Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За первый год реализации проекта нами отсеквенированы 4 генома и 1 транскриптом ортонектид. Отработаны все методики для структурной и функциональной аннотации геномов. Полностью аннотирован геном Intoshia variabili и проведено его сравнение с другим видом ортонектид Intoshia linei, а также с геномами аннелид. На данный момент геном ортонектиды I. variabili (15,3 млн. п.о.) является самым маленьким и компактным геномом среди отсеквенированных многоклеточных животных. Чрезвычайно высокая компактизация (335 генов на 1 млн. п.о.) связана со значительным уменьшением количества генов и длины межгенных пространств, увеличением плотности их расположения, сокращением длины интронов, а также с уменьшением количества и разнообразия повторяющихся элементов генома. Также геном I. variabili демонстрирует редукцию большого числа генов, связанных практически со всеми жизненно важными процессами: метаболизмом, обработкой генетической информации, взаимодействием с окружающей средой, клеточными процессами. Результаты сравнительного анализа геномов опубликованы в статье Slyusarev, G., Starunov, V., Bondarenko, A., Zorina, N., Bondarenko, N., 2020. The smallest genome among Bilateria belongs to Intoshia variabili (Orthonectida), or what parasitism can do to an annelid. Curr Biol. 30,1-7 Журнал входит в рейтинг Q1, IF=9.1. Наблюдая за свободноживущей стадией R. ophiocomae, вышедшей из хозяина, мы заметили существенные различия в размерах и форме как самцов, так и самок. Важно отметить, что различия относятся не только к размеру самцов и самок: маленькие самцы и самки всегда выходят из одного хозяина одновременно, тогда как крупные всегда выходят из разных особей хозяина. Кроме того, удлиненные и яйцевидные формы самок демонстрируют значительные морфологические различия, особенно в нервной и мышечной системе (данные еще не опубликованы). Эти наблюдения предполагают существование двух отдельных близкородственных видов. Помимо этого, для больших и малых форм были секвенированы, собраны и аннотированы митохондриальные геномы, которые отличаются по длине и частично генному составу. Помимо этого, все гены различаются между собой и по нуклеотидному составу. Все это напрямую свидетельствует о том, что это два относительно недавно разошедшихся близкородственных вида. Впервые для ортонектид нами показано, что в геноме Intoshia linei гены организованы по типу оперона. Написан ряд скриптов на языке программирования Python для поиска и анализа оперонов. С помощью метода прогнозирования мы показали, что 53% генов в геноме Intoshia linei потенциально могут быть организованы в опероны. Из них при помощи транскрипционных данных было достоверно подтверждено 11.25 % генов. При этом гены организованы по классическому типу оперонов и транскрибируются как полицистронные транскрипты. Большинство проаннотированных генов, относится к семействам белков, отвечающих за обработку генетической информации. Данный тип регуляции компенсирует экстремально малый размер генома.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За второй год реализации проекта нами отсеквенированы 2 генома турбеллярий, 1 геном и 2 транскриптома ортонектид. Отработаны все методики для структурной и функциональной аннотации геномов. Общий размер сборки составил 1 Гб для Notentera ivanovi для и 1,2 Гб Grafilla sp. При этом покрытие для Notentera ivanovi составило 15 х, а для Grafilla sp – 10х. Было решено продолжать секвенирование для увеличения покрытия геномов. В результате секвенирования геномов турбеллярий были получены полный митохондриальный геном турбеллярии Notentera ivanovi и частично неполный для Grafilla sp. Для мт генома Grafilla sp. Так мт геном Notentera ivanovi представляет собой кольцевую молекулу НК, которая значительно отличается от мт геномов свободноживущей стадии. Оба ядерных генома турбеллярий были структурно аннотированы, а также были предсказаны гены. Функциональная аннотация будет выполнена после увеличения покрытия геномов. Нами выполнена масштабная работа по реконструкции филогенетического положения ортонектид внутри дерева Annelida. Выяснилось, что на филогенетическом дереве ортонектиды образуют длинные ветви и притягиваются к орбиниидам за счет эффекта LBA. Мы применили несколько подходов для построения филогенетического дерева для того, чтобы определить является ли это эффектом LBA или же это истинное положение ортонектид рядом с орбиниидами. Мы показали, что быстро развивающиеся Orbiniida представляют собой мощный аттрактор для ортонектид которые на самом деле группируются с Clitellata. В целом наши данные ML хорошо согласуются с систематикой ортонектид, предложенной Kozloff (1992). Мы продолжили работу по поиску и характеризации оперонов у ортонектид. Во второй год выполнения проекта поиск полицистронных транскриптов был выполнен для еще одного вида ортонектид I.variabili. Результаты по аннотациям транскриптов I.variabili в общих чертах достаточно схожи с результатами по аннотации I.linei. Кроме того, мы обнаружили у всех видов нетипичные опероны, содержащие гены с обеих цепей, а также опероны, состоящие из палиндромов. При этом секвенирование незрелой матричной РНК показало, что все транскрипты, включая и нетипичные образуются не за счет процессов транс-сплайсинга как у остальных Metazoa у кого были обнаружены опероны. По типу организации опероны ортонектид близки классическим оперонам, образующимся непосредственно в процессе самой транскрипции. Это уникальные данные, так как для Metazoa известно образование только лишь дицистронных транскриптов у дрозофилы и не в таком массовом количестве, в то время как у ортонектид встречаются полицистронные транскрипты, содержащие до 6 генов. Данная уникальная особенность организации процесса транскрипции, несомненно, является результатом компактизации геномов, возникшей независимо, и адаптацией ортонектид в связи с паразитическим образом жизни. Было подано в печать 3 статьи, которые в данный момент находятся на рецензии.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На основе полученных молекулярных и морфологических данных мы пришли к выводу что вид Rhopalura ophiocomae разделился на два близкородственных вида. Так сравнительный анализ митохондриальных геномов больших и малых свободноживущих форм Rhopalura ophiocomae показал, что длина и базовый состав белок-кодирующих генов, генов рРНК и тРНК различаются между двумя формами R. ophiocomae. Помимо молекулярно-генетических различий самки Rhopalura различались по форме и размеру тела, а самцы имели сходную форму тела, но различались по размеру. На основе полученных нами данных мы предложили разделить ранее считавшимся одним вид на два при этом сохранив название Rhopalura ophiocomae для крупных самцов и самок, а мелкие формы предложили называть Rhopalura kozloffi. Нами выполнено дополнительное секвенирование и сборка 2 ядерных геномов турбеллярий, собранных в Дальних Зеленцах на литорали Баренцева моря. Общий размер сборки после этапов очистки от контаминантов составил 568 Мб для Notentera ivanovi для и 750 Мб Grafilla sp. При этом покрытие для Notentera ivanovi составило 20 х, а для Grafilla sp – 30х. Размеры геномов оказались значительно больше чем мы предполагали ранее, вероятно необходимо будет продолжить секвенирование, чтобы понять окончательный ли это размер или нет. Оба ядерных генома турбеллярий были структурно переаннотированы, были повторно предсказаны гены и проведена функциональная аннотация. Также мы секвенировали транскриптомы двух паразитических турбеллярий. В результате сборки мы получили транскриптомы размером 35,5 мб и 42 мб для Notentera ivanovi и Grafilla sp. соответственно. Проведенный далее биоинформатический анализ показал классическую структуру мРНК с одной открытой рамкой считывания внутри. Таким образом мы сделали вывод, что гены у двух исследуемых видов не организованы в опероноподобные структуры и каждый из них транскрибируется под собственным промотором. В процессе создания репрезентативной выборки видов плоских червей для мультигенной филогениимы столкнулись тем, что данный класс в принципе довольно бедно представлен секвенированными видами. Ввиду этого определить точное местоположение внутри отряда Rhabdocoela не представляется возможным. В третий год выполнения проекта поиск полицистронных транскриптов был выполнен для Rhopalura litoralis. Мы секвенированы транскриптомы с последующей оценкой качества и сборкой по отработанной методике. Общий размер собранного de novo транскриптома равен 26 млн п.н. Всего было подтверждено 1527 генов, организованных по типу оперонов. Такое низкое количество подтверждённых полицистронных транскриптов вероятно связано с тем, что мы секвенировали недостаточно глубоко. Количество цистронов в транскриптах имеет значения 2,3,4 и 5. После выравнивания найденных оперонов на геном, было подсчитано среднее значение межгенного расстояния, равное 783 п.н., что почти идентично значению по предсказанным оперонам. Все гены, организованные по типу оперона, были аннотированы. Полностью было проаннотировано 375 полицистронных транскриптов, 656 – частично проаннотированы и 496 – состоят из генов с неизвестной функцией. Большая часть, как и у других видов ортонектид относится процессам, связанным с обработкой генетической информации. К процессам метаболизма и передачи сигналов относится примерно равное количество. Нами выполнена масштабная работа по определению генов, экспрессирующихся в исключительно паразитической стадии жизненного цикла для расширения представлений о механизмах адаптации ортонектид к паразитизму. Мы секвенировали транскриптомы зараженного и незараженного ортонектидой Intoshia linei хозяина Lineus ruber. В результате получили сборки зараженного и незараженного хозяина Lineus ruber содержащие 40,015 и 177, 252 контига, представляющих собой транскриптомы размером 46,3 Мб и 156,1 Мб соответственно. В результате сравнительного транскриптомного анализа мы выявили 126 генов, экспрессирующихся только на стадии плазмодия, и охарактеризовали их. Мы провели сравнительный геномный анализ для ортонектид и сравнили их с таковыми для паразитической нематоды Caenorhabditis elegans. Мы показали, что прослеживается четкая закономерность в редукции генома и, соответственно, в морфологическом упрощении. В зависимости от степени паразитического образа жизни мы можем наблюдать как относительно минимальные изменения (Caenorhabditis elegans), так и глобальное упрощение и редукцию как на органном уровне, так и на молекулярно-генетическом (Intoshia variabili). Также мы показали, что организация генов в опероноподобные кластеры является эволюционной адаптацией, возникающей в результате значительной компактизации геномов у паразитических видов. При этом образование кластеров функционально связанных генов носит случайный характер. Геномы паразитических турбеллярий претерпели незначительную редукцию по сравнению с ортонектидами. Работа над данной частью исследований продолжается в связи с большим объемом полученного нами материала. Подано в печать 5 публикаций: 1. Bondarenko N., Skalon E., Bondarenko A., Slyusarev G. 2022. Mitochondrial genome supports hypothesis of divergence of Rhopalura ophiocomae (Orthonectida, Annellida) into two closely related species. Organism diversity and evolution - Q1 2. Bondarenko N., Skalon E., Slyusarev G. 2022. Enigmatic plasmodium: discovering genes related to its formation in Orthonectida. Current Biology Q1 3. Bondarenko NI, Slyusarev GS, Bondarenko AS 2022. Operon-like gene clusters as a unique adaptation of Orthonectida to the extreme genome reduction and compactization. Nature genetics – Q1 4. Slyusarev GS, Skalon EK, Bondarenko NI, Starunov VV 2022. The structure of the plasmodium of Intoshia linei (Orthonectida). The orthonectids’ plasmodium: what is it? International Journal of Parasitology Q1 5. Bondarenko N.I., Yakovleva Y.A., Zorina N.A., Starunov V.V., Skalon E.K. , Bondarenko A.S., Slyusarev G.S. 2022. Orthonectida change the view on the phylogeny of Annelida. Invertebrate zoology