Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью настоящего проекта является установление общих механизмов формирования пор в липидном матриксе клеточных мембран, выявление ключевых факторов, регулирующих данный процесс, а также поиск агентов, способных контролируемо влиять на порообразование в липидных мембранах. Для достижения этой цели мы планировали объединить, экспериментально дополнить, и систематизировать фрагментированные данные, получаемые в различных экспериментальных системах, для установления универсального механизма формирования липидных пор под действием различных факторов: различных макромолекул, латерального натяжения, воздействия электрического поля. На данном этапе для достижения цели проекта нами были проведены работы в области теоретического исследования порообразования липидных мембран, экспериментального исследования стабильности липидных мембран различного состава, а также молекулярно-динамические расчёты для выяснения молекулярных деталей процесса порообразования. Нами была построена теоретическая модель процесса формирования поры в липидной мембране под воздействием амфипатических пептидов. Выяснены условия формирования пор, определена зависимость характеристик этого процесса от особенностей встраивания пептидов в монослой. Наши предварительные исследования показали, что деформации мембраны вокруг пептидов обуславливают их притяжение, при этом наиболее напряженная область расположена посередине между ними, являясь наиболее вероятной областью возникновения поры. Для изучения механизма порообразования мы рассмотрели детальную модель сквозной липид-белковой поры. Одним из ключевых параметров пептидов в рамках нашей модели является индуцируемый им наклон липидных молекул, который максимален при неглубоком внедрении пептида и значительной его ширине. Наклон минимален, если пептид внедряется на середину монослоя. Нами было обнаружено, что в системе существуют два равновесных состояния – целостный бислой с плоским пептидным кольцом на нём, и пора с пептидным кольцом в окрестности кромки, – разделённые энергетическим барьером. Энергетический барьер на переход от целостного бислоя к порированному снижается с увеличением наклона граничных липидов на кромке пептидного кольца, т.е. с увеличением ширины пептида и уменьшением глубины его внедрения. Однако, такая геометрия пептида увеличивает барьер на переход пептида из одного монослоя в другой – транслокацию пептидов, важный фактор для так называемых проникающих в клетку пептидов (cell penetrating peptides). Таким образом, подобные пептиды (широкие и неглубоко внедряющиеся в монослой) стабилизируют поры в мембране и являются более перспективными кандидатами для порообразующих агентов. Другим фактором, влияющим на порообразование в мембранах, является латеральное натяжение. Высокое натяжение ожидаемо приводит существенному понижению барьера на порообразование. Но при этом оно также повышает барьер на транслокацию пептидов через бислой, и приводит к аккумуляции пептидов на кромке поры, т.к. такая конфигурация имеет меньшую энергию. В свою очередь подобная аккумуляция может быть дополнительно стабилизировать долгоживущую пору, значительно повышая проницаемость мембраны. Кроме того, с помощью анализа молекулярно-динамических и экспериментальных данных, мы показали, что линейная теория упругости в приближении Хелфриха применима для расчета упругой энергии сильно деформированных мембран без введения членов более высокого порядка с дополнительными модулями упругости, но только при применении отдельно к каждому липидному монослою. Полученный результат позволяет использовать это приближение для описания порообразования на следующем этапе проекта. Нами также был исследован процесс образования пор в мембранах, содержащих миметики липидов архей с метилироваными углеводородными хвостами либо содержащие циклопентановые включения в углеводородных хвостах, а также в мембранах, содержащих низкомолекулярный растворитель декан. Измерены линейное натяжение кромки поры, энергетический барьер к её формированию, а также кинетические характеристики процесса порообразования. Было показано, что липиды-миметики мембран архей образуют значительно более стабильные бислои, при этом их стабильность достигается за счёт кинетических характеристик, но не термодинамическим линейным натяжением. Последнее до сих пор считалось одним из основных параметров, характеризующих устойчивость мембраны к образованию пор – оно определяет высоту энергетического барьера перехода поры к пороговым значениям радиуса и разрыва мембраны. Однако, анализ экспериментальных результатов показал, что в ряде случаев фактором, ответственным за стабильность мембран выступает именно кинетические характеристики роста и возникновения непроводящих зародышей пор. Наличие растворителя в мембране приводит к кратному снижению линейного натяжения кромки поры. Более того, наличие растворителя приводит к выравниванию линейных натяжений пор в мембранах разных составов. И лишь кинетические характеристики порообразования существенно различаются для различных липидных смесей в присутствии низкомолекулярного растворителя, обуславливая их стабильность. Нами было показано, эффект низкомолекулярного растворителя в кратном понижении линейного натяжения кромки поры состоит в кратном снижении изгибной жесткости мембраны. Для получения более полной картины энергетики порообразования на следующем этапе проекта мы планируем провести молекулярно-динамическое моделирование пор в мембранах различного состава – POPC (основной компонент лецитина), DOPC, DPhPC и Di-O-PhPC, для измерения линейного натяжения пор а также его зависимости от радиуса пор. Для достижения этой цели на данном этапе нами был решён ряд подготовительных задач, направленных на создание адекватных физических моделей липидных бислоев, воспроизводящих условия в установке по регистрации пор в липидных мембранах. Для расчета линейного натяжения кромки поры были проведены предварительные молекулярно-динамические симуляции липидных бислоев состоящих из липидов DOPC, POPC, DPHPC, di-o-PHPC содержащие поры различного начального радиуса. Нами был разработан, апробирован и принят алгоритм сборки, уравновешивания стартовых конфигураций систем и измерения линейного натяжения кромки поры методами молекулярной динамики. В качестве тестовой системы нами были проведены расчёты для бислоя DOPC с радиусом начальной поры 3.5 нм. Построенные системы и разработанный алгоритм будет использован на следующем этапе для измерения линейного натяжения липидных пор в мембранах различного состава. Таким образом, нами были проведено комплексное исследование порообразования в липидных мембранах: построена модель порообразования в липид-белковых мембранах, экспериментально исследована стабильность липидных мембран различного состава, а также проведены молекулярно-динамические расчёты для выяснения молекулярных деталей процесса порообразования.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью настоящего проекта является установление общих механизмов формирования пор в липидном матриксе клеточных мембран, выявление ключевых факторов, регулирующих данный процесс, а также поиск агентов, способных контролируемо влиять на порообразование в липидных мембранах. Для достижения этой цели мы планировали объединить, экспериментально дополнить, и систематизировать фрагментированные данные, получаемые в различных экспериментальных системах, для установления универсального механизма формирования липидных пор под действием различных факторов: различных макромолекул, латерального натяжения, воздействия электрического поля. На данном этапе для достижения цели проекта нами были проведены работы в области теоретического исследования порообразования липидных мембран, экспериментального исследования стабильности липидных мембран различного состава, а также молекулярно-динамические расчёты для выяснения молекулярных деталей процесса порообразования и влияния на него небислойных компонентов. С целью исследования характеристик формирования пор неламеллярными липидными компонентами нами были проведены эксперименты по изучению порообразования, индуцированного амфипатическим пептидом слияния (ПС) вируса гриппа. По результатам нами были сформулированы молекулярные механизмы воздействия мембранных компонентов на устойчивость мембраны. Было показано, что поры, вызванные ПС, стабильны в масштабе времени, позволяющего уравновесить концентрации краски вне и внутри везикулы. Для учёта условий биологических мембран, содержащих значительное количество холестерина, мы изучили влияние этого липидного компонента на порообразование, индуцированное ПС. Было показано, что холестерин, как компонент с отрицательной спонтанной кривизной, уменьшает долю порированных везикул, но не сводит её к нулю. Также мы показали, что что ключевым фактором утечки является именно спонтанная кривизна монослоёв мембраны, а не специфическое взаимодействие холестерина с ПС. Кроме того, нами было показано что в масштабах времён эксперимента поры, индуцированные ПС, нестабильны, и через некоторое время закрываются. Таким образом, по результатам исследования мы продемонстрировали следующее: (i) ПС вируса гриппа является порообразующим компонентом; (ii) подобная активность пептидов локализована во времени, мембрана восстанавливает свои барьерные свойства через некоторое время после экспонирования в раствор ПС; (iii) важную роль в порообразующей активности ПС играет кластеризация этих компонентов; (iv) компоненты с отрицательной спонтанной кривизной повышают стабильность мембраны по отношению к порообразованию. С целью развития теории упругости липидных мембран для её применения к сильнодеформированным системам, мы вывели стабильный функционал упругой энергии, детально учтя условия деформации поперечного сдвига и его влияния на стабильность мембраны. Кроме этого, мы обобщили модель упругости мембраны, включив в рассмотрение деформацию растяжения-сжатия, и дали геометрическую интерпретацию членов, которые ранее были пропущены в классической модели. Мы проанализировали физические последствия новых вкладов в функционал для случая взаимодействия двух пептидов, опосредованного мембранными деформациями. Полученные результаты являются основой для более корректного теоретического описания мембранных процессов, особенно порообразования, сопряжённого с сильными деформациями монослоёв. Другим направлением исследования механизмов проницаемости модельных липидных мембран в данном проекте было изучение механизмов чрезвычайной стабильности мембран, состоящих из липидов экстремафильных организмов, архей. Нами были выделены факторы стабильности – как термодинамические, так и кинетические. Для этого мы разработали методику измерения энергии кромки поры с использованием молекулярной динамики, базирующуюся на схожей экспериментальной методике; а также улучшили ранее разработанную модель упругости для расчета энергии кромки поры и оценки стабильности мембраны. Мы показали, что она обеспечивается (i) главным образом чрезвычайно затрудненной подвижностью амфифильных молекул, составляющих мембрану и (ii) умеренно повышенной энергией кромки поры. Эти факторы обеспечиваются двумя ключевыми особенностями молекул болалипидов – боковыми метильными группами алкильных цепей и топологией молекул. Боковые метиловые группы уменьшают подвижность молекул и увеличивают линейное натяжение кромки поры в той же мере, как и для обычных липидов, содержащих метилированные алкильные цепи. Топология болалипидов, которые в два раза больше по сравнению с обычными липидами, затрудняет динамику молекул и вводит дополнительный энергетический штраф для липидов, расположенных на кромке поры, поскольку они имеют сильно изогнутые алкильные цепи. С целью учёта двухбарьерной зависимости энергии кромки поры от её радиуса и нами была построена новая кинетическая модель формирования пор в липидных мембранах. Полученное выражение позволяет с помощью методов электропорации исследовать тонкую структуру энергетических профилей порообразования. На следующем этапе проекта мы рассчитали линейное натяжение кромки липидной поры методами молекулярной динамики и сравнили его с результатами аналитических моделей. Для расчета линейного натяжения кромки поры были проведены продолжительные молекулярно-динамические симуляции липидных бислоев из липидов DOPC, POPC, DPHPC, di-o-PHPC содержащие поры различного изначального радиуса. По результатам серии моделирований вычислена энергия формирования кромки поры. Было показано, что липиды с метилированными алкильными цепями (DPhPC и Di-O-PhPC) имеют большее линейное натяжение, чем исследованные липиды эукариотических мембран (POPC и DOPC). Значительную роль в этом играет отрицательная спонтанная кривизна данных липидов. Помимо высокого линейного натяжения, наклон зависимости линейного натяжения от радиуса для DPhPC и D-O-PhPC круче чем у POPC и DOPC. Следовательно, значительно большее количество энергии необходимо для увеличения радиуса поры и преодоление барьера на разрыв для мембран, состоящих из разветвленных липидов. Это согласуется с экспериментальным наблюдением стабильности липидного бислоя, содержащего липиды с метилированными хвостами. Также методами электропорации и молекулярной динамики нами было исследовано влияние низкомолекулярного растворителя – декана – на характеристики порообразования в липидных мембранах. Было показано, что подобный растворитель понижает энергию кромки поры в липидных мембранах, а также поверхностное натяжение липидной мембраны, одновременно повышая равновесную удельную площадь липидов. Растворитель с более высокой молекулярной массой, сквалан, приводит к более высоким значениям линейного натяжения пор в мембранах. Таким образом, нами было проведено комплексное исследование порообразования в липидных мембранах: экспериментально исследовано влияние небислойных компонентов на стабильность липидных мембран и характеристики ансамбля пор в мембранах; проведены молекулярно-динамические расчёты для выяснения молекулярных деталей процесса порообразования; выяснены факторы определяющие стабильность модельных липидных мембран.