Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На сегодняшний день основу анти-ВИЧ терапии составляют ингибиторы вирусных ферментов: обратной транскриптазы, осуществляющей синтез ДНК копии генома вируса (кДНК) на РНК-матрице, интегразы, осуществляющей встраивание вирусной кДНК в геном клетки-хозяина, а также протеазы, нарезающей синтезируемые вирусные полипротеины на функциональные белки. Реже используют ингибиторы слияния и проникновения, которые блокируют взаимодействие вирусных гликопротеинов с рецепторами на поверхности инфицируемой клетки и дальнейшее проникновение вируса в клетку. Комбинированная терапия, предполагающая одновременный прием нескольких ингибиторов, позволяет эффективно контролировать течение ВИЧ-инфекции у пациентов. К сожалению, длительное применение одной схемы или несоблюдение схемы приводит к появлению штаммов вирусов, устойчивых к действию терапии. Сегодня устойчивые штаммы встречаются даже у пациентов, никогда не принимавших специфичной антиретровирусной терапии. В этой связи, крайне остро стоит проблема разработки новых подходов к ингибированию ВИЧ-1, способных свести к минимуму появление резистентных штаммов. Понятно, однако, что решение этой проблемы невозможно без детального понимания механизмов всех стадий репликации этого вируса и выявления новых мишеней для антиретровирусной терапии. Проект направлен на изучение механизма постинтеграционной репарации повреждений ДНК, возникающих в ходе интеграции генетического материала ВИЧ-1 в геном клеток человека. К этим повреждениям относятся 5-ти нуклеотидные одноцепочечные участки, фланкирующие интегрированную вирусную ДНК, и неспаренные динуклеотиды на ее 5’-концах. Восстановление целостности генома является необходимым условием эффективного завершения ранних этапов репликации ВИЧ-1. Считается, что эта важнейшая стадия жизненного цикла вируса осуществляется клеточными системами репарации, однако ее точный механизм и набор участников, вовлеченных в этот процесс, до сих пор остаются малоизученными, а существующие данные в значительной степени противоречивы. Понимание детального механизма постинтеграционной репарации ВИЧ-1 будет способствовать созданию новых анти-ВИЧ препаратов со сниженным риском развития резистентности. Ранее нам удалось продемонстрировать, что процесс постинтеграционно репарации ВИЧ-1 зависит от способности интегразы ВИЧ-1 (ИН) взаимодействовать с клеточным белком Ku70 – компонентом комплекса ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK). DNA-PK является ключевым участником клеточного процесса репарации двуцепочечных разрывов ДНК по пути негомологичного объединения концов (non-homologous end joining, NHEJ). Несмотря на отсутствие двуцепочечных разрывов в ходе интеграции ДНК ВИЧ-1, этот комплекс играет ключевую роль в процессе постинтеграционной репарации ДНК, что было показано в нашей лаборатории. Привлечение DNA-PK комплекса к месту интеграции вирусного генома приводит к ее активации и запуску репарационных путей. В настоящем проекте проводится первый систематический поиск факторов, вовлеченных в процесс постинтеграционной репарации ДНК ВИЧ-1. За отчетный период получен набор генетических конструкций для продукции однораундных псевдовирусов на базе генома ВИЧ-1, содержащих мутантные формы интегразы, мутации в которой нарушают один из ранних этапов репликативного цикла ВИЧ-1. С использованием этих генетических конструкций получены и охарактеризованы псевдовирусы. Псевдовирус ВИЧ-1_wt, содержащий природный вариант интегразы, проходит все ранние этапы репликативного цикла ВИЧ-1: обратная транскрипция, интеграция и постинтеграционная репарация ДНК. Псевдовирус ВИЧ-1_E212A/L213A, содержащий мутантную форму ИН с аминокислотными заменами E212A/L213A, демонстрирует нарушения в постинтеграционной репарации ДНК, т.к. такая форма ИН не взаимодействует in vitro и in vivo с клеточным белком Ku70. В случае псевдовируса ВИЧ-1_E152A нарушена интеграция вирусной ДНК, а в случае ВИЧ-1_H16C содержимое вириона проникает в цитоплазму, но ни обратная транскрипция, ни интеграция не происходят, т.к. замена H16C в составе ИН нарушает функционирование обратной транскриптазы ВИЧ-1. Эти псевдовирусы будут использованы на втором этапе проекта для количественной оценки изменений клеточного фосфопротеома в ходе постинтеграционной репарации. Определена кинетика активации комплекса DNA-PK при трансдукции клеток псевдовирусом ВИЧ-1_wt. В ходе эксперимента «время добавления ингибитора» («time of drug addition») установлено, что активация DNA-PK комплекса, участвующего в репликации ВИЧ-1 на стадии постинтеграционной репарации ДНК, происходит синхронно с интеграцией вирусного генома. На основании ранее полученных в нашей лаборатории данным по накоплению репарированных провирусов мы делаем вывод, что активация DNA-PK является лишь начальным этапом постинтеграционной репарации ДНК. DNA-PKcs – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы относится к семейству PIKK киназ. Две другие репарационные киназы: ATM и ATR, - также принадлежат этому семейству. Хотя специфичность этих киназ сильно отличается, например, ATM и DNA-PKcs активируются в ответ на двуцепочечные разрывы ДНК, но к месту повреждения привлекаются разными белковыми комплексами, а ATR – при остановке репликативной вилки, все больше сообщений указывают на их взаимосвязь и совместную регуляцию в процессах репарации ДНК. Мы обнаружили, что фосфорилирующая активность ATM, но не ATR необходима для успешной постинтеграционной репарации ВИЧ-1. Активация ATM происходит синхронно с интеграцией так же, как в случае с DNA-PK, и зависит от взаимодействия между интегразой ВИЧ-1 и клеточным белком Ku70. Более того нам удалось показать, что DNA-PKcs и ATM регулируют постинтеграционную репарацию ДНК за счет последовательной активации. Мы также протестировали участие в постинтеграционной репарации ВИЧ-1 другого важного мастер-регулятора клеточных репарационных путей белка PARP-1, участие которого в репликации ВИЧ-1 ранее предполагалось в ряде работ. К сожалению, поли-АДФ-рибозилирующая активность PARP-1 неважна для постинтеграционной репарации ВИЧ-1. При выполнении последнего пункта этапа, предполагающего оптимизацию методики выделения набора белков, которые фосфорилируются DNA-PKcs в ответ на ретровирусную интеграцию, мы охарактеризовали кинетику накопления фосфорилированной формы гистона H2AX (γH2AX), образование которой ассоциировано с активацией киназ, участвующих в репарации ДНК. γH2AX накапливался специфично через 10 и 12 часов после добавления к клеткам псевдовирусов. Нам также удалось показать, что накопление γH2AX связано с фосфорилирующей активностью ATM и DNA-PKcs.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На сегодняшний день основу анти-ВИЧ терапии составляют ингибиторы вирусных ферментов: обратной транскриптазы, осуществляющей синтез ДНК копии генома вируса (кДНК) на РНК-матрице, интегразы, осуществляющей встраивание вирусной кДНК в геном клетки-хозяина, а также протеазы, нарезающей синтезируемые вирусные полипротеины на функциональные белки. Реже используют ингибиторы слияния и проникновения, которые блокируют взаимодействие вирусных гликопротеинов с рецепторами на поверхности инфицируемой клетки и дальнейшее проникновение вируса в клетку. Комбинированная терапия, предполагающая одновременный прием нескольких ингибиторов, позволяет эффективно контролировать течение ВИЧ-инфекции у пациентов. К сожалению, длительное применение одной схемы или несоблюдение схемы приводит к появлению штаммов вирусов, устойчивых к действию терапии. Сегодня устойчивые штаммы встречаются даже у пациентов, никогда не принимавших специфичной антиретровирусной терапии. В этой связи, крайне остро стоит проблема разработки новых подходов к ингибированию ВИЧ-1, способных свести к минимуму появление резистентных штаммов. Понятно, однако, что решение этой проблемы невозможно без детального понимания механизмов всех стадий репликации этого вируса и выявления новых мишеней для антиретровирусной терапии. Проект направлен на изучение механизма постинтеграционной репарации повреждений ДНК, возникающих в ходе интеграции генетического материала ВИЧ-1 в геном клеток человека. К этим повреждениям относятся 5-ти нуклеотидные одноцепочечные участки, фланкирующие интегрированную вирусную ДНК, и неспаренные динуклеотиды на ее 5’-концах. Восстановление целостности генома является необходимым условием эффективного завершения ранних этапов репликации ВИЧ-1. Считается, что эта важнейшая стадия жизненного цикла вируса осуществляется клеточными системами репарации, однако ее точный механизм и набор участников, вовлеченных в этот процесс, до сих пор остаются малоизученными, а существующие данные в значительной степени противоречивы. Понимание детального механизма постинтеграционной репарации ВИЧ-1 будет способствовать созданию новых анти-ВИЧ препаратов со сниженным риском развития резистентности. Ранее нам удалось показать, что процесс постинтеграционной репарации ВИЧ-1 зависит от двух клеточных репарационных киназ ATM и DNA-PKcs. Эти киназы активируются в ответ на ретровирусную интеграцию, а подавление их активности низкомолекулярными ингибиторами негативно сказывается на эффективности ранних этапов репликации ВИЧ-1. Обе киназы в жизнедеятельности клетки регулируют репарацию двуцепочечных разрывов ДНК по двум независимым путям: DNA-PK – по пути негомологичного объединения концов (NHEJ), а ATM – по пути гомологичной рекомбинации (HR). В случае интеграции ВИЧ-1 двуцепочечные разрывы ДНК не возникают, а вовлечение этих двух киназ в процесс репарации происходит через образование комплекса между интегразой ВИЧ-1 и клеточным белком Ku70 – компонентном DNA-PK комплекса. Мы идентифицировали остатки интегразы, ответственные за образование комплекса с Ku70, замена которых на аланин подавляет активацию ATM и DNA-PK в ходе постинтеграционной репарации ВИЧ-1 и, как следствие, нарушает репликацию вируса. Перед нами стояли два вопроса, продиктованные клеточными функциями ATM и DNA-PKcs: 1) могут ли другие участники NHEJ-пути наряду с DNA-PK комплексом принимать участие в репликации ВИЧ-1; 2) участвует ли MRN комплекс, привлекающий ATM к местам двуцепочечных разрывов ДНК при HR-пути, в ранних этапах репликации ВИЧ-1. Для ответа на них нами был осуществлен дизайн siРНК к ряду генов из NHEJ-пути, а также к MRN-комплексу. Эффективность siРНК была определена с помощью количественной ОТ-ПЦР. Для наиболее эффективных siРНК были проведены функциональные тесты с использованием VSV-G-псевдотипированного репликативно-некомпетентного вектора на базе генома ВИЧ-1. С использованием этих siРНК нам удалось определить, что наряду с Ku70, Ku80 и DNA-PKcs другие участники NHEJ-пути могут модулировать ранние этапы репликации ВИЧ-1. В то же время обработка клеток siРНК к компонентам MRN-комплекса не влияла на уровень продукции люциферазы при трансдукции псевдовирусом HIV_wt, что означает, что участие АТМ в постинтеграционной репарации ВИЧ-1 не зависит от MRN-комплекса, а, следовательно, его участие происходит по-иному механизму, чем в случае HR-пути. Наряду с этим мы проанализировали влияние репарационных полимераз человека (всего 8 штук) на постинтеграционную репарацию ВИЧ-1 с использованием аналогичного подхода. С помощью временного нокдауна репарационных полимераз мы установили, что для постинтеграционной репарации важна PolM из NHEJ-пути, но не другие полимеразы. Поскольку постинтеграционная репарация ВИЧ-1 напрямую зависит от киназной активности ATM и DNA-PKcs, для определения потенциальных участников этого процесса можно использовать подходы количественной фосфопротеомики. Мы сравнили профили фосфопептидов из клеток, трансдуцированных псевдовирусом на базе генома ВИЧ-1 с природным вариантом интегразы и с мутантном, неспособным взаимодействовать с Ku70 и запускать постинтеграционную репарацию. К сожалению, в текущей постановке эксперимента идентифицировать дифференциальные фосфопептиды, статистически достоверно отличающиеся в двух группах, нам не удалось, однако, в обоих группах образцов мы наблюдали признаки активации DNA-PKcs, что дает надежду на получение ожидаемых результатов после незначительной модификации протокола. Помимо всего прочего мы провели поиск и систематизацию информации о белках-мишенях DNA-PKcs, фосфорилируемых в ответ на различные внутриклеточные и внешние стимулы. В результате анализа 63 статей нам удалось составить каталог из 67 таких белков, содержащий информацию о условиях, в которых наблюдали фосфорилирование белка, сайтах модификации, а также эффекте этого фосфорилирования на функционирование клеточных систем. Эта информация в дальнейшем позволит системно интерпретировать данные, полученные в ходе фосфопротеомных экспериментов в нашей системе.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Вирус иммунодефицита человека представляет серьезную проблему для человечества, несмотря на создание широкого спектра антиретровирусных препаратов. Среди ВИЧ-инфицированных, которые впервые узнают о своем диагнозе и никогда не принимали антиретротровирусные препараты, все чаще встречаются устойчивые к действию антиретровирусной терапии штаммы вируса. Поэтому актуальной остается задача разработки альтернативных подходов к подавлению репликации вируса. Наш проект направлен на изучение наименее изученного этапа репликации ВИЧ-1 - постинтеграционной репарации, без которого невозможна эффективная вирусная инфекция. Понимание механизмов участия клеточных белков в этом процессе в будущем может позволить создать принципиально новые варианты терапии ВИЧ-1. Ранее нам удалось показать, что ключевую роль в инициации постинтеграционной репарации играет взаимодействие вирусной интегразы с клеточным белком Ku70. После образования комплекса к местам повреждений привлекаются репаративные киназы - DNA-PKcs и ATM. Подавление их активности низкомолекулярными специфичными ингибиторами нарушает репликацию ВИЧ-1. Однако конкретные белки, фосфорилируемые в ходе постинетграционной репарации этими киназами, до сих пор неизвестны. На третьем этапе выполнения проекта нам удалось определить ряд клеточных белков-участников систем репарации ДНК, статус фосфорилирования которых изменяется в ходе постинтеграционной репарации ВИЧ-1. Эти белки могут быть прямыми участниками постинтеграционной репарации ВИЧ-1, однако, это требует дополнительной проверки. На текущий момент нам удалось показать, что белки PNKP, LigIV и PolM важны для репликации ВИЧ-1 именно на стадии постинтеграционной репарации ДНК. Более того для полимеразы μ продемонстрирована принципиальная возможность достраивать одноцепочечные фрагменты ДНК, возникающие в ходе встраивания вирусной кДНК в геном клетки.