КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-74-00146

НазваниеГенные пути, вовлеченные в механизмы реализации устойчивости штамма Bifidobacterium longun GT15 к факторам иммунного ответа в условиях воспалительного процесса

РуководительКлимина Ксения Михайловна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства", г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словаBifidobacterium, пробиотические культуры, воспалительные заболевания кишечника, иммунный ответ, провоспалительные цитокины, высокопроизводительное секвенирование, анализ транскриптома, дифференциальная экспрессия генов

Код ГРНТИ34.19.23, 34.27.21, 34.27.23


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Кишечной микробиотой человека называется совокупность микроорганизмов, населяющих пищеварительный тракт. Большая часть микроорганизмов кишечной микробиоты вовлечена в комменсальные или мутуалистические отношения с организмом человека. Представители комменсальной микробиоты оказывают положительный эффект на здоровье человека и поддерживают нормальное функционирование организма хозяина. Среди анаэробных комменсальных микроорганизмов бифидобактерии являются наиболее ранними колонизаторами. Бифидобактерии обнаруживаются в значительном количестве у 2/3 младенцев в возрасте одной недели [1]. Являясь доминирующей компонентой микробиоты младенцев, бифидобактерии способствуют становлению иммунной системы человека на ранних этапах постнатального развития. В процессе дальнейшего онтогенеза численность бифидобактерий сокращается с 11% у детей в возрасте от 1 до 4 лет до 3% у взрослых [2]. Согласно литературным данным, среди бифидобактерий кишечной микробиоты наиболее представлен вид B. longum [3]. Комменсальные микроорганизмы в составе микробиоты, подобно патогенным, находятся под давлением факторов иммунного ответа организма хозяина. Более того, бифидобактерии обладают ярко выраженными иммуномодулирующими свойствами и способны инициировать воспалительный процесс в присутствии патогенов, стимулируя выработку как противовоспалительных, так и провоспалительных цитокинов и других факторов иммунного ответа [4, 5]. Воспалительные механизмы иммунной системы хозяина, направленные на элиминирование патогенных микроорганизмов, как правило, нацелены на консервативные молекулярные структуры, обнаруживаемые как у патогенов, так и у комменсалов, однако состав нормальной кишечной микробиоты может оставаться стабильным в течение многих лет, что демонстрирует высокую устойчивость микроорганизмов к факторам иммунной системы [6]. На сегодняшний день механизмы, обеспечивающие выживание бифидобактерий и других комменсалов в условиях воспалительного процесса и постоянство репертуара нормальной микробиоты кишечника, остаются малоизученными. В частности, в качестве механизма устойчивости комменсалов к факторам иммунного ответа предполагается модификация липополисахаридов, что повышает резистентность к антимикробным пептидам у представителей типа Bacteroidetes [7]. Среди актинобактерий повышенная резистентность к антимикробным пептидам была показана только для Collinsella aerofaciens [7]. В свою очередь, механизмы устойчивости представителей рода Bifidobacterium к факторам иммунного ответа не изучались. В геномах бифидобактерий отсутствуют ортологи гена, который кодирует предполагаемую ассоциированную с мембраной фосфолипидфосфатазу BT1854 у B. thetaiotaomicron и участвует в реализации вышеупомянутого механизма устойчивости. Все это позволяет предполагать существование иных механизмов и генных путей, выполняющих данную функцию. Согласно литературным данным, некоторые бактерии, преимущественно патогены, способны связывать цитокины хозяина и отвечать формированием биопленок или изменением характеристик вирулентности, а также изменением скорости роста культуры [8]. В частности, экспериментально было показано, что патогенные микроорганизмы Staphylococcus aureus, Acinetobacter spp. и Pseudomonas aeruginosa демонстрируют увеличение роста в ответ на добавление в среду провоспалительных цитокинов TNFα, IL-1β, и IL-6 в различных концентрациях в модели воспаления in vitro [9]. Известные бактериальные цитокин-связывающие белки демонстрируют широкое структурно-функциональное разнообразие и принадлежат к различным семействам [8]. Чувствительность отдельных представителей патогенной микробиоты к факторам иммунного ответа указывает на возможность реализации сходных механизмов цитокиновой индукции у представителей комменсальной микробиоты. Ранее нами были обнаружен и охарактеризован кластер генов бифидобактерий, получивший название PFNA, который включает гены pkb2, fn3, aaa-atp, duf58 и tgm [10]. B структуре FNIII доменов белка, кодируемого геном fn3 кластера PFNA, аннотированы мотивы, характерные для цитокин-связывающего региона рецептора gp-130. Рецептор gp-130 связывает IL-6 и некоторые другие цитокины данного семейства. В пилотных исследованиях была также подтверждена способность FNIII доменов данного белка специфично связывать цитокин TNFα (данные не опубликованы). Мы предполагаем, что продукт гена fn3 может быть медиатором взаимодействия между иммунной системой организма хозяина и бифидобактериальными клетками, обеспечивая связывание цитокинов и участвуя в реализации сигнальных механизмов. Мы предлагаем новый подход для изучения механизмов устойчивости бифидобактерий к факторам иммунного ответа, основанный на применении современных методов, включающий высокопроизводительное секвенирование с последующим анализом транскриптома, поиском дифференциально экспрессирующихся генов и точек старта инициации транскрипции в условиях воздействия провоспалительных цитокинов по сравнению с нормальными условиями. Планируется определить эволюционно стабильные группы генов бифидобактерий, т. е. группы, характеризующиеся сходными филогенетическими профилями. Определение точек старта транскрипции даст возможность точно локализовать сайты посадки факторов транскрипции и на основе этого построить генные сети, вовлеченные в реализацию механизмов устойчивости с помощью экспериментальных и биоинформатических методов. Все это позволит предсказать возможные генные пути, участвующие в реализации механизмов устойчивости к иммунному ответу в условиях воспалительного процесса. На основе анализа экспрессионных данных планируется сделать вывод о транскрипционной активности генов-участников выявленных генных путей. Мы предполагаем изучить возможное влияние добавления в среду провоспалительных цитокинов IL-6 и TNFα в различных концентрациях на рост и экспрессию генов штамма B. longum GT15 и выявить механизмы, обеспечивающие коммуникацию с факторами иммунного ответа организма хозяина, а так же выживаемость бифидобактерий в условиях воспалительного процесса. Точное понимание механизмов, обеспечивающих адаптацию и выживаемость представителей комменсальной микробиоты к факторам иммунного ответа в условиях воспалительного процесса, позволит отбирать эффективные штаммы для целевого применения, в частности, разработки пробиотических лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний кишечника. Также это поможет вести разработку антимикробных агентов для лечения бактериальных инфекций с учетом данных о механизмах устойчивости комменсалов для обеспечения выживаемости нормальной кишечной микробиоты человека в процессе лечения. 1. Adlerberth, I., Strachan, D. P., Matricardi, P. M., Ahrne, S., Orfei, L., Aberg, N., Perkin, M. R., Tripodi, S., Hesselmar, B., Saalman, R., Coates, A. R., Bonanno, C. L., Panetta, V. and Wold, A. E. (2007). Gut microbiota and development of atopic eczema in 3 European birth cohorts. Journal of allergy and clinical immunology, 120(2), 343-350. 2. Ringel-Kulka, T., Cheng, J., Ringel, Y., Salojarvi, J., Carroll, I., Palva, A., de Vos, W. M. and Satokari, R. (2013). Intestinal microbiota in healthy US young children and adults—a high throughput microarray analysis. PLoS one, 8(5), e64315. 3. Turroni, F., Peano, C., Pass, D. A., Foroni, E., Severgnini, M., Claesson, M. J., Kerr, C., Hourihane, J., Murray, D., Fuligni, F., Gueimonde, M., Margolles, A., De Bellis, G., O'Toole, P. W., van Sinderen, D., Marchesi, J. R. and Ventura, M. (2012). Diversity of bifidobacteria within the infant gut microbiota. PloS one, 7(5), e36957. 4. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sanchez, B., and Margolles, A. (2017). Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in microbiology, 8, 2345. 5. Аверина, О. В., Ермоленко, Е. И., Ратушный, А. Ю., Тарасова, Е. А., Борщев, Ю. Ю., Леонтьева, Г. Ф., Крамская, Т. А., Котылева, М. П., Даниленко, В. Н., Суворов, А. Н. (2015). Влияние пробиотиков на продукцию цитокинов в системах in vitro и in vivo. Медицинская иммунология, Т. 17, № 5, стр. 443-454. 6. Faith JJ, Guruge JL, Charbonneau M, Subramanian S, Seedorf H, Goodman AL, Clemente JC, Knight R, Heath AC, Leibel RL, Rosenbaum M, Gordon JI. (2013). The long-term stability of the human gut microbiota. Science, 341(6141), 1237439. 7. Cullen, T. W., Schofield, W. B., Barry, N. A., Putnam, E. E., Rundell, E. A., Trent, M. S., Degnan, P. H., Booth, C. J., Yu, H. and Goodman, A. L. (2015). Antimicrobial peptide resistance mediates resilience of prominent gut commensals during inflammation. Science, 347(6218), 170-175. 8. Högbom, M., & Ihalin, R. (2017). Functional and structural characteristics of bacterial proteins that bind host cytokines. Virulence, 8(8), 1592-1601. 9. Meduri, G. U., Kanangat, S., Stefan, J., Tolley, E., and Schaberg, D. (1999). Cytokines IL-1 β , IL-6, and TNF-α enhance in vitro growth of bacteria. American journal of respiratory and critical care medicine, 160(3), 961-967. 10. Nezametdinova, V. Z., Mavletova, D. A., Alekseeva, M. G., Chekalina, M. S., Zakharevich, N. V., and Danilenko, V. N. (2018). Species-specific serine-threonine protein kinase Pkb2 of Bifidobacterium longum subsp. longum: Genetic environment and substrate specificity. Anaerobe, 51, 26-35.

Ожидаемые результаты
В рамках проекта планируется изучить чувствительность культур штамма B. longun GT15 к присутствию в среде провоспалительных цитокинов IL-6 и TNFα, как предполагаемых индукторов механизмов устойчивости комменсальных микроорганизмов к факторам иммунного ответа в условиях воспалительного процесса. Будет изучено влияние IL-6 и TNFα в различных концентрациях на рост культуры бифидобактериального штамма B. longun GT15. Будет отработана методика RNA-Seq для грамположительных бактерий. Транскриптомный анализ позволит оценить экспрессию генов в условиях культивирования в среде с добавлением цитокинов по сравнению с культивированием в нормальных условиях и охарактеризовать обнаруженные дифференциально экспрессирующиеся гены. Изучение транскрипционной организации дифференциально экспрессирующихся генов позволит установить наличие или отсутствие оперонной структуры, точки старта транскрипции, изучить возможные регуляторные последовательности. Филогенетический профайлинг (представляющий собой бинарный вектор, отражающий паттерны эволюционных событий приобретения и потери генов, получение матрицы расстояний между филогенетическими профилями и кластеризация групп ортологов в программной среде R) генов штамма B. longun GT15 позволит определить эволюционно стабильные группы генов. На основе данных филогенетического профайлинга и транскриптомного анализа будет осуществлено предсказание генных путей штамма B. longum GT15, участвующих в формировании устойчивости к факторам иммунного ответа в условиях воспалительного процесса. Изучение генных путей, вовлеченных в реализацию новых механизмов устойчивости комменсалов, и особенно пробиотических микроорганизмов, к факторам занимаемой экологической ниши в организме хозяина представляет собой важную фундаментальную задачу. Научная значимость исследования включает также прикладные аспекты, которые заключаются в возможности отбора штаммов для дальнейшего целевого применения и создания пробиотических препаратов, направленных на лечение воспалительных заболеваний кишечника. В настоящий момент работ по изучению влияния на штаммы комменсальной микробиоты кишечника человека (в том числе бифидобактерий) и изменения экспрессии их генов нет. Результаты будут соответствовать мировому уровню исследований.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В результате эксперимента было обнаружено статистически значимое отличие в значениях оптической плотности культуры B. longum GT15 при добавлении цитокинов IL-6 в концентрации [100пг/мл] и TNFα в концентрации [10нг/мл] по сравнению с культивированием в контрольных условиях в логарифмической фазе роста и при переходе к стационарной фазе роста. Эксперимент проводили в 3-х биологических повторах. Таким образом, обнаружено транзиторное уменьшение и увеличение, соответственно, скорости роста бифидобактериальной культуры B. longum GT15 в условиях воздействия факторов иммунного ответа, а именно, провоспалительных цитокинов человека IL-6 и TNFα. Также на этом этапе были отобраны образцы культуры штамма B. longum GT15 на разных стадиях роста (лаг-фаза, экспоненциальная, стационарная) для дальнейшего составления каталога экспрессионных профелей культуры на разных стадиях роста. Отработаны методики приготовления библиотек для транскриптомного анализа методом RNA-Seq и поиска точек старта транскрипции. Анализ профилей культур после RNA-Seq показал, что образцы кластеризуются в группы по общему сходству их экспрессионных профилей. Первичный анализ показал, что экспрессионный профиль культуры B. longum GT15 после инкубации в присутствии IL6 мало отличается от контрольных условий, при этом экспрессионный профиль культуры B. longum GT15 после инкубации в присутствии TNFα имеет гораздо больше отличий.

 

Публикации

1. Чекалина М.С., Климина К.М., Даниленко В.Н. ИЗМЕНЕНИЕ ПРОФИЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ШТАММА BIFIDOBACTERIUM LONGUM GT15 В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ IL-6 И TNFΑ ActaNature, СПЕЦВЫПУСК том 2, c. 146 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Будучи постоянными обитателями нормальной микробиоты кишечника, бифидобактерии эволюционировали, чтобы приспособиться к иммунному ответу хозяина, приоритетом которого является уничтожение патогенных агентов. Механизмы, обеспечивающие выживание комменсалов во время воспаления и поддерживающие стабильность основного компонента нормальной микробиоты кишечника в таких условиях, остаются малоизученными. Мы предложили новый подход in vitro для изучения механизмов устойчивости к факторам иммунного ответа, основанный на высокопроизводительном секвенировании с последующим анализом транскриптома. Этот подход позволил нам выявить дифференциально экспрессируемые гены, связанные с воспалением. В данном исследовании мы продемонстрировали, что добавление провоспалительных цитокинов IL-6 и TNFα в среду роста штамма B.longum GT15 незначительно изменяет скорость роста последнего, но при этом влияет на экспрессию определенных генов. Мы определили эти гены и провели функциональный анализ (COG) и анализ метаболических путей (KEGG). С помощью филогенетического профайлинга мы предсказали опероны, экспрессия которых запускается цитокинами TNFα и IL-6 in vitro. Сопоставив точки начала транскрипции с филогенетическим профайльнгом, мы экспериментально подтвердили предсказанные опероны. Таким образом, в данном исследовании мы предсказали гены, вовлеченные в предполагаемый сигнальный путь, лежащий в основе механизмов устойчивости бифидобактерий к воспалительным факторам. Поскольку бифидобактерии являются одним из основных компонентов кишечной микробиоты человека и обладают выраженными противовоспалительными свойствами, данное исследование имеет большое практическое и научное значение. https://rscf.ru/news/release/issledovateli-vyyasnili-kak-kishechnye-bifidobakterii-zashchishchayutsya-pri-vospalitelnykh-reaktsiya/

 

Публикации

1. - Исследователи выяснили, как бифидобактерии «защищаются» при воспалениях у хозяина Газета, - (год публикации - ).

2. Веселовский В., Дьячкова М., Меняйло Е., Поляева П., Олехнович Е., Шитиков Е., Беспятых Д., Семашко Т., Касьянов А., Ильина Е., Даниленко В., Климина К. Gene Networks Underlying the Resistance of Bifidobacterium longum to Inflammatory Factors Frontiers In Immunology, 11:595877 (год публикации - 2020).

3. Климина К., Ворошилова В., Полуэктова Е., Веселовский В., Юнес Р., Ковтун А., Кудрявцева А., Касьянов А., Даниленко В. Toxin-Antitoxin Systems: A Tool for Taxonomic Analysis of Human Intestinal Microbiota Toxins, Toxins 2020, 12(6), 388; (год публикации - 2020).