КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-74-10030

НазваниеИзучение инфекции клеток патогенных бактерий гигантскими бактериофагом phiKZ

РуководительЯкунина Мария Вячеславовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого", г Санкт-Петербург

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2022 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словаФаговая инфекция, гигантские бактериофаги, phiKZ, Pseudomonas aeruginosa, тубулино-подобные белки, регуляция транскрипции, ДНК-зависимая РНК-полимераза.

Код ГРНТИ34.15.31


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Открытие и широкое применение антибиотиков позволило вести чрезвычайно успешную борьбу со множеством заболеваний, вызываемых патогенными бактериями. Однако масштабное применение антибиотиков в медицине и сельском хозяйстве привело к появлению и быстрому распространению штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам. Проблема осложняется тем, что 1) распространение антибиотикоустойчивых штаммов происходит быстрее, чем разработка новых антибиотиков; 2) появляются многочисленные штаммы, устойчивые сразу к нескольким антибиотикам (мультирезистентные штаммы); 3) антибиотики, применяемые для борьбы с рядом бактерий, высоко токсичны для человека. Природные враги бактерий, литические бактериофаги, в ходе эволюции выработали множество молекулярных механизмов, позволяющих им успешно и быстро инфицировать бактерии, развиваться в них, подавляя или модифицируя важные клеточные процессы, и, в конечном итоге, уничтожать зараженные бактерии. Благодаря этим свойствам бактериофаги рассматриваются, как перспективная основа для разработки новых препаратов для борьбы с антибиотикоустойчивыми штаммами. В последнее время исследователи также начали уделять внимание фаговым белкам, атакующим клетку снаружи (например, лизинам, ферментам разрушающих бактериальные стенки). На фоне все возрастающего интереса к использованию бактериофагов в практической медицине, путем подбора смесей бактериофагов (фаговых коктейлей) для борьбы с патогенными бактериями, начинает остро ощущаться недостаток фундаментальных данных о процессах, происходящих внутри бактериальной клетки, при инфекции ее фагами. Целью данного проекта является комплексное изучение инфекции бактериальных клеток представителями phiKZ-родственных гигантских бактериофагов, часто используемых в работах по созданию новых антимикробных фаговых препаратов. PhiKZ-родственные фаги инфицируют широкий спектр бактерий, в том числе и клинически важные патогены родов Pseudomonas, Yersinia и Salmonella, для которых характерна устойчивость к антибиотикам [1–3]. В связи с этим phiKZ и родственные ему фаги рассматриваются как компоненты фаговых коктейлей для лечения инфекций, вызванных этими бактериями [4–8]. Для разработки более эффективных и безопасных антибактериальных средств на основе этих фагов и кодируемых ими белков необходимо исследовать развитие фаговой инфекции внутри бактериальных патогенов. Данная группа фагов обладает существенными отличиями от ранее изученных бактериофагов: (1) для транскрипции геномов большинства фагов этой группы не требуется ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) клетки-хозяина [1]; (2) в геномах этих фагов, по-видимому, закодированы две собственные РНКП, относящиеся к классу многосубъединичных, которые ранее у фагов не были обнаружены [1,3,9–11]; (3) в ходе инфекции клеток фагами внутри клетки формируются структуры подобные тубулиновым микротрубочкам и ядру эукариотических клеток [12,13]. Комплексное изучение развития инфекции бактерий представителями этой группы бактериофагов не только имеет значение для разработки новых антибактериальных средств на их основе, но также оправдано потому, что за счет очень крупных геномов эти фаги кодируют большое количество белков с неизвестными функциями, многие из которых могут оказаться цитотоксическими.

Ожидаемые результаты
PhiKZ и родственные ему фаги рассматриваются как компоненты фаговых коктейлей для лечения бактериальных инфекций [4–8], а также как перспективный источник фаговых белков-ингибиторов, специфически влияющих на бактерий-хозяев [14,15]. Полученные по результатам проекта данные о процессах происходящих внутри клетки P. aeruginosa в ходе инфекции ее бактериофагом phiKZ позволят разработать и рационально применять новые антимикробные препараты. Также, сведения, полученные в ходе работы над проектом, будут иметь существенную значимость для фундаментальной науки. В рамках проекта будет изучено формирование ядерно-подобной структуры (псевдо-ядра) внутри клетки в ходе инфекции клеток фагом phiKZ. Детальное исследование формирования данной структуры может оказаться ключом к пониманию эволюции жизни на земле, а именно образования эукариотических клеток. В ходе работы над проектом будут идентифицированы все фаговые белки, входящие в состав псевдо-ядра и будет изучена взаимосвязь процесса его формирования с регуляцией транскрипции фагового генома в ходе инфекции. Для этого будет определена локализация внутри клеток обеих фаговых РНКП, вирионной (вРНКП) и невирионной (нвРНКП), а также бактериальной РНКП, на разных стадиях инфекции. Данные о распределение полимераз помогут начать изучения механизма отбора белков внутрь псевдо-ядра в ходе инфекции.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2017 году было впервые показано, что в ходе инфекции бактерий рода Pseudomonas тремя гигантскими phiKZ-подобными фагами (201phi2-1, phiPA3 и phiKZ) во второй половине инфекции образуется внутри клетки белковая сферическая структура, внутри которой упаковывается ДНК (Chaikeeratisak, Nguyen, Khanna, et al.; Chaikeeratisak, Nguyen, MacKennon E. Egan, Erb, Vavilina, et al.). На основании исследований инфекции клеток бактериофагом 201phi2-1 было показано, что внутрь данной сферической структуры перераспределяются также белки, участвующие в репликации, и, по-видимому, одна из РНК-полимераз бактериофага (РНКП) (Chaikeeratisak, Nguyen, Khanna, et al.), то есть формирующийся компартмент структурно и функционально напоминает ядро эукариотической клетки. В англоязычных статьях данную структуру называют «proteinaceous shell», мы используем обозначение «псевдо-ядро». Так как по данным, приведенным в статьях, создается впечатление, что вся ДНК, находящаяся в клетке, попадает внутрь псевдо-ядра, то встаёт вопрос о специфичности упаковки ДНК внутрь данной структуры. Проведя исследования динамики количества ДНК бактерии и ДНК бактериофага в течение инфекции клеток Pseudomonas aeruginosa бактериофагом phiKZ с помощью разделения тотальных препаратов ДНК в агарозном геле и ПЦР в реальном времени, мы показали, что (1) бактериальная ДНК в ходе инфекции не деградирует, и что (2) репликация генома фага phiKZ начинается между 15 и 20 минутами инфекции. Образование псевдо-ядра имеет огромное значение для развития фага, в частности, это предотвращает деградацию ДНК фага системами защиты бактериальных клеток (система рестрикции-модификации, CRISPR-Cas система), нацеленных на двухцепочечную ДНК (Mendoza et al.). Однако, данных о его формировании и составе не много; на текущий момент известен лишь один его структурный компонент – белок Gp54 (Chaikeeratisak, Nguyen, MacKennon E Egan, Erb, Vavilina, et al.). В отчетный период нами были начаты эксперименты по изучению стадий формирования псевдо-ядра в процессе инфекции с помощью метода трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов клеток Pseudomonas aeruginosa, инфицированных бактериофагом phiKZ. На 10 минуте инфекции в клетках появляются светлые шарообразные области с темным центром, которых нет в неинфицированных клетках. На изображениях срезов клеток на 15 минуте хорошо различима достаточно высокая гетерогенность наблюдаемых структур: в некоторых случаях светлые области просто увеличены в размере по сравнению с 10 минутой, а в некоторых случаях структуры напоминали уже зрелое псевдо-ядро, наблюдаемое на 30 минуте, хоть и меньшего размера и с менее развитой внутренней сетью. Это может быть связано как с несколько отличающимся временем протекания инфекции в каждой отдельно взятой клетке, так и с плоскостью среза, проходящего через разные участки клеток таким образом, что часть псевдо-ядра может оказаться скрыта. В зрелом псевдо-ядре, хорошо заметном на 30 минуте инфекции, наблюдается очень насыщенная внутренняя сеть филаментов, вероятно, представляющих собой нити ДНК в комплексе с различными белками. Более слабая насыщенность сети на изображениях от 15 минуты инфекции может быть связана с тем, что, судя по нашим данным, активная репликация фаговой ДНК происходит только после 15 минуты инфекции. Скорее всего, до начала репликации ДНК происходит формирование основных структур псевдо-ядра (его оболочки). Следующий интересующий нас вопрос был посвящен связи транскрипции фаговых генов и формирования псевдо-ядра. Транскрипция генов бактериофага phiKZ и близкородственных ему фагов осуществляется двумя фаговыми неканоническими мультисубъединичными ДНК-зависимыми РНК-полимеразами (РНКП): (1) вирионной РНКП (вРНКП), поступающей из фаговой частицы вместе с ДНК фага и транскрибирующей ранние гены, и (2) невирионной РНКП (нвРНКП), синтезирующейся в ходе инфекции и транскрибирующей поздние гены (P.-J. Ceyssens et al.; Yakunina et al.). Ранее для двух субъединиц нвРНКП близкородственного фага 201phi2-1 (гомологи субъединиц нвРНКП фага phiKZ Gp55 и Gp74) было показано, что данные субъединицы, слитые с флуоресцентным белком, оказываются внутри псевдо-ядра (Chaikeeratisak, Nguyen, Khanna, et al.). Для исследования перераспределения обеих полимераз фага phiKZ относительно псевдо-ядра было использовано два основных метода: (1) Иммуно-электронная микроскопия с использованием антител, конъюгированных с частицами коллоидного золота, которая позволяет установить локализацию целевого антигена относительно внутренних структур клетки. В качестве первичных антител нами были использованы очищенные антитела к целевым белкам - субъединицам обеих фаговых РНКП из ранее полученных сывороток крови крыс, в качестве вторичных антител были взяты козьи антитела против иммуноглобулинов крысы, конъюгированные с частицами коллоидного золота размером 10 нм. Специфические антитела были получены против субъединиц обеих фаговых РНКП, несущих абсолютно необходимый для катализа Mg-связывающий мотив: Gp180 для вРНКП и Gp55 для нвРНКП. (2) Флуоресцентная микроскопия живых клеток, экспрессирующих слитые с флуоресцентным белком аминокислотные последовательности субъединиц Gp180 для вРНКП или Gp55 для нвРНКП. В качестве контролей использовались клетки, экспрессирующие только флуоресцентные белки. Как экспериментальные, так и контрольные клетки были инфицированы бактериофагом phiKZ. По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что нвРНКП фага phiKZ, как и родственный фермент из фага 201phi2-1, локализуется во второй половине инфекции в основном внутри псевдо-ядра. Это согласуется с тем, что нвРНКП транскрибирует поздние гены и должна находится внутри псевдо-ядра для связывания с ДНК фага. Про вторую РНКП, вРНКП, ранее не было получено никаких данных. По результатам обоих подходов вРНКП во второй половине инфекции остается снаружи псевдо-ядра. Pанее с помощью RNA-seq было показано, что в ходе инфекции происходит затухание транскрипции ранних генов фага phiKZ (Pieter-Jan Ceyssens et al.), а количество вРНКП, наоборот, увеличивается после 15 минуты инфекции и достигает нескольких тысяч молекул в клетке к концу инфекции. Вероятно, пространственное разделение вРНКП и ДНК фага – это новый механизм регуляции транскрипции в ходе инфекции.

 

Публикации

1. Белоусова В.В, Курдюмова И.В, Якунина М.В. Состояние бактериальной ДНК в ходе инфекции клеток бактериофагом phiKZ XXI Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии.Тезисы докладов Молодежной конференции. Том 2, с.24-25 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В год коронавируса и ношения защитных масок в лаборатории мы продолжили изучать развитие инфекции фагом phiKZ. Фаг phiKZ обладает гигантским геномом в 280 тыс.п.о., который кодирует белки, создающие внутри клетки во время инфекции удивительные структуры. Было показано, что во второй половине инфекции в клетке формируется ядерно-подобная структура, которую мы будем называть псевдо-ядро, и цитоскелет на основе фагового тубулин-подобного белка. В прошлом году мы показали, что бактериальная ДНК не подвергается деградации в ходе инфекции клеток фагом, что было для нас неожиданностью, так как фаги довольно часто используют бактериальную ДНК как источник нуклеотидов для репликации своего генома. Что же тогда происходит с бактериальной ДНК? А также, что происходит с фаговой ДНК до формирования псевдо-ядра, появление которого по нашим данным совпадает с временем начала репликации фага? Для ответа на эти вопросы мы проследили изменения, происходящие внутри инфицированной phiKZ клетки P. aeruginosa с использованием электронной и иммуно-электронной микроскопии. В неинфицированной клетке был обнаружен распределенный внутри клетки нуклейод бактерии. В клетке, к которой прикрепилась фаговая частица и начала впрыск содержимого головки вириона, сразу же происходит образование круговой структуры (RC), которая, судя по всему, содержит материал фага и обеспечивает его обособленность от остальных компонентов цитоплазмы клетки-хозяина. RC может быть несколько, по-видимому отражая количество фагов, инфицировавших клетку. В клетке, остановленной на 5 минуте после инфекции видно смещение нуклеойда к противоположному полюсу клетки относительно сформированого RC. На 10 минуте смещение нуклеойда продолжается, а к 15 минуте нуклеойд занимает подмембранное положение. Такое изменение положения бактериальной ДНК было подтверждено результатами анализа фиксированных клеток на разных минутах инфекции методом FISH с использованием зондов к бактериальной ДНК. Внутри RC располагается фаговая ДНК, что подтверждается экспериментами по флуоресцентной микроскопии живых клеток с неспецифической окраской ДНК красителем DAPI и методом FISH с зондами к фаговой ДНК – на полученных изображениях видны светящиеся точки, появляющиеся на полюсах сразу после инфекции. Ранее было показано, что инфекция клеток P.aeruginosa фагом phiKZ устойчива к действию защитных систем бактерии, расщепляющих двуцепочечную ДНК. Можно предположить, что именно RC защищает ДНК фага от защитных систем хозяина на ранних минутах инфекции. Формирование структур, подобных RC, насколько нам известно, не было описано до нас и механизм их формирования остается пока тайной. Мы можем утверждать, что данные RC точно не состоят из белка Gp54, определенного ранее как основной белок оболочки псевдо-ядра. Данный белок начинает нарабатываться только после попадания фагового материала в клетку, постепенно накапливаясь, что было показано нами в этом году с помощью иммуноблотинга. Кроме того, его отсутствие в составе оболочки RC было подтверждено результатами иммуно-электронной микроскопии с использованием антител к белку Gp54. Само псевдо-ядро становится заметно ориентировочно к 15-20 минуте инфекции. К 30-40 минуте мы наблюдаем зрелое псевдо-ядро со сложной внутренней сетью из ДНК и белков, отражающей структуры, созданные компактизованной фаговой ДНК. Иногда можно наблюдать не одно, а сразу два «псевдо-ядра»: обычно такое явление связано с подготовкой клетки к делению. Клетка при этом может находиться как в процессе элонгации при подготовке к цитокинезу, так и на ранних стадиях формирования септы. При этом как бы по одному «псевдо-ядру» приходится на каждую будущую дочернюю клетку. Сам процесс деления при этом останавливается ровно на той стадии, в момент которой произошло заражение. По-видимому, существуют механизмы блокирования деления бактериальной клетки при её заражении вирусным материалом. Gp54 на 30 минуте инфекции локализован по периферии зрелых «псевдо-ядер», что подтверждает его роль как основного компонента белковой оболочки этих структур. Также в некоторых случаях внутри клетки на 30 минуте инфекции кроме сформировавшегося «псевдо-ядра», присутствует и некоторое количество RC. Опираясь на результаты полученные с помощью опытов по флуоресцентной микроскопии клеток, окрашенных DAPI (неспецифический краситель ДНК), формирование «псевдо-ядра» происходит только из одного кругового компартмента, содержащего фаговый материал. Вероятно, развитие остальных круговых компартментов по какой-то причине остаётся подавленным в течение всего времени инфекции. Подробнее об изменениях морфологии инфицированных бактериофагом phiKZ клеток P. aeruginosa можно узнать из опубликованной статьи: Danilova, Y.A.; Belousova, V.V.; Moiseenko, A.V.; Vishnyakov, I.E.; Yakunina, M.V.; Sokolova, O.S. Maturation of Pseudo-Nucleus Compartment in P. aeruginosa, Infected with Giant phiKZ Phage. Viruses 2020, 12, 1197. https://doi.org/10.3390/v12101197

 

Публикации

1. - Российские ученые нашли свидетельства вирусного происхождения клеточных ядер Газета.ру, - (год публикации - ).

2. - Ученые: возможно, ядра клеток человека произошли от вирусов Поиск, - (год публикации - ).

3. - Бактериофаг свидетельствует в пользу вирусной теории происхождения клеточного ядра Полит.ру, - (год публикации - ).

4. Антонова Д.А., Якунина М.В. Использование флуоресцентной микроскопии в исследовании заражения клеток бактериофагом phiKZ МАКС Пресс, - (год публикации - 2021).

5. Данилова Я., Якунина М., Моисеенко А., Белоусова В., Вишняков И., Соколова О. Electron Tomography Revealed Compact DNA in the Nucleus-like Compartment, Formed in the Bacterial Cell During Infection by the phiKZ Bacteriophage Microscopy and Microanalysis, - (год публикации - 2020).

6. Данилова Я.А., Белоусова В.В., Моисеенко А.В., Вишняков И.Е., Якунина М.В., Соколова О.С. Maturation of Pseudo-Nucleus Compartment in P. aeruginosa, Infected with Giant phiKZ Phage Viruses, 12(10), 1197 (год публикации - 2020).

7. Орехова М.М., Белоусова В.В., Морозова Н.Е., Вишняков И.Е., Якунина М.В. Регуляция ранней Транскрипции у гигантского бактериофага phiKZ Гены и Клетки, XV, №3, Приложение, стр 195 (год публикации - 2020).