Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2017 году было впервые показано, что в ходе инфекции бактерий рода Pseudomonas тремя гигантскими phiKZ-подобными фагами (201phi2-1, phiPA3 и phiKZ) во второй половине инфекции образуется внутри клетки белковая сферическая структура, внутри которой упаковывается ДНК (Chaikeeratisak, Nguyen, Khanna, et al.; Chaikeeratisak, Nguyen, MacKennon E. Egan, Erb, Vavilina, et al.). На основании исследований инфекции клеток бактериофагом 201phi2-1 было показано, что внутрь данной сферической структуры перераспределяются также белки, участвующие в репликации, и, по-видимому, одна из РНК-полимераз бактериофага (РНКП) (Chaikeeratisak, Nguyen, Khanna, et al.), то есть формирующийся компартмент структурно и функционально напоминает ядро эукариотической клетки. В англоязычных статьях данную структуру называют «proteinaceous shell», мы используем обозначение «псевдо-ядро». Так как по данным, приведенным в статьях, создается впечатление, что вся ДНК, находящаяся в клетке, попадает внутрь псевдо-ядра, то встаёт вопрос о специфичности упаковки ДНК внутрь данной структуры. Проведя исследования динамики количества ДНК бактерии и ДНК бактериофага в течение инфекции клеток Pseudomonas aeruginosa бактериофагом phiKZ с помощью разделения тотальных препаратов ДНК в агарозном геле и ПЦР в реальном времени, мы показали, что (1) бактериальная ДНК в ходе инфекции не деградирует, и что (2) репликация генома фага phiKZ начинается между 15 и 20 минутами инфекции. Образование псевдо-ядра имеет огромное значение для развития фага, в частности, это предотвращает деградацию ДНК фага системами защиты бактериальных клеток (система рестрикции-модификации, CRISPR-Cas система), нацеленных на двухцепочечную ДНК (Mendoza et al.). Однако, данных о его формировании и составе не много; на текущий момент известен лишь один его структурный компонент – белок Gp54 (Chaikeeratisak, Nguyen, MacKennon E Egan, Erb, Vavilina, et al.). В отчетный период нами были начаты эксперименты по изучению стадий формирования псевдо-ядра в процессе инфекции с помощью метода трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов клеток Pseudomonas aeruginosa, инфицированных бактериофагом phiKZ. На 10 минуте инфекции в клетках появляются светлые шарообразные области с темным центром, которых нет в неинфицированных клетках. На изображениях срезов клеток на 15 минуте хорошо различима достаточно высокая гетерогенность наблюдаемых структур: в некоторых случаях светлые области просто увеличены в размере по сравнению с 10 минутой, а в некоторых случаях структуры напоминали уже зрелое псевдо-ядро, наблюдаемое на 30 минуте, хоть и меньшего размера и с менее развитой внутренней сетью. Это может быть связано как с несколько отличающимся временем протекания инфекции в каждой отдельно взятой клетке, так и с плоскостью среза, проходящего через разные участки клеток таким образом, что часть псевдо-ядра может оказаться скрыта. В зрелом псевдо-ядре, хорошо заметном на 30 минуте инфекции, наблюдается очень насыщенная внутренняя сеть филаментов, вероятно, представляющих собой нити ДНК в комплексе с различными белками. Более слабая насыщенность сети на изображениях от 15 минуты инфекции может быть связана с тем, что, судя по нашим данным, активная репликация фаговой ДНК происходит только после 15 минуты инфекции. Скорее всего, до начала репликации ДНК происходит формирование основных структур псевдо-ядра (его оболочки). Следующий интересующий нас вопрос был посвящен связи транскрипции фаговых генов и формирования псевдо-ядра. Транскрипция генов бактериофага phiKZ и близкородственных ему фагов осуществляется двумя фаговыми неканоническими мультисубъединичными ДНК-зависимыми РНК-полимеразами (РНКП): (1) вирионной РНКП (вРНКП), поступающей из фаговой частицы вместе с ДНК фага и транскрибирующей ранние гены, и (2) невирионной РНКП (нвРНКП), синтезирующейся в ходе инфекции и транскрибирующей поздние гены (P.-J. Ceyssens et al.; Yakunina et al.). Ранее для двух субъединиц нвРНКП близкородственного фага 201phi2-1 (гомологи субъединиц нвРНКП фага phiKZ Gp55 и Gp74) было показано, что данные субъединицы, слитые с флуоресцентным белком, оказываются внутри псевдо-ядра (Chaikeeratisak, Nguyen, Khanna, et al.). Для исследования перераспределения обеих полимераз фага phiKZ относительно псевдо-ядра было использовано два основных метода: (1) Иммуно-электронная микроскопия с использованием антител, конъюгированных с частицами коллоидного золота, которая позволяет установить локализацию целевого антигена относительно внутренних структур клетки. В качестве первичных антител нами были использованы очищенные антитела к целевым белкам - субъединицам обеих фаговых РНКП из ранее полученных сывороток крови крыс, в качестве вторичных антител были взяты козьи антитела против иммуноглобулинов крысы, конъюгированные с частицами коллоидного золота размером 10 нм. Специфические антитела были получены против субъединиц обеих фаговых РНКП, несущих абсолютно необходимый для катализа Mg-связывающий мотив: Gp180 для вРНКП и Gp55 для нвРНКП. (2) Флуоресцентная микроскопия живых клеток, экспрессирующих слитые с флуоресцентным белком аминокислотные последовательности субъединиц Gp180 для вРНКП или Gp55 для нвРНКП. В качестве контролей использовались клетки, экспрессирующие только флуоресцентные белки. Как экспериментальные, так и контрольные клетки были инфицированы бактериофагом phiKZ. По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что нвРНКП фага phiKZ, как и родственный фермент из фага 201phi2-1, локализуется во второй половине инфекции в основном внутри псевдо-ядра. Это согласуется с тем, что нвРНКП транскрибирует поздние гены и должна находится внутри псевдо-ядра для связывания с ДНК фага. Про вторую РНКП, вРНКП, ранее не было получено никаких данных. По результатам обоих подходов вРНКП во второй половине инфекции остается снаружи псевдо-ядра. Pанее с помощью RNA-seq было показано, что в ходе инфекции происходит затухание транскрипции ранних генов фага phiKZ (Pieter-Jan Ceyssens et al.), а количество вРНКП, наоборот, увеличивается после 15 минуты инфекции и достигает нескольких тысяч молекул в клетке к концу инфекции. Вероятно, пространственное разделение вРНКП и ДНК фага – это новый механизм регуляции транскрипции в ходе инфекции.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В год коронавируса и ношения защитных масок в лаборатории мы продолжили изучать развитие инфекции фагом phiKZ. Фаг phiKZ обладает гигантским геномом в 280 тыс.п.о., который кодирует белки, создающие внутри клетки во время инфекции удивительные структуры. Было показано, что во второй половине инфекции в клетке формируется ядерно-подобная структура, которую мы будем называть псевдо-ядро, и цитоскелет на основе фагового тубулин-подобного белка. В прошлом году мы показали, что бактериальная ДНК не подвергается деградации в ходе инфекции клеток фагом, что было для нас неожиданностью, так как фаги довольно часто используют бактериальную ДНК как источник нуклеотидов для репликации своего генома. Что же тогда происходит с бактериальной ДНК? А также, что происходит с фаговой ДНК до формирования псевдо-ядра, появление которого по нашим данным совпадает с временем начала репликации фага? Для ответа на эти вопросы мы проследили изменения, происходящие внутри инфицированной phiKZ клетки P. aeruginosa с использованием электронной и иммуно-электронной микроскопии. В неинфицированной клетке был обнаружен распределенный внутри клетки нуклейод бактерии. В клетке, к которой прикрепилась фаговая частица и начала впрыск содержимого головки вириона, сразу же происходит образование круговой структуры (RC), которая, судя по всему, содержит материал фага и обеспечивает его обособленность от остальных компонентов цитоплазмы клетки-хозяина. RC может быть несколько, по-видимому отражая количество фагов, инфицировавших клетку. В клетке, остановленной на 5 минуте после инфекции видно смещение нуклеойда к противоположному полюсу клетки относительно сформированого RC. На 10 минуте смещение нуклеойда продолжается, а к 15 минуте нуклеойд занимает подмембранное положение. Такое изменение положения бактериальной ДНК было подтверждено результатами анализа фиксированных клеток на разных минутах инфекции методом FISH с использованием зондов к бактериальной ДНК. Внутри RC располагается фаговая ДНК, что подтверждается экспериментами по флуоресцентной микроскопии живых клеток с неспецифической окраской ДНК красителем DAPI и методом FISH с зондами к фаговой ДНК – на полученных изображениях видны светящиеся точки, появляющиеся на полюсах сразу после инфекции. Ранее было показано, что инфекция клеток P.aeruginosa фагом phiKZ устойчива к действию защитных систем бактерии, расщепляющих двуцепочечную ДНК. Можно предположить, что именно RC защищает ДНК фага от защитных систем хозяина на ранних минутах инфекции. Формирование структур, подобных RC, насколько нам известно, не было описано до нас и механизм их формирования остается пока тайной. Мы можем утверждать, что данные RC точно не состоят из белка Gp54, определенного ранее как основной белок оболочки псевдо-ядра. Данный белок начинает нарабатываться только после попадания фагового материала в клетку, постепенно накапливаясь, что было показано нами в этом году с помощью иммуноблотинга. Кроме того, его отсутствие в составе оболочки RC было подтверждено результатами иммуно-электронной микроскопии с использованием антител к белку Gp54. Само псевдо-ядро становится заметно ориентировочно к 15-20 минуте инфекции. К 30-40 минуте мы наблюдаем зрелое псевдо-ядро со сложной внутренней сетью из ДНК и белков, отражающей структуры, созданные компактизованной фаговой ДНК. Иногда можно наблюдать не одно, а сразу два «псевдо-ядра»: обычно такое явление связано с подготовкой клетки к делению. Клетка при этом может находиться как в процессе элонгации при подготовке к цитокинезу, так и на ранних стадиях формирования септы. При этом как бы по одному «псевдо-ядру» приходится на каждую будущую дочернюю клетку. Сам процесс деления при этом останавливается ровно на той стадии, в момент которой произошло заражение. По-видимому, существуют механизмы блокирования деления бактериальной клетки при её заражении вирусным материалом. Gp54 на 30 минуте инфекции локализован по периферии зрелых «псевдо-ядер», что подтверждает его роль как основного компонента белковой оболочки этих структур. Также в некоторых случаях внутри клетки на 30 минуте инфекции кроме сформировавшегося «псевдо-ядра», присутствует и некоторое количество RC. Опираясь на результаты полученные с помощью опытов по флуоресцентной микроскопии клеток, окрашенных DAPI (неспецифический краситель ДНК), формирование «псевдо-ядра» происходит только из одного кругового компартмента, содержащего фаговый материал. Вероятно, развитие остальных круговых компартментов по какой-то причине остаётся подавленным в течение всего времени инфекции. Подробнее об изменениях морфологии инфицированных бактериофагом phiKZ клеток P. aeruginosa можно узнать из опубликованной статьи: Danilova, Y.A.; Belousova, V.V.; Moiseenko, A.V.; Vishnyakov, I.E.; Yakunina, M.V.; Sokolova, O.S. Maturation of Pseudo-Nucleus Compartment in P. aeruginosa, Infected with Giant phiKZ Phage. Viruses 2020, 12, 1197. https://doi.org/10.3390/v12101197

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В этом году мы продолжили исследование развития инфекции бактериальной клетки бактериофагом phiKZ. Если в прошлом году с помощью электронной микроскопии мы определили основные стадии развития инфекции, то в этом году мы узнали чуть больше информации о некоторых из них. 1. Мы показали, что круговые компартменты (RC), появляющиеся на первой минуте инфекции формируются не только при инфекции клеток бактериофагом phiKZ, но и при инфекции клеток бактериофагом AR9. Бактериофаг AR9 – это тоже гигантский бактериофаг, кодирующий две собственные фаговые РНК-полимеразы, родственные phiKZ. Так как у бактериофага AR9 ранее никогда не было показано наличие внутреннего тела (IB) внутри фаговой головки, то, вероятно, образование RC не связано с наличие IB. 2. Мы выявили 2 фаговых белка (Gp219 и Gp124), которые, вероятно, взаимодействуют с фаговой ДНК в период времени, когда она покидает RC, и до формирования зрелого псевдо-ядра. И если функции Gp219, по-видимому, на этом заканчиваются, то Gp124 во второй половине инфекции располагается на периферии зрелого псевдо-ядра. 3. Также мы получили новые данные о сборке IB, сложной белковой структуры внутри фаговой головки, на которую ДНК наматывается как на веретено. Мы показали, что включение IB внутрь собирающейся фаговой головки происходит либо непосредственно перед упаковкой в нее ДНК, либо сопряжено с этим.