КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 19-74-00119

НазваниеОпределение роли РНК-хеликазы DDX3 в процессе биосинтеза белка in vitro и in vivo

РуководительСергеева Ольга Владимировна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2019 - 06.2021

Конкурс№40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаРНК-хеликаза, трансляция, онкологические заболевания, инициация трансляции, 5'-НТО мРНК

Код ГРНТИ34.15.01

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
РНК хеликазы относятся к семейству высоко консервативных белков, использующих энергию гидролиза АТФ/ГТФ для дестабилизации структуры РНК, а также выполняют функцию шаперонов для РНК. РНК-хеликаза DDX3 является представителем высоко-консервативного семейства хеликаз, содержащих D-E-A-D аминокислотный мотив. DDX3 участвует в большом числе клеточных процессов: транскрипция, трансляция, регуляция клеточного цикла, апоптоз, врожденный иммунитет (Y. Ariumi, 2014). Отдельно стоит отметить различные роли DDX3 при развитии онкологических заболеваний. В случае гепатоклеточной карциномы и рака груди DDX3 является онкогеном, а при раке легких и кишечника - супрессором развития опухоли (G. Bol et al, 2015). На сегодняшний день роль хеликазы DDX3 досконально изучена в различных процессах метаболизма РНК, кроме трансляции. Пока функция DDX3 в трансляции остается открытым вопросом, предложено несколько противоречивых гипотез на основании различных экспериментальных данных. Во-первых, возможно участие DDX3 в кэп-зависимой инициации трансляции за счет взаимодействия с 5'-нетранслируемой областью (НТО) мРНК (M. Lai et al, 2010). В других работах, DDX3 фигурирует как репрессор кэп зависимой трансляции за счет связывания eIF4e фактора и активатор IRES опосредованной инициации трансляции (J. Shin et al, 2008). В условиях стресса хеликаза DDX3 накапливается в стресс-гранулах вместе с eIF4e и PABP1, замедляя таким образом процесс биосинтеза белка (S. Oh et al, 2016). Возможно гипотезы не противоречат друг другу, например, DDX3 образует неактивный комплекс с факторами трансляции, в том числе, eIF4e при образовании стресс-гранул, что приводит к ингибированию кэп-зависимой инициации трансляции (G. Shin et al, 2012). Цель данного проекта показать и сравнить функции DDX3 в процессе трансляции in vitro и in vivo. Для этого планируется использовать метод РНК-интерференции для подавления мРНК DDX3 в клетках гепатомы мыши Hepa1-6 и печени мыши линии C57BL/6. На клеточной линии нами были подобраны рабочие концентрации активных миРНК и было показано снижение количества белка DDX3 на четвертый день ингибирования до 5%. Адресная доставка миРНК в гепатоциты печени мыши будет осуществляться с помощью липидных наночастиц (Zatsepin et al, 2016). Эффективность ингибирования будет определяться методами количественного ПЦР, вестер-блота, а для определения изменений в метаболических процессах печени будут проведены биохимический анализ крови и гистологические исследования. Для изучения функции DDX3 в трансляции мы планируем использовать метод рибосомного профайлинга при подобранных условиях ингибирования синтеза DDX3 in vitro и in vivo. Далее будут проанализированы изменения транскриптома при нокдауне DDX3 in vitro и in vivo. Таким образом, в рамках проекта планируется впервые изучить функции хеликазы DDX3 в трансляции in vivo, что позволит разрешить противоречия гипотез о роли DDX3 в процессе трансляции. Понимание особенностей функционирования хеликазы DDX3 позволит уточнить условия ее применение в качестве терапевтической мишени при различных онкологических заболеваниях.

Ожидаемые результаты
Процесс биосинтеза белка необходим для жизнедеятельности клетки и контроль трансляции мРНК является одним из определяющих для регулирования экспрессии генов. Дерегуляция биосинтеза белка характерна для ряда генетических и большинства раковых заболеваний. РНК-хеликазы являются важными участниками многих клеточных процессов, поэтому сегодня активно изучаются в качестве потенциальных мишеней для терапии и диагностики. Более 15 лет назад были получены противовирусные препараты, ингибирующие хеликазы вируса простого герпеса - это открытие простимулировало изучение хеликаз в качестве мишеней для терапии. Однако пока наиболее успешными в клинических испытаниях являются ингибиторы ДНК хеликаз в качестве противовирусных препаратов: ASP2151, BILS 22BS и др (W. Shadrik et al, 2013). Первые ингибиторы хеликазы DDX3 показали эффективность для подавления вируса ВИЧ-1 (G. Maga et al, 2008). Увеличение экспрессии хеликазы DDX3 в различных видах рака позволяет рассматривать ее в качестве потенциальной мишени для терапии. В настоящий момент проводятся клинические испытания потенциального ингибитора DDX3 -трициклического аналога диимидазодиазепина RK-33 для терапии рака легких (G. Bol et al, 2015). В литературе опубликованы данные, доказывающие участие хеликазы DDX3 в инициации процесса трансляции, однако ее роль точно не установлена. В результате реализации данного проекта будет определена функция хеликазы DDX3 в процессе биосинтеза белка in vitro и in vivo. В качестве научного задела нами были определены условия ингибирования хеликазы методом РНК-интерференции в клеточной линии гепатомы мыши Hepa1-6, а именно оптимальная концентрация миРНК и время ингибирования. В подобранных условиях в рамках данного проекта будут определены клеточные процессы, в которые вовлечена хеликаза DDX3 с помощью анализа транскриптома клеточной линии с нокдауном DDX3. С использованием метода рибосомного профайлинга будет показано участие хеликазы DDX3 в процессе трансляции, проанализированы строение и свойства мРНК, изменяющих свою трансляционную активность. Для второй части работы in vivo также будут определены оптимальные условия ингибирования DDX3: подобрана доза миРНК и время ингибирования. В этих условиях также будут проанализированы биологические процессы, протекающие с участием DDX3, методом анализа транскриптомапри ингибировании мРНК DDX3 in vivo. И изучено участие хеликазы в процессе трансляции методом рибосомного профайлинга. Будут определены мРНК, меняющие трансляционную активность и проанализированы их структурные и функциональные особенности. Таким образом, в результате можно будет сделать несколько выводов: 1. наблюдается ли корреляция изменений транскриптома in vitro и in vivo, и какие различия; 2. будет определен набор мРНК, меняющих свою трансляционную активность in vitro и in vivo; 3. найдены отличия в процессе трансляции при ингибировании DDX3 in vitro и in vivo. Полученные данные позволят разрешить существующие на сегодняшний день в научном сообществе вопросы о роли хеликазы DDX3 в процессе биосинтеза белка, сравнить фенотипы от ингибирования хеликазы DDX3 в клеточной линии и печени мыши, сравнить изменения в процессе трансляции при ингибировании DDX3 in vitro и in vivo. Это в свою очередь поможет расширить возможности использования хеликазы DDX3 в качестве терапевтической мишени.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---