штаммов RSV субтипов А и В. В настоящее время в базе данных GenBank это единственные полногеномные последовательности RSV, выделенных на территории Российской Федерации. Впервые для российских штаммов выявлены вариабельные некодирующие участки геномов как RSV субтипа А (позиции 3078-3080), так и RSV субтипа В (позиции 911-912 и 3140-3141). На втором этапе работы по проекту выполнено секвенирование геномов двух пар изолятов RSV (субтипов А и В). Каждая пара выделена из одного образца биологического материала посредством пассирования на двух культурах клеток (HeLa и Hep2). Показано, что геном RSVA/Novosibirsk/8.62Hl/2020 (изолирован на культуре клеток HeLa) отличается от генома RSVA/Novosibirsk/8.62Hp/2020 (изолирован на культуре клеток Hep2) делецией 72 п.н. 5364-5435 (779-850 в гене, кодирующем белок G) и однонуклеотидной заменой Т11842С (Т3449С в гене, кодирующем белок L). Замена Т11842С является несинонимичной, т.к. приводит к аминокислотной замене I1150T в белке L. В совокупности, помимо представления мировому научному сообществу (депонирование в международную базу данных) на данный момент единственных в РФ последовательностей полных геномов RSV всех двух существующих субтипов (А и В), в результате выполнения второго этапа работы по проекту, были выявлены характеристики разнообразия и изменчивости RSV, циркулирующих в Новосибирске, не обнаруженные ранее (на первом этапе). В частности, увеличение генетического разнообразия циркулирующих вариантов вируса как субтипа А, так и субтипа В. Кроме того, показано, что при пассировании RSV на культурах клеток существует вероятность возникновения делеций в гене, кодирующем белок G. Таким образом, в результате анализа обновлений базы данных GenBank, во множественные выравнивания нуклеотидных последовательностей, сформированных на первом этапе для построения филогенетических дендрограмм, были дополнительно включены 130 новых последовательностей RSV, представленных различными научными коллективами в 2020-2021 гг.. Кроме того, по итогам двух лет работы по проекту, в выравнивания были включены 9 нуклеотидных последовательностей RSV субтипа А и 11 нуклеотидных последовательностей RSV субтипа В, выделенных в Новосибирске. На данный момент это единственный существующий пул последовательностей полных геномов RSV, циркулировавших на территории России. Впервые для российских штаммов показано, что в первичные структуры F-белков 7 из 9 штаммов RSV субтипа А полностью идентичны, а F-белки двух штаммов отличаются от прочих всего одной заменой, расположенной вне антигенных сайтов. В F-белках RSV субтипа В обнаружено 8 замен, 4 из которых расположены в антигенных сайтах, а также, согласно построенной 3D-модели, локализованы на поверхности белка, и следовательно, могут оказывать влияние на антигенные характеристики штаммов. Впервые в результате филогенетического исследования показано, что с 2018 по 2020 гг. в России циркулировали и были эпидемиологически значимыми респираторно-синцитиальные вирусы, принадлежащие к генотипу ON1 субтипа А и BA10 субтипа В. Кроме того, показана гетерогенность пула нуклеотидных последовательностей геномов российских штаммов в пределах генотипов. Таким образом, по итогам двух этапов работы были получены новые данные о генетическом разнообразии RSV на территории России. На данном этапе нельзя сделать вывод о влиянии генотипа вируса на тяжесть течения заболевания из-за ограниченного количества данных, поэтому данный вопрос требует дальнейшего изучения. Впервые в России получены и проанализированы оригинальные полные геномы аденовирусов С. Впервые показано ,что для генотипа С2, можно выделить 2 достоверно отличающихся субклады, в которых лежат наши последовательности: . Для человеческих аденовирусов вида С свойственно меньшее разнообразие последовательностей гена penton, чем для HAdV вида D, однако, недавно описанный генотип AdV-89 обладает отличиями от всех прототипных штаммов в RGD петле пентона, что может говорить об изменениях конформации в RGD сайте, и, как следствие, об отличиях характеристик связывания с рецептором клеток у 89 генотипа. Получен патент РФ на изобретение № 2746280 на штамм RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2018 «Штамм респираторно-синцитиального вируса RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2018 для использования в диагностике респираторно-вирусной инфекции и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro». Помимо опубликованных работ. подготовлены к публикации 2 статьи о генетическом разнообразии ортометапневмовируса и аденовируса человека на территории России. Основные результаты представлены на международных конференциях. В публикациях представлены результаты по эпидемиологии респираторных вирусов и оптимизации методов их исследований in vitro, в том числе на модели SARS-CoV-2. Таким образом, получены все запланированные результаты, соответствующие общему плану выполнения Проекта; они позволят эффективно реализовать последующие этапы в соответствии с планом.

 

Публикации

1. - "Неизвестные герои науки" (проект о лабораторных животных) Пресс-служба РНФ, Раздел посвященный использованию мышиной модели в данном Проекте РНФ (год публикации - ).

2. Курская О.Г., Прокопьева Е.А., Аношина А.В., Леонова Н.В., Симкина О.А., ... Комиссаров А.Б., Столяров К.А.,Фадеев А.В., Соминина А.А., Страховская М.Г., Шестопалов А.М., Шаршов К.А. Low prevalence of human coronavirus among hospitalized children in Novosibirsk city, Russia during pre-pandemic period (2013 — 2020) Journal of the Pediatric Infectious Diseases Society, - (год публикации - 2021).

3. Соломатина М.В., Курская О.Г., Соболев И.А., Дубовицкий Н.А, Кожин П.М., Алексеев А.Ю., Шаршов К.А., Шестопалов А.М. Штамм респираторно-синцитиального вируса RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2018 для использования в диагностике респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro -, - (год публикации - ).

4. Соминина А.А., Даниленко Д.М., Афанасьева О., Столяров К.А., ...Тимонина В.А., Головачева Е., Курская О.Г., Шестопалов А.М., Алимов А.А., Лиознов Д.Н RISK FACTORS FOR HOSPITALIZATION WITH LABORATORY CONFIRMED INFLUENZA AND OTHER RESPIRATORY INFECTIONS IN RUSSIA, SEASON 2018-2019 Journal of Epidemiology and Global Health, - (год публикации - 2021).

5. Шаршов К.А., Соломатина М.В., Курская О.Г, Коваленко И.В., Холина Е., Федоров В., Меерович Г.В., Рубин А., Страховская М.Г. The Photosensitizer Octakis(cholinyl)zinc Phthalocyanine with Ability to Bind to a Model Spike Protein Leads to a Loss of SARS-CoV-2 Infectivity In Vitro When Exposed to Far-Red LED Viruses, 13(4), 643 (год публикации - 2021).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе этого этапа работы пришлось скорректировать по причине распространения вируса SARS-Cov2. Этиологическая структура респираторных вирусов изменилась, изменилось соотношение основных и минорных патогенов (см спец. раздел отчета). В связи с этим в работе сместились некоторые акценты, что, однако, сделало результаты проекта еще более важными и актуальными. Расширился спектр изучаемых респираторных вирусов в проекте. Так, нами впервые в режиме он-лайн отслеживается изменение структуры ОРВИ во время возникновения пандемии нового респираторного вируса. Получены запланированные результаты мониторинга вирусов, создана коллекция образцов и проведена оптимизация вирусологических работ и моделей. У детей в структуре ОРВИ в сезоне 2021 – 2022 гг. преобладал респираторно-синцитиальный вирус, который был выявлен в 197/972 (20,3%) образцах. Вторым по частоте встречаемости был SARS-CoV-2, составив 14,1% (137/972) случаев. Вирус гриппа был выявлен у 10,9% (106/972) пациентов, риновирус – у 10,4% (101/972). Остальные респираторные вирусы выявлялись менее чем в 5% случаев. Следует отметить, что в указанный период метапневмовирус человека не был выявлен ни у одного пациента, в то время как в предыдущем сезоне (2020 – 2021 гг.) метапневмовирус оказался ведущим этиологическим агентом ОРВИ, составив 27,3% (335/1228) от проанализированных образцов. Показано, что доля вируса гриппа увеличивалась с возрастом с наибольшей частотой встречаемости у детей школьного возраста (22,6%), в то время как уровень детекции респираторно-синцитиального вируса значимо уменьшался с возрастом с наименьшим уровнем выявления в возрастной группе 7 – 17 лет (5,7%). Частота выявления риновируса у детей школьного возраста также была значимо ниже, чем у детей младше 7 лет. Кроме того, вирусы парагриппа, сезонные коронавирусы и бокавирус были выявлены только у детей младше 7 лет. В то же время уровень детекции SARS-CoV-2 в разных возрастных группах достоверно не отличался. Мы обнаружили значительный подъем заболеваемости, вызванный новым коронавирусом SARS-CoV-2, в январе (33,8%) и феврале (38,4%) 2022 г., в марте уровень детекции данного вируса уменьшился до 12,6%, а в апреле составил лишь 1,2%. Выделение респираторно-синцитиального вируса из клинических образцов, а также сохранение изолятов при хранении в течение длительного периода времени остается серьезной проблемой. В ходе выполнения работ по проекту нами была оптимизирована клеточная модель культивирования респираторно-синцитиального вируса. Морфологические характеристики цитопатического эффекта были одинаковыми для культур клеток HeLa, HEp-2 и Vero и описывались как крупный синцитий размером до 150 мкм или более с периферийным расположением ядер и оптически яркой зоной в центре образования. Таким образом, мы полагаем, что инфицирование суспензии клеток с последующей обработкой RDE увеличивает вероятность выделения RSV из клинических образцов. На основании полученных результатов была подготовлена и направлена в редакцию журнала Viruses статья «Human Respiratory Syncytial Virus: Isolation, Cultivation and Morfological Characteristics». Впервые проведена работа по визуализации in vitro штаммов аденовируса методом световой и флуоресцентной микроскопии. Проведена дифференциальная сезонных вариантов аденовирусов и коронавирусов человека. В 2021-2022 году было проведено определение вида у коронавирусов с применением набора олигонуклеотидов, предложенных Niu с соавторами в 2016 году, для образцов, положительных по результатам диагностики на сезонные варианты коронавируса человека [Niu [и др.], 2016]. Из 14 образцов вид удалось установить для 13. Из них 69,23% (n=9) были отнесены к виду HKU1, остальные 30,77% (n=4) относились к виду 229E. Далее, проведено определение типа аденовируса человека методом ПЦР в культуральной жидкости. В результате 3 образца были отнесены к аденовирусу типа C (7.473, 7.376, 7.341). Проведен анализ полногеномных последовательностей аденовируса человека. Филогенетический анализ полногеномных последовательностей подтверждает филогенетическую связь полученных вариантов аденовируса с тремя генотипами: 1, 2 и 5. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей белка fiber, hexon, петли 1 и петли 2 нейтрализационных детерминант ε гексона подтверждает принадлежность изолятов к генотипам 1, 2 и 5 и указывает на существенное разнообразие штаммов внутри генотипов. Ранее было показано, что нуклеотидная последовательность пентона HAdVC/Novosibirsk/8.234V/2020 по результатам филогенетического анализа входит в группу, включающую штаммы из Германии, выделенные в отдельный генотип 89 на основании нуклеотидных последовательностей пентона. Ни одна из последовательностей пентона новых полученных штаммов не входит в эту группу. Штаммы, относящиеся к генотипу 5 связаны с разными филогенетическими группами. Последовательность пентона штамма HAdVC/Novosibirsk/7.2Hp/2022 генотипа 5 филогенетически тесно связана с последовательностью штамма human/USA/UFL_Adv5/2008/5P2/H5/F5, которую относят к генотипу 2. По результатам этапа подготовлен проект патента: «Штамм аденовируса HAdVC/Novosibirsk/7.134V/2019 для использования в качестве вектора при создании векторных вакцин, в диагностике аденовирусной инфекции и для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro». Проведено определение генетических групп и субтипов пневмовирусов, циркулирующих в России, с помощью типирующих праймеров. Используя ПЦР с TaqMan-зондами с подобранной концентрацией праймеров и температурным режимом, были типированы 19 проб первичного материала. Все они принадлежали генотипу А. Также были типированы 5 проб, прошедшие этап культивирования. Все они принадлежали генотипу А. Таким образом, в результате оптимизации протокола ПЦР для типирования hRSV в первичном материале были подобраны условия для диагностики штаммов генотипа А. Выполнен BLAST анализ для RSVA, циркулировавшего в течение эпидемического сезона 2020-2021 и выделенного на третьем этапе работы по тематике проекта. По первичной структуре генома штамм схож с вариантами ортопневмовирусов, циркулировавших в течение предыдущего эпидемического сезона (2019-2020 гг.) в Австралии, США, Кот д’Ивуар и Великобритании (Англия). Кроме того, на 99.37 штамм RSVA/Novosibirsk/7.69Hl/2021 схож с выявленным ранее, на втором этапе работы по тематике проекта, выделенным в Новосибирске штаммом RSVA/Novosibirsk/8.62Hp/2020. Все последовательности геномов выявленных в России респираторных вирусов человека опубликованы в базе данных GenBank.Молекулярно-генетический анализ RSV за третий год, как основной результат проекта включен в финальный сравнительный анализ и итоговый отчет Все результаты по проекту опубликованы, либо отправлены в печать. Результаты третьего этапа подтвердили уникальность полученных для России данных по полным геномам ортопневмовирусов, метапневмовирусов, коронавирусов.Кроме того, изучены генотипы, ассоциированные с тяжелым течением заболевания (на основании анализа данных о клиническом течении заболеваний у пациентов, от которых получен материал). Изучены потенциальные антигенные характеристики белка F (белок слияния) орто- и метапневмовирусов, ответственного за проникновение вируса в клетку хозяина, на основании картирования антигенных сайтов, а также получены данные о генетической вариабельности антигенных сайтов выделенных нами штаммов пневмовирусов (Итоговый отчет и приложение). Такие данные позволят сделать вывод о возможной роли данных сайтов как «мишеней» для вакцин против пневмовирусов и специфических лечебных и профилактических препаратов. Полученные штаммы могут быть использованы для создания диагностических тест-систем, а также для выполнения работ по изучению патогенеза вирусных инфекций и тестированию новых лекарственных препаратов с противовирусной активностью на моделях in vitro и in vivo. Таким образом, получены все запланированные результаты, соответствующие общему плану выполнения Проекта; они позволят эффективно реализовать последующие задачи в направлении исследования.

 

Публикации

1. Курская О.Г., Прокопьева Е.А., Би Хонтао, Соболев И.А., Мурашкина Т.А., Шестопалов А.М., Вэй Лисин, Шаршов К.А. Anti-Influenza Activity of Medicinal Material Extracts from Qinghai–Tibet Plateau Viruses, Viruses 2022, 14(2), 360 (год публикации - 2022).

2. Курская О.Г., Сароян Т. А., Дурыманова-Оно Е.А., Слепцова С.С., Суздалова Д.А., Шемякин Е.В., Бурцева Т.Е., Шестопалов А.М., Шаршов К.А. Вклад вирусов в структуру острых респираторных заболеваний у населения г. Якутска в 2019 – 2020 гг. Якутский медицинский журнал, - (год публикации - 2022).

3. Прокопьева Е.А., Курская О.Г., Соломатина М.В., Сароян Т.А., Соболев И.А., Дубовицкий Н.А., Дерко А.А., Кожин П.М., Аликина Т.В., Кабилов М.Р., Шестопалов А.М., Шаршов К.А. Human Respiratory Syncytial Virus: Isolation, Cultivation and Morfological Characteristics Viruses, - (год публикации - 2022).

4. Соломатина М.В., Сароян Т.А., Мурашкина Т.А., Казачкова Е.А., ДурымановаОно Е.А., Курская О.Г , Шаршов К.А., Алексеев А.Ю., Шестопалов А.М. Влияние пандемии нового коронавируса SARS-Cоv-2 на структуру ОРВИ у детей в Западной Сибири Материалы VIII Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием "Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания", Т.1 стр. 196-197 (год публикации - 2021).

5. Соминина А, Даниленко Д., Комиссаров А., Писарева М., Мусаева Т., Бакаев М., ... Курская О., Шестопалов А., Смирнова С., Алимов А., Лиознов Д. Age‑Specific Etiology of Severe Acute Respiratory Infections and Influenza Vaccine Effectivity in Prevention of Hospitalization in Russia, 2018–2019 Season Journal of Epidemiology and Global Health, 2021 Oct 28;1-13. (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
Проведена оценка практического применения полученных результатов. Полученные штаммы могут быть использованы для создания диагностических тест-систем, а также для выполнения работ по изучению патогенеза вирусных инфекций и тестированию новых лекарственных препаратов с противовирусной активностью на моделях in vitro и in vivo. Получен патент РФ на изобретение № 2746280 на штамм RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2018 «Штамм респираторно-синцитиального вируса RSVВ/Novosibirsk/66Hl/2018 для использования в диагностике респираторно-вирусной инфекции и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro». По результатам подготовлен проект патента: «Штамм аденовируса HAdVC/Novosibirsk/7.134V/2019 для использования в качестве вектора при создании векторных вакцин, в диагностике аденовирусной инфекции и для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro» (Авторы: Соломатина М.В., Курская О.Г., Соболев И.А., Дубовицкий Н.А, Кожин П.М., Алексеев А.Ю., Шаршов К.А., Шестопалов А.М.). Патент находится на стадии оформления в патентном отделе.