КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-74-00124

НазваниеИзучение процессов адаптации и интерференции нативных CRISPR-Cas систем типа III бактерии Thermus thermophilus

РуководительАртамонова Дарья Николаевна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регионАвтономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаCRISPR-Cas системы, тип III, CSM, CMR, адаптация, интерференция, Cas1, бактериофаги, иммунитет бактерий, резистентность, термофильные бактерии

Код ГРНТИ34.15.23


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
CRISPR-Cas системы - системы адаптивного и наследуемого иммунитета прокариот, защищающие клетки бактерий и архей от вторжения вирусов и препятствующие проникновению плазмид. CRISPR-Cas системы состоят из CRISPR-кассет и сопряженных с ними cas генов. CRISPR-кассеты - особое место в геноме, где идентичные участки - повторы - перемежаются с уникальными участками - спейсерами. Глобально механизм действия всех CRISPR-Cas систем можно разделить на 3 стадии: первая - адаптация - приобретение иммунологической памяти путем встраивания в CRISPR-кассету спейсеров - участков чужеродной ДНК, вторая - экспрессия и созревание в клетке всех компонентов систем, необходимых для защиты, третья - интерференция - специфическое узнавание и уничтожение “врага”. На сегодняшний день выделено 6 различных типов систем: с I по VI. Классификация проведена на основе белкового состава рибонуклеопротеиновых комплексов, так называемых эффекторных комплексов, обеспечивающих стадию интерференции. Уникальность CRISPR-Cas систем типа III заключается в том, что это единственный тип из всех ныне известных, для которого характерен транскрипционно-зависимый механизм действия, т.е. иммунность может обеспечиваться только в случае транскрипции мишени. Исключительно у систем типа III эффекторный комплекс обладает одновременно и РНКазной и ДНКазной активностью. Как следствие, механизм интерференции для CRISPR-Cas систем типа III наиболее сложный. Он включают в себя большое количество подстадий, тонко скоординированных друг с другом и требующих присутствия многих белковых компонентов, как в составе эффекторного комплекса, так и вне его. По сей день остается много открытых вопросов как относительно стадии адаптации, так и интерференции. Данный проект предполагает решение двух глобальных задач. Во-первых, в ходе проекта будет произведено исследование процесса адаптации в лабораторном штамме термофильной бактерии Thermus thermophilus Hb27, обладающей активными системами типа III, как в условиях заражения двумя разными бактериофагами, способными инфицировать данный штамм, так и в условиях трансформации клеток плазмидой. Эта задача является крайне актуальной, поскольку на сегодняшний день только одной лаборатории в мире удалось создать условия для наблюдения адаптации в бактериях (Marinomonas mediterranea), обладающих CRISPR-Cas системами типа III. При этом следует отметить, что M. mediterranea кодирует ключевой белок адаптации - Cas1 - слитый с доменом обратной транскриптазы, позволяющим приобретать спейсеры из РНК. В штамме Thermus thermophilus Hb27 обратная транскриптаза отсутствует, тем не менее полученные в нашей лаборатории предварительные данные показали, что адаптация систем типа III в T. thermophilus Hb27 возможна. Это свидетельствует о принципиально отличном механизме приобретения спейсеров. В рамках проекта будет проведено высокоэффективного секвенирование для анализа большой выборки приобретенных спейсеров в случае взаимодействия CRISPR-Cas систем с каждым из фагов и плазмидой. Кроме того методом гомологичной рекомбинации будут получены мутантные штаммы с делецией генов, предположительно необходимых для процесса адаптации, после чего эксперименты по детекции адаптации будут проведены на этих штаммах. Второй задачей является определение эффективности и особенностей процесса интерференции. Будет проведена проверка способности клеток, приобретших спейсер, противостоять инфекции соответствующим фагом либо трансформации плазмидой. Планируется сравнить эффективность защиты в случае приобретения спейсеров из различных регионов для каждого из фагов / плазмиды. Кроме того будет изучена деградация ДНК-мишени методами количественной ПЦР и проведено исследование деградации чужеродной ДНК с использованием высокоэффективного секвенирования. Актуальность этой задачи также высока, поскольку на данный момент мировым научным сообществом установлено, что эффекторный комплекс систем типа III обладает нуклеазной активностью в отношении однонитевой ДНК, однако детали процесса раскуса ДНК-мишени неизвестны.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения работ по проекту ожидается впервые в мире охарактеризовать детектируемую в лабораторных условиях адаптацию в бактериальной CRISPR-Cas системе типа III в клетках, кодирующих главный адаптационный белок Cas1 без домена обратной транскриптазы. Кроме того, на полученных в ходе адаптации устойчивых штаммах также впервые для систем типа III путем высокоэффективного секвенирования будет проведен анализ состояния ДНК-мишени в ходе стадии интерференции. Данные результаты принесут большее понимание в особенности функционирования CRISPR-Cas систем типа III, что не только интересно и важно само по себе, но и принесет практическую пользу в свете возможности применения эндогенных CRISPR-Cas систем для редактирования геномов и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов (несмотря на сложность и многокомпонентность CRISPR-Cas систем возможно их практическое применение для геномного редактирования и регуляции экспрессии генов непосредственно организмов, в геноме которых они закодированы).


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В первом отчетном периоде были исследованы особенности адаптации и интерференции CRISPR-Cas систем типа III в условиях заражения бактерий T. thermophilus сифовирусом phiFa. Были подобраны оптимальные условия для адаптации. С применением технологии высокоэффективного секвенирования охарактеризован пул спейсеров, приобретенных CRISPR-Cas кассетами типа III во время заражения фагом. Показано, что наблюдаемая неравномерность в распределении приобретенных спейсеров по геному фага - следствие контр-селекции и накопления в инфицированной культуре клеток со спейсерами, способными обеспечивать защиту, а не особенность механизма выбора спейсеров. Удалось изолировать семь штаммов, каждый из которых имел 1-2 новых спейсера в CRISPR-кассетах типа III, и каждый из этих штаммов был устойчив к phiFa. Был разработан метод внесения в клетки спейсеров с любыми желаемыми нуклеотидными последовательности путем введения плазмиды, несущей искусственную мини-кассету. Мы продемонстрировали, что резистентность к инфекции бактериофагом phiFa могут обеспечивать только спейсеры, произошедшие из того конца фагового генома, который первым проникает в клетку и с которого начинается экспрессия фазовых генов. Спейсеры, таргетирующие гены phiFa, относящиеся к "среднему" и "позднему" временным классам, не способны обеспечивать защиту. Нами было показано, что phiFa может избегать действия CRISPR-Cas системы типа III путем приобретения делеций в области протоспейсера и нарушения комплементарности спейсера и протоспейсера. Делеции в геномах так называемых "эскейпов" могут быть как протяженные длинной несколько сотен нуклеотидов, так и короткие. При таргетировании важных генов, таких как ген РНК полимеразы, для "эскейпов" типичны короткие делеции с длиной, кратной трем нуклеотидным парам, позволяющие сохранить правильную рамку считывания. Для исследования состояния фаговой ДНК в ходе инфекции клеток, устойчивых к phiFa за счет действия CRISPR-Cas систем типа III, тотальная ДНК, выделенная из зараженной культуры была проанализирована с применением высокоэффективного секвенирования. Не было обнаружено протяженных брешей, подобных тем, что характерны для действия CRISPR-Cas систем типа I, однако было установлено, что с течением инфекции не происходит накопления фаговой ДНК по сравнению с контролем.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Согласно плану, основная часть исследовательских работ в течение второго года проекта была посвящена изучению действия CRISPR-Cas систем типа III в условиях инфекции клеток бактериофагом phiKo. phiKo - второй из двух доступных лаборатории бактериофагов, способных инфицировать наш модельный организм - термофильную бактерию T. thermophilus HB27c. Этот фаг относится к семейству Tectiviridae, в то время как фаг phiFa, работы с которым проводились в первый год исследования, является представителем семейства Siphoviridae. Сравнительный анализ результатов, полученных при инфекции клеток phiFa и phiKo позволяет сделать выводы о том, что некоторые выявленные особенности CRISPR-Cas систем типа III обусловлены исключительно действием данной защитной системы, а некоторые, напротив, следствие влияния конкретного чужеродного агента. Так, мы показали, что 1) предпочтение использования определенных двух CRISPR кассет для встраивания новых спейсеров по всей видимости может быть объяснено взаимодействием Cas1 c лидерами различных кассет, 2) неравномерное распределение спейсеров по цепям ДНК - следствие отбора клеток с эффективными в интерференции спейсерами, а не действие каких-либо механизмов, позволяющих выбирать/втраивать в кассеты спейсеры в "правильном" направлении 3) CRISPR-Cas системы типа III работают не по принципу суицидальной гибели, а позволяют клетке пережить инфекцию. При этом было показано, что спейсеры, направленные на транскрипт фага, синтезируемый на любой стадии инфекции способен обеспечивать защиту, в отличие от phiFa. Мы предположили, что причина тому - различные механизмы проникновения фаговой ДНК в клетку. Помимо этих результатов в течение второго года были определены временные классы генов phiKo, и было показано, что белки Cas4 не влияют на адаптацию CRISPR-Cas систем типа III.

 

Публикации

1. - В Сколтехе узнали, как бактерии собирают «разведданные» о бактериофаге Naked Science, - (год публикации - ).

2. Артамонова Д., Карнеева К., Медведева С., Климук Е., Колесник М., Ясинская А., Самолыго А., Северинов К. Spacer acquisition by Type III CRISPR–Cas system during bacteriophage infection of Thermus thermophilus Nucleic Acids Research, - (год публикации - 2020).

3. Колесник М., Карнеева К., Артамонова Д., Северинов К. Type III CRISPR-Cas systems: the dissection of the most complex prokaryotic immune system Biochemistry (Moscow), - (год публикации - 2021).