Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Выполнены работы в рамках шести направлений (блоков): - Блок 1. Исследование встречаемости и разнообразия эндофитных дрожжей плодово-овощных культур, выращиваемых на территории России в различных регионах и поставляемых из других стран. Было исследовано 1023 образца внутренних тканей плодов, собраны и обработаны данные для 54 наименований культур из 36 стран, включая выращенные в России. Данные были получены и обработаны для следующих наименований плодово-ягодных и овощных культур: миндаль (Азербайджан и Грузия), яблоки (Аргентина, Белоруссия, Чили, Китай, Молдавия, Россия, Сербия, Турция), абрикос (Македония, Сербия, Турция), авокадо (Кения и Мексика), бананы (Эквадор), свекла (Индия, Киргизия, Россия), черная смородина (Китай и Россия), терн и тернослив (Россия), морковь (Белоруссия и Молдавия), вишня (Армения, Египет, Россия), огурцы (Казахстан, Россия, Турция), кумкват (Россия), смородина красная (Россия), финики (Ангола), кизил (Россия), баклажаны (Иран, Израиль, Турция), крыжовник (Россия), виноград (Иран, Россия, Турция, Узбекистан), гуава (Вьетнам), киви (Чили, Греция, Иран), лимоны (Аргентина и Испания), личи (Мадагаскар), лонганы (Вьетнам), мандарины (Чили, Марокко, Испания), манго (Бразилия, Перу, Тайланд), дыня (Россия), апельсины (Египет), маракуйя (Вьетнам), персики (Китай и Турция), арахис (Грузия), груши (Бельгия, Иран, Израиль, Молдавия, Турция), перец сладкий (Белоруссия, Иран, Израиль, Турция), хурма (Абхазия, Азербайджан, Израиль), ананас (Коста-Рика), фисташки (Грузия и Турция), питайя (Вьетнам), слива (Азербайджан, Молдавия, Россия, Сербия, Турция), гранат (Италия и Турция), грейпфрут (Турция), картофель (Азербайджан, Египет, Пакистан), тыква (Россия и Турция), айва (Россия), рамбутан (Вьетнам), облепиха (Китай и Россия), ирга (Россия), кабачки (Россия и Турция), клубника (Армения и Россия), черешня (Молдавия, Россия, Сербия, Турция), тамарилло (Колумбия), помидоры (Китай, Россия, Турция), грецкие орехи (Россия), арбуз (Россия), цуккини (Китай и Турция). Медианное значение численности дрожжей в исследованный плодоовощной продукции составило 2.20 × 10^3 КОЕ/г, что превышает пороговые значения «Требований безопасности…» (СанПиН 2.3.2.1078-01), но, в то же время, соответствует известным ранее показателям по средней численности дрожжей-эндофитов на уровне 10^2 - 10^4 КОЕ/г. Из исследованных 54 наименований плодоовощных культур (обработанные данные) было выделено 74 вида дрожжевых грибов, из которых 32 относятся к аскомицетам и 42 – к базидиомицетам. Несмотря на невысокое разнообразие дрожжей-аскомицетов, на долю образцов с их доминированием (более 60% в сообществе) приходится около 68%. Анализ частоты встречаемости дрожжевых грибов на видовом уровне во всех рассматриваемых образцах также показывает преобладание аскомицетовых дрожжей в эндофитном сообществе: Aureobasidium pullulans (23,17%), Candida zeylanoides (26,20%), Debaryomyces fabryi (19,75%), D. hansenii (11,05%), Hanseniaspora uvarum (14,96%), Metschnikowia pulcherrima (22,87%), Meyerozyma carribica (19,94%), Mey. guilliermondii (10,95%), Rhodotorula mucilaginosa (16,52%). Обнаружено, что для видов A. pullulans, Filobasidium magnum, H. uvarum, Rhodosporidiobolus colostri, Rhodotorula babjevae, Sympodiomycopsis kandeliae и Vishniacozyma victoriae показатели частоты встречаемости в импортных и отечественных сельскохозяйственных культурах практически соответствуют. Преимущественно в отечественной плодоовощной продукции чаще были обнаружены виды Bullera alba, Cystobasidium sp. КБП YE-0710, Kwoniella pini, Naganishia albida, Papiliotrema flavescens, тогда как в импортной – Candida parapsilosis, C. zeylanoides, D. fabryi, D. hansenii, Filobasidium wieringae, Meyerozyma carribica, Mey. guilliermondii, Rh. mucilaginosa, Vishniacozyma carnescens. Однако для более детального анализа географической и субстратной дифференциации необходимо проведение дополнительных анализов на следующих этапах реализации проекта. Очевидно, что нельзя все обнаруженные в плодах дрожжи отнести к истинным или облигатным эндофитам, развитие которых идет бессимптомно и только во внутренних тканях, а следует рассматривать выявленные группировки дрожжей как способные к эндофитному образу жизни и отдельно учитывать виды-контаминанты. Вероятнее всего, к последним можно отнести патогенные и клинически значимые культуры дрожжей, но есть ли у этих культур адаптации к эндофитному образу жизни в растительных тканях – вопрос, на который мы постараемся ответить на следующих этапах реализации проекта. К клинически значимым видам дрожжей уровня BSL-2, обнаруженным в мякоти исследованных культур, закупка которых производилась на территории России, относится C. parapsilosis. Анализ встречаемости и обилия вида C. parapsilosis в дрожжевом сообществе исследованных культур показывает, что значительная его доля приходится на овощную продукцию: корнеплоды, клубнеплоды и бахчевые. - Блок 2. Создание коллекции эндофитных дрожжей. В ходе реализации проекта создана коллекция эндофитных дрожжевых грибов численностью 1056 штаммов. Обозначение штаммов в коллекции идет под акронимом и номером «КБП YE-0000». Коллекция эндофитных дрожжевых грибов является частью Коллекции дрожжей кафедры биологии почв МГУ (WDCM 1173). В коллекцию эндофитных дрожжевых грибов помещаются изоляты дрожжей-эндофитов сразу после их выделения из исследованных субстратов. Электронный каталог коллекции, размещенный на сайте https://depo.msu.ru/, включает 869 культур, для которых проведена видовая идентификация. Коллекция эндофитных дрожжевых грибов на данном этапе реализации проекта включает 108 видов дрожжей, из которых 16, предположительно, являются новыми, ранее неизвестными, или ещё пока неописанными видами. Наибольшее количество видов дрожжей в коллекции приходится на роды Candida (20 видов), Filobasidium, Rhodotorula, Vishniacozyma и Yarrowia (по 5 видов), Debaryomyces, Metschnikowia, Moesziomyces и Papiliotrema (по 4 вида). Собранная коллекция дрожжей-эндофитов, помимо новых таксонов, включает в себя виды, которые ранее рассматривались в качестве антагонистов фитопатогенов и продуцентов растительных фитогормонов. Таким образом, собранная коллекция делает возможным более детальное изучение биотехнологического потенциала дрожжей-эндофитов и их использование в качестве биоконтроля развития фитопатогенов. - Блок 3. Исследование эндофитных дрожжей в сочных плодах Malus domestica культурных и диких форм произрастания. Анализ количества дрожжей в сочной мякоти яблок различного происхождения в зависимости от концентрации в них сахаров, т.е. спелости, демонстрирует низкие значения численности эндофитных дрожжей в импортной и выращиваемой промышленно сельскохозяйственной продукции. В отличие от городских и приусадебных садов, где численность дрожжей напрямую зависит от концентрации сахаров в сочной мякоти, в промышленной продукции средние значения численность эндофитных дрожжей не зависит от концентрации сахаров. Впервые показано, что дрожжи можно обнаружить не только в сочных тканях фруктов, но и внутри семян. Количество эндофитных дрожжей, выделенных в ходе проведенного исследования из сочной мякоти и из семян, составило 33 вида. Из внутренних тканей плодов и из семян наиболее часто выделялись виды: A. pullulans, C. parapsilosis, C. zeylanoides, Cystofilobasidium capitatum, D. fabryi, F. magnum, F. wieringae, H. uvarum, Leucosporidium scottii, M. pulcherrima, Rh. babjevae, Rh. mucilaginosa и Yarrowia spp. Сравнения встречаемости видов дрожжей в сочной мякоти и в семенах яблок демонстрирует высокий уровень корреляции данных. Однако преимущественно из мякоти чаще выделялись типичные эпифитные и эвритопные виды: F. magnum, F. wieringae, Moesziomyces aphidis, D. hansenii, Rh. mucilaginosa, а в семенах обнаруживались виды C. zeylanoides, Metschnikowia chrysoperlae, Rh. babjevae, V. carnescens и Yarrowia galli. Сравнение эндофитных дрожжевых сообществ мякоти сочных плодов Malus domestica, импортируемых в Россию из других стран, показало присутствие только в них видов D. fabryi, Mey. carribica и Mey. guilliermondii, также преимущественно в импортной продукции с большими показателями относительного обилия и заметно чаще встречались виды C. zeylanoides, Rh. babjevae и Y. galli. В ходе текущих исследований были обнаружены штаммы новых видов дрожжей из родов Cystobasidium (КБП YE-0710) и Papiliotrema (КБП YE-0283). - Блок 4. Исследование особенностей эндофитного дрожжевого населения ягод винограда; сравнение дрожжевых сообществ виноградников Дагестана и сельскохозяйственной продукции. Подготовлен анализ многолетних исследований дрожжевого населения виноградников Дагестана (статья принята к печати). В ходе исследования ягод винограда (продукция из Ирана, России, Турции, Узбекистана) обнаружено, что средняя численность дрожжей в них составляет 4.38±1.22 lg(КОЕ/г). Для исследованных плодов можно отметить, что численность дрожжей зависит от содержания сахара в ягодах. Из ягод винограда было выделено 20 видов дрожжевых грибов. Среди наиболее частых изолятов были следующие виды: A. pullulans, Cystofilobasidium macerans, D. fabryi, F. magnum, H. uvarum, Mey. carribica, Papiliotrema flavescens, Rh. babjevae, Sporidiobolus metaroseus, V. victoriae, Wickerhamomyces onychis. Среди общих дрожжей для виноградников Дагестана и из торговых сетей были A. pullulans, F. magnum, H. uvarum M. pulcherrima и Mey. guilliermondii. Полученные пересечения в видовом составе дрожжей указывают нам на общность черт дрожжевого населения, ассоциированного с ягодами винограда. Следует отметить обнаружение клинически значимого вида C. parapsilosis в образцах винограда из Узбекистана и Турции. Обнаружение клинически значимых видов C. albicans, C. glabrata, C. orthopsilosis и P. kudriavzevii и др. на винограде Дагестана, как и на винограде из других регионов, – черта микробного населения, которая может отражать определенный уровень антропогенной нагрузки в агроценозе. - Блок 5. Исследование особенностей формирования эндофитного дрожжевого населения импортируемой сельскохозяйственной продукции, сравнение данных для внутренней продукции Вьетнама и импортируемой в Россию. Для решения вопросов о возможной контаминации сельскохозяйственной продукции при хранении и транспортировке было проведено исследование дрожжей-эндофитов сельскохозяйственной продукции во Вьетнаме и импортируемой в Россию. Исследование проведено в ноябре-декабре 2019 года в микробиологической лаборатории Российско-Вьетнамского тропического научного центра. В импортируемой из Вьетнама продукции были обнаружены 10 видов дрожжей, в исследованной на месте – 35. Среди общих видов – Hanseniaspora thailandica, Mey. caribbica и Mey. guilliermondii. Анализ частоты встречаемости видов дрожжевых грибов по изолятам двух исследованных выборок демонстрирует заметные различия, связанные в первую очередь с высоким уровнем присутствия клинически значимых видов дрожжей. Среди таких видов из группы BSL-2 из сельскохозяйственных культур внутреннего рынка Вьетнама были обнаружены C. parapsilosis, C. orthopsilosis, C. tropicalis, а также клинически важные виды Diutina catenulata и Pichia kudriavzevii. Частота встречаемости изолятов дрожжей из группы BSL-2 и отмеченных выше клинически важных дрожжей в сельскохозяйственных культурах, купленных во Вьетнаме, составила 27,6%. В импортируемой из Вьетнама плодах эти виды обнаружены не были. К настоящему моменту остаются вопросы: на каком этапе происходит контаминация плодоовощной продукции данными культурами, зависит ли их количество от спелости, есть ли у этих культур адаптации к эндофитному образу жизни в растительных тканях. - Блок 6. Описание новых видов дрожжевых грибов. Подготовлены и приняты к печати описания трех новых видов дрожжей: Yamadazyma cocois I.A. Maksimova, A.M. Glushakova, V.N. Thanh & Kachalkin, sp. nov. Candida pellucida A.M. Glushakova, M.A. Tomashevskaya & Kachalkin, sp. nov. Vishniacozyma phoenicis Kachalkin, A.S. Venzhik & M.A. Tomashevskaya, sp. nov. Штаммы для описания новых видов были выделены в ходе реализации проекта и обнаружены при сравнении новых результатов с полученными ранее. Типовые культуры новых видов были переданы в коллекции ВКМ (Россия), DSMZ (Германия), CBS (Нидерланды), VCIM (Вьетнам), VTCC (Вьетнам). Подготовленные описания трех новых видов дрожжей приняты к печати в журналах Persoonia (IF 6.860) и International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IF 2.166).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Выполнены работы в рамках 8 направлений (блоков): - Блок 1. Исследование встречаемости и разнообразия эндофитных дрожжей плодовых культур, выращиваемых на территории России и поставляемых из других стран. Заключительный этап. За два года выполнения проекта было исследовано 1885 образцов внутренних тканей плодов, собраны и обработаны данные для 81 наименования культур из 38 стран, включая выращенные в России. Данные были получены и обработаны для следующих групп плодово-ягодных и овощных культур: - Семечковые: айва (Россия), груши (Бельгия, Иран, Израиль, Китай, Молдавия, Турция), яблоки (Аргентина, Белоруссия, Чили, Китай, Молдавия, Россия, Сербия, Турция, ЮАР). - Косточковые: абрикос (Македония, Сербия, Турция), вишня (Армения, Египет, Россия), персики (Китай и Турция), слива (Азербайджан, Молдавия, Россия, Сербия, Турция), терн и тернослив (Россия), черешня (Молдавия, Россия, Сербия, Турция). - Ягодные: ирга (Россия), клубника и земляника (Армения и Россия), крыжовник (Россия), облепиха (Китай и Россия), смородина красная (Россия), черная смородина (Китай и Россия), - Орехоплодовые: арахис (Грузия), грецкий орех (Россия), кедровые орехи (Россия), миндаль (Азербайджан и Грузия), фисташки (Грузия и Турция), фундук (Грузия). - Цитрусовые: апельсины (Египет), грейпфрут (Турция), кумкват (Россия), лимоны (Аргентина, Израиль, Испания, Турция), мандарины (Испания, Марокко, Чили), - Разноплодные субтропической и умеренной зон (далее – разноплодные): гранат (Италия и Турция), зизифус (Россия), инжир (Россия), киви (Греция, Иран, Чили), кизил (Россия), фейхоа (Азербайджан, Грузия, Россия), хурма (Абхазия, Азербайджан, Израиль), шелковица (Грузия). - Тропические разноплодные: авокадо (Кения и Мексика), ананас (Бразилия и Коста-Рика), аннона (Вьетнам), бананы (Эквадор), гуава (Вьетнам), личи (Мадагаскар), лонганы (Вьетнам), манго (Бразилия, Вьетнам, Перу, Тайланд), маракуйя (Вьетнам), папайя (Вьетнам), питайя (Вьетнам), рамбутан (Вьетнам), салак (Индонезия и Таиланд), саподилла (Вьетнам), финики (Индия). - Виноградовые: виноград (Иран, Россия, Турция, Узбекистан), - Клубнеплоды: батат (Индия и Индонезия), картофель (Азербайджан, Египет, Казахстан, Пакистан, Россия). - Корнеплоды: морковь (Белоруссия, Молдавия, Россия), редис (Россия), свекла (Индия, Киргизия, Россия), хрен (Россия), цикорий (Иран). - Салатные и капустные: капуста (Россия), китайская капуста (Китай), кресс-салат (Израиль), петрушка (Китай, Россия, Узбекистан), радиккьо (Израиль), рукола (Турция), салат-латук (Китай), сельдерей (Россия), шпинат (Израиль и Китай). - Паслёновые: баклажаны (Иран, Израиль, Россия, Турция), красный острый перец (Таиланд), перец сладкий (Белоруссия, Иран, Израиль, Россия, Турция), помидоры (Китай, Россия, Турция), тамарилло (Колумбия), физалис (Таиланд и Чили). - Бахчевые и тыквенные: арбуз (Иран и Россия), дыня (Россия), кабачки (Россия и Турция), мелотрия шершавая (Турция), огурцы (Казахстан, Россия, Турция), тыква (Россия и Турция), цуккини (Китай и Турция), чайот (Мексика). Среднее значение численности эндофитных дрожжей в исследованной плодоовощной продукции составило 2,73±0,80 × 10^3 КОЕ/г, медианное – 2,35 × 10^3 КОЕ/г, что соответствует известным ранее показателям по средней численности дрожжей-эндофитов на уровне 10^2 – 10^4 КОЕ/г. Эндофитное сообщество дрожжей в исследованных 699 образцах отечественной продукции было представлено 68 видами, а в 1186 импортной – 80 видами; общих видов было 45. Всего в результате исследования было выделено 102 вида дрожжевых грибов, из которых 52 относятся к аскомицетам и 50 – к базидиомицетам. Дрожжи-аскомицеты доминировали почти во всех исследованных группах сельскохозяйственной продукции, а их средняя доля составляла около 75 %. С частотой встречаемости более 5 % как в отечественной, так и в импортной продукции обнаруживаются виды: Candida zeylanoides, Aureobasidium pullulans, Debaryomyces fabryi, Debaryomyces hansenii, Metschnikowia pulcherrima, Candida parapsilosis, Hanseniaspora uvarum, Rhodotorula mucilaginosa, Meyerozyma guilliermondii, Rhodotorula babjevae. Полученные данные о структуре сообществ дрожжей эндофитов были использованы для дифференциации исследованных групп плодово-ягодных и овощных культур. Проведенная кластеризация продемонстрировала заметное отличие отечественной продукции от импортной, а также, за небольшим исключением, фруктово-ягодных группировок от овощной продукции. Рассматриваемые группировки заметно различаются как по видовому разнообразию, так и по индексу разнообразия Шеннона. Максимальное видовое разнообразие дрожжей-эндофитов зафиксировано для тропических плодов. Очевидно, что нельзя все обнаруженные в плодах дрожжи отнести к истинным или облигатным эндофитам, развитие которых идет бессимптомно и только во внутренних тканях, а следует рассматривать выявленные группировки дрожжей как способные к эндофитному образу жизни и отдельно учитывать виды-контаминанты. Вероятнее всего, именно к ним можно отнести патогенные и клинически значимые культуры дрожжей. К клинически значимым видам дрожжей уровня BSL-2, наиболее часто обнаруженным в мякоти исследованных культур, относится C. parapsilosis. Средняя частота встречаемости этого вида по всем образцам за два года исследований составила 13 %. Значительная его доля приходится на овощную продукцию: корнеплоды, клубнеплоды, бахчевые и салатные растения. Помимо дрожжей C. parapsilosis, в ходе проведения исследования были обнаружены и другие виды из группы BSL-2: Candida albicans и C. orthopsilosis, их средняя частота составляет 0,95 % и 0,42 %, соответственно. Однако их доля в дрожжевом населении в некоторых продуктах может достигать высоких значений. - Блок 2. Создание коллекции эндофитных дрожжей. Заключительный этап. В ходе реализации проекта в 2019–2021 гг. создана коллекция эндофитных дрожжевых грибов численностью 2135 штаммов с низкотемпературным (-80 ºC) хранением культур. Коллекция эндофитных дрожжевых грибов является частью Коллекции дрожжей кафедры биологии почв МГУ (WDCM 1173). Электронный каталог коллекции, размещенный на сайте https://depo.msu.ru/, включает информацию о 1844 культурах, для которых к текущему моменту проведена видовая идентификация. Коллекция эндофитных дрожжевых грибов включает 131 вид дрожжей. Коллекция состоит из 56 родов дрожжевых грибов, наибольшее количество видов дрожжей в коллекции приходится на роды Candida (21 вид), Rhodotorula (6 видов), Vishniacozyma (6 видов), Debaryomyces (5 видов), Metschnikowia (5 видов) и Filobasidium (5 видов). Доминирующие и наиболее часто встречающиеся в эндофитном сообществе виды дрожжей представлены в коллекции несколькими штаммами, что дает возможность на широком спектре культур оценить их физиологические свойства. - Блок 3. Продуцирование фитогормона ауксина эндофитными дрожжами. Проведено исследование синтеза 3-индолилуксусной кислоты (ИУК) для выборки из 97 штаммов дрожжей, относящихся к наиболее частым видам и родам, встречающимся в эндофитном сообществе. Были исследованы 9 родов, включающие 17 видов: A. pullulans, C. parapsilosis, C. zeylanoides, D. fabryi, D. hansenii, F. magnum, F. wieringae, H. uvarum, Met. pulcherrima, Mey. caribbica, Mey. guilliermondii, Rh. babjevae, Rh. mucilaginosa, Y. deformans, Y. divulgata, Y. galli, Y. lipolytica. Показано, что 3-индолилуксусная кислота (ИУК) после трехдневного культивирования присутствует в культуральной жидкости 72 % исследованных штаммов. Полученные нами результаты показали, что все исследованные виды способны к синтезу ИУК, однако уровень продукции носит штаммовый характер. Обнаруженные в ходе данного исследования наиболее активные штаммы дрожжей относятся к видам A. pullulans, C. zeylanoides, H. uvarum Met. pulcherrima, Mey. caribbica, Rh. mucilaginosa, Y. galli. Максимальный уровень продукции ИУК (9109,2 мкг/г) был обнаружен для штамма A. pullulans YE-0979, выделенного из листьев кресс-салата. - Блок 4. Образование фитогормона зеатина эндофитными дрожжами из плодов Malus domestica. Проведено исследование синтеза дрожжами фитогормона зеатина (группа цитокининов) для выборки культур выделенных в качестве эндофитов из плодов Malus domestica отечественного и импортного происхождения. Были исследованы 9 видов дрожжевых грибов: C. parapsilosis, C. zeylanoides, H. uvarum, Met. pulcherrima, Rh. babjevae, Rh. mucilaginosa, Y. divulgata, Y. galli и Y. lipolytica. Полученные результаты показали продукцию зеатина у 71 % исследованных штаммов дрожжей-эндофитов. Эти данные заметно выше ранее полученных результатов (55 % штаммов) для выборки дрожжевых культур из разных местообитаний (Streletskii et al., 2019). Для большинства исследованных культур уровень продукции зеатина был схожим и находился в пределах 20–70 нг/г сухой биомассы. Сопоставление продукции зеатина и ауксина у исследованной выборки дрожжей-эндофитов из яблок показало, что 47 % исследованных штаммов способны синтезировать сразу два фитогормона. - Блок 5. Антагонизм дрожжей-эндофитов по отношению к фитопатогенным грибам. Исследованы 103 штамма дрожжей, относящихся к 17 видам, которые наиболее часто выделяются из внутренних тканей сельскохозяйственных плодов на проявление антагонизма против 10 штаммов фитопатогенных грибов из коллекции ВКМ: Alternaria alternata (F-3047 и F-4343), Botrytis cinerea (F-3850 и ВКМ F-4549), Fusarium oxysporum (F-140 и F-2313), Rhizoctonia solani (F-895 и F-2935) и Sclerotonia sclerotiorum (F-879 и F-1195). Обнаружено, что около 20 % исследованных штаммов дрожжей-эндофитов каждого из отделов (Ascomycota и Basidiomycota) проявляют антагонизм по отношению к исследованным фитопатогенам. Дрожжи-аскомицеты чаще продуцируют БАВ, формирующие зону отсутствия роста микромицетов при их совместном культивировании (7 %), чем дрожжи-базидиомицеты (1 %). Торможение роста штаммами из отдела Ascomycota наблюдается в 14 % случаев, у отдела Basidiomycota – в 17 %. Среди изученных видов дрожжей наибольшую антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам продемонстрировали штаммы видов A. pullulans, Met. pulcherrima, Rh. babjevae, Y. deformans, Y. lipolytica. Полученные результаты показали, что 46 из 103 исследованных штаммов дрожжей-эндофитов проявляют антагонизм, продуцируя БАВ с формированием зоны отсутствия роста микромицета. Некоторые из изученных штаммов дрожжей проявляли антагонизм сразу против нескольких видов фитопатогенов: против представителей 5 видов – Met. pulcherrima YE-0031, против 4-х видов – A. pullulans YE-0242, Met. pulcherrima YE-0159, против 3-х видов – A. pullulans YE-0260 и YE-0269, H. uvarum YE-0216 и YE-0310. - Блок 6. Исследование источников формирования эндофитного дрожжевого населения на примере агроценозов и городской среды. - Дрожжевое население почв ампелоценоза. Для оценки источников формирования эндофитного дрожжевого населения винограда было проведено исследование в весенний период сообщества дрожжей светло-каштановых почв под виноградником в пригороде Махачкалы (пос. Шамхал). Видовой состав дрожжей окультуренных светло-каштановых почв включает таксономически и функционально разные группы, относящиеся к 11 видам. Виды A. pullulans, H. uvarum, Met. pulcherrima, Mey. guilliermondii, F. magnum и V. carnescens, выделенные в ходе исследования, неоднократно, в том числе и среди доминантов, были обнаружены нами в качестве эндофитов в исследованной плодоовощной продукции в ходе реализации проекта. - Исследование дрожжевого население помета голубей как источника контаминации дрожжами плодов в городских парках. Проведено исследование дрожжевого разнообразия фекалий голубей в крупнейшем мегаполисе г. Москве для оценки роли голубей в контаминации плодов садовых растений в городской среде клинически значимыми видами дрожжей. Всего было обнаружено 13 видов дрожжей: 8 аскомицетов и 5 базидиомицетов. Многие обнаруженные виды дрожжей в фекалиях голубей (C. albicans, D. hansenii, Diut. catenulata, F. magnum, F. wieringae, Mey. guilliermondii, Rh. mucilaginosa) были встречены нами в качестве эндофитов в исследованной плодоовощной продукции в ходе реализации проекта. Часто встречаемый в качестве эндофита клинически значимый вид Candida parapsilosis, в том числе и в плодах из парков г. Москвы, в фекалиях голубей обнаружен не был. Это указывает на другие источники его распространения. - Блок 7. Исследование свойств клинически значимых дрожжей Candida parapsilosis, выделенных из сельскохозяйственной продукции. По результатам проведенных исследований, дрожжи Candida parapsilosis (микроорганизмы группы BSL-2) оказались наиболее широко распространенными среди оппортунистических дрожжевых грибов, выделенных нами из внутренних тканей плодоовощной продукции. Для оценки свойств, характеризующих проявление «агрессии», исследовали способность вырабатывать ферменты вирулентности (фосфолипазы А2) и персистентность к воздействию активно назначаемым антимикотикам (Амфотерицин В, Нистатин, Миконазол, Кетоконазол, Флюконазол, Клотримазол). Исследованы 27 штаммов C. parapsilosis, выделенные как эндофиты. Обнаружено, что по сравнению с референсным штаммом C. parapsilosis ATCC 22019, почти все исследованные культуры проявляют ту или иную степень устойчивости к разным концентрациям антибиотиков (2–5 наименований). Штаммы YE-1582, YE-1583 и YE-1597 показали повышенную устойчивость сразу к 5 антибиотикам. Исследование фосфолипазной активности показало, что 22 % тестируемых культур обладают активной фосфолипазой А2. Так, штаммы, выделенные из внутренних паренхимных тканей корнеплодов свеклы и кабачков (YE-1579, YE-1581, YE-1582, YE-1583 и YE-1584), характеризовались наибольшей активностью фосфолипазы: 13,6–21,1 ммоль/литр; они же продемонстрировали повышенную устойчивость к воздействию некоторых активно назначаемым антимикотикам. - Блок 8. Описание новых видов дрожжевых грибов. Были подготовлены и приняты к печати описания трех новых видов дрожжей: Cyberlindnera dauci A.M. Glushakova, M.A. Tomashevskaya & Kachalkin, 2020. Metschnikowia taurica Kachalkin, A.M. Glushakova & M.A. Tomashevskaya, 2021. Zygotorulaspora dagestanica Kachalkin, D.A. Abdullabekova, E.S. Magomedova & A.M. Yurkov, 2021. Выполнены фенотипическая и генотипическая характеристики штаммов новых видов, типовые культуры были переданы в коллекции ВКМ (Россия), ВКПМ (Россия), DSMZ (Германия) и CBS (Нидерланды). Всего в ходе реализации проекта по исследованию эндофитных дрожжей были описаны шесть новых видов: Candida pellucida, Cyberlindnera dauci, Metschnikowia taurica, Vishniacozyma phoenicis, Yamadazyma cocois и Zygotorulaspora dagestanica, что является важным вкладом в исследование таксономии и разнообразия дрожжевых грибов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Выполнены работы в рамках 6 направлений (блоков): - Блок 1. Антагонизм дрожжей-эндофитов по отношению к фитопатогенным грибам. Исследованы 103 штамма эндофитных дрожжей следующих видов: Aureobasidium pullulans, Candida parapsilosis, C. zeylanoides, Debaryomyces fabryi, D. hansenii, Filobasidium magnum, F. wieringae, Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia pulcherrima, Meyerozyma caribbica, Mey. guilliermondii, Rhodotorula babjevae, Rh. mucilaginosa, Yarrowia deformans, Y. divulgata, Y. galli и Y. lipolytica, выделенные из плодово-ягодных и овощных культур отечественного и импортного происхождения. Для тестирования на первом этапе работы были использованы 10 штаммов фитопатогенных грибов полученные из ВКМ: Alternaria alternata (F-3047 и F-4343), Botrytis cinerea (F-3850 и F-4549), Fusarium oxysporum (F-140 и F-2313), Rhizoctonia solani (F-895 и F-2935) и Sclerotonia sclerotiorum (F-879 и F-1195), применяли среды для культивирования сусло агар (MA) и картофельно-декстрозный агар (PDA). Второй этап работы заключался оценке антагонистической активности для дрожжей, проявивших наиболее широкий спектр действия. Проверка проводилась на среде ГПА с расширением списка фитопатогенов: Fusarium graminearum (F-1668 и F-1669), Penicillium digitatum (F-467 и F-4079) и Ustilago maydis (F-2971 и 75p6). Выявлено, что около 20 % исследованных штаммов дрожжей-эндофитов каждого из отделов (Ascomycota и Basidiomycota) проявляют антагонизм по отношению к исследованным фитопатогенам на средах MA и PDA. Дрожжи-аскомицеты чаще продуцируют БАВ, формирующие зону отсутствия роста микромицетов при их совместном культивировании, чем дрожжи-базидиомицеты. Среди исследуемых фитопатогенных грибов при совместном культивировании наибольшую чувствительность по отношению к дрожжам-эндофитам показали штаммы A. alternata F-4343 и F-3047, F. oxysporum F-2313, S. sclerotiorum F-1195 и F-879. Полученные результаты показали, что 47 из 103 исследованных штаммов дрожжей-эндофитов проявляют антагонизм против фитопатогенных грибов, продуцируя БАВ с формированием зоны отсутствия роста микромицета на средах MA и PDA. Некоторые из изученных штаммов дрожжей проявляли антагонизм сразу против нескольких видов фитопатогенов. 15 штаммов дрожжей-антагонистов с широким спектром действия (A. pullulans, H. uvarum, Met. pulcherrima и Y. lipolytica) исследованы с расширенным набором фитопатогенов на среде ГПА. Выявлено, что при совместном культивировании наибольшую чувствительность по отношению к отобранным активным дрожжам-эндофитам показали штаммы A. alternata F-4343 и F-3047, B. cinerea F-4549, F. graminearum F-1669, P. digitatum F-467 и F-4079, R. solani F-2935, S. sclerotiorum F-879 и U. maydis 75p6. Среди отобранных штаммов дрожжей-эндофитов наибольшую активность против 16 штаммов фитопатогенов показали штаммы A. pullulans. - Блок 2. Продукция фитогормонов гетероауксина, зеатина и гиббереллина эндофитными дрожжами Metschnikowia pulcherrima. Проведено исследованиепродукции фитогормонов для 20 штаммов Metschnikowia pulcherrima, выделенных из разных плодов отечественного и импортного происхождения. Триптофан, АТФ-Na в качестве прекурсоров не использовали. Количественное определение синтеза штаммами фитогормонов проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100 series. Полученные нами данные показали, что 100% исследованных культур Met. pulcherrima способны к синтезу гетероауксина (ИУК), 85.7% – зеатина (с учетом следовых количеств) и 28.6% – гиббереллиновой кислоты (ГК3). Эти данные указывают, что вид Met. pulcherrima способен не только являться известным антагонистом фитопатогенных грибов, но и стимулировать рост и развитие растения путем синтеза биологичестки активных веществ – фитогормонов. - Блок 3. Эндофитные дрожжи в разлагающихся растительных материалах. Немаловажные вопросы возникают о роли и судьбе эндофитных дрожжей при разложении растительных материалов. Были исследованы образцы фермерских овощей и фруктов со следами начала мацерация и дегенерация тканей. Обнаружено, что при начале разложения плодов не наблюдается «всплеск» развития дрожжей в овощах, но есть небольшой подъем численности во фруктах. Эндофитное сообщество на начальном этапе разложения овощей и фруктов сохраняет видовое разнообразие. Для выяснения роли беспозвоночных животных при разложении сельскохозяйственных плодов проведено методом метабаркодинга исследование изменения кормового субстрата Черной львинки (Hermetia illucens). На начальном этапе сообщество плодов включало 10 родов дрожжей, среди них Meyerozyma, Diutina, Vishniacozyma, Aureobasidium, Pichia и Rhodotorula, но на 5-ый день беспозвоночные кардинально меняют эндофитные группировки – остаются только роды Meyerozyma, Diutina и Pichia. - Блок 4. Исследование протеолитической активности оппортунистических дрожжей. Проведено тестирование штаммов дрожжей Candida (sensu stricto и sensu lato): Mey. caribbica (анаморфа C. fermentati), C. parapsilosis и Mey. guilliermondii (анаморфа C. guilliermondii) на способность к протеолитической активности. Эти оппортунистические виды дрожжей, по полученным ранее данным, занимают 5, 7 и 10е место в ранжированном списке дрожжей-эндофитов со встречаемостью 14.96%, 13.00% и 9.87%, соответственно. Исследование протеолитической активности показало, что у эндофитных штаммов C. parapsilosis она выше, чем у эндофитных штаммов Mey. guilliermondii и Mey. carribica, cредние значения Pz составили 0.30, 0.53 и 0.59, соответственно. Среди штаммов, обладающих наиболее активными протеазами (Pz = 0.26-0.29) оказались штаммы, обнаруженные во внутренних тканях овощной продукции. - Блок 5. Таксономическое исследования коллекции эндофитных дрожжей. Благодаря использованию методов белковое профилирование MALDI-TOF MS и DNA barcoding с использованием основных генетических маркеров грибов (ITS регион и D1/D2 домены LSU рДНК) среди штаммов из собранной коллекции дрожжей-эндофитов были обнаружены представители новых видов из родов Papiliotrema и Leucosporidium. Описание нового вида Papiliotrema horticola опубликовано в декабре 2021 г. в ж. Persoonia (IF 8.227). Подготовлено описание нового вида дрожжей Leucosporidium egoroviorum. - Блок 6. Межколлекционный обмен в 2019-2022 гг. 39 штаммов дрожжевых грибов, работа с которыми проводилась в рамках проекта РНФ, были переданы во Всероссийскую Коллекцию Микроорганизмов. Среди переданных в коллекцию ВКМ штаммов, помимо представителей новых видов дрожжей, были также антагонисты фитопатогенов с широким спектром действия, продуценты фитогормонов, а также штаммы-эндофитов Candida albicans для исследования в будущем. Семь типовых штаммов новых видов дрожжей (Cyberlindnera dauci, Leucosporidium egoroviorum, Metschnikowia taurica, Papiliotrema horticola, Vishniacozyma phoenicis, Yamadazyma cocois и Zygotorulaspora dagestanica), описания которых были выполнены в рамках проекта РНФ, переданы в крупные иностранные коллекции CBS (Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Нидерланды), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Германия), VTCC (Vietnam Type Culture Collection, Вьетнам), а также в две специализированные коллекции – ВКПМ (Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», Москва) и VCIM (Vietnam Collection of Industrial Microorganisms, Вьетнам).