КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 19-74-00118

НазваниеВлияние топологии ДНК мишени на процесс CRISPR адаптации

РуководительМушарова Ольга Сергеевна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2019 - 06.2021

Конкурс№40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаCRISPR-Cas система, CRISPR адаптация, интерференция, мобильные генетические элементы, репликация ДНК

Код ГРНТИ13.15.00

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
CRISPR-Cas системы – уникальный пример адаптивного иммунитета прокариот, направленного против мобильных генетических элементов, прежде всего – вирусов-бактериофагов. В геномах бактерий CRISPR-Cas системы представлены CRISPR кассетами - короткими уникальными последовательностями спейсеров, разделенных идентичными CRISPR повторами, - и прилегающими к ним генами cas. Транскрипция CRISPR кассет и экспрессия cas генов обеспечивают эффективную защиту прокариотической клетки от чужеродной ДНК. Функционально CRISPR-Cas системы представлены двумя модулями: CRISPR интерференции и CRISPR адаптации. Распознавание мишени короткими крРНК в комплексе с эффекторными Cas белками приводит к ее деградации в ходе CRISPR интерференции. Белковый состав эффекторного комплекса значительно варьирует и служит критерием для классификации CRISPR-Cas систем. В системах класса 1 эффектор представлен мультисубъединичным комплексом, тогда как в системах класса 2 эффектором служит один белок. Процесс адаптации обеспечивается эволюционно консервативным Cas1-Cas2 комплексом. Этот комплекс присутствует в системах обоих классов и осуществляет встраивание новых спейсеров в кассету. CRISPR адаптация может проходить по наивному или праймированному сценарию. Наивная адаптация мало эффективна и осуществляется без участия интерференционного модуля. Для широко распространенных CRISPR-Cas систем типа I (класс 1) описан особый вид адаптации, в котором эффективность приобретения новых спейсеров стимулируется при наличии спейсера в составе CRISPR-кассеты, частично соответствующему протоспейсеру в чужеродной ДНК, и Cas белков, обеспечивающих интерференцию. Такое явление получило название праймированной адаптации. Праймированная адаптация высоко эффективна, направлена на приобретение новых спейсеров из чужеродной ДНК, узнаваемой «праймирующей» крРНК, и позволяет клетке быстро обновлять набор спейсеров в составе кассеты и, как следствие, осуществить специфический иммунный ответ на заражение мобильными генетическими элементами, которые сумели избежать интерференции за счет накопления мутаций в протоспейсере, узнаваемой исходной защитной крРНК. Интерес к изучению CRISPR-Cas систем продиктован не только использованием их в качестве наиболее эффективного на сегодняшний момент инструмента редактирования геномов, но также их очевидной роли в эволюции прокариот. Несмотря на функциональные различия, как для наивной, так и для праймированной адаптации показано, во-первых, избирательность в выборе спейсеров; во-вторых, преимущественное встраивание определенных фрагментов чужеродной ДНК - «горячих» точек адаптации. Встраивание спейсера, комплементарного последовательности в геноме клетки, приведет к неминуемой гибели в ходе аутоиммунного ответа. Поэтому большинство вновь приобретенных в процессе адаптации спейсеров соответствуют последовательности ДНК-мишени. Механизмы, определяющие эффективный выбор спейсеров в ходе CRISPR адаптации, остаются до конца не изученными. Известно, что адаптационный Cas1-Cas2 комплекс эффективно связывает суперскрученные молекулы ДНК. Однако к настоящему моменту не проводился масштабный анализ влияния топологии ДНК на процесс CRISPR адаптации. В настоящем проекте планируется изучить как влияет топология молекулы мишени - сверхспиральность ДНК, механизм репликации кольцевых плазмид, образование специфических фрагментов в ходе репликации плазмид - на процесс адаптации. Полученные результаты позволят установить механизмы, лежащие в основе CRISPR иммунитета, и могут быть использованы при характеристике новых CRISPR-Cas систем.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения предлагаемого проекта будут охарактеризованы свойства молекул ДНК-мишеней, определяющие предпочтительный выбор новых спейсеров в ходе CRISPR адаптации. Данные результаты будут не только иметь фундаментальную значимость для установления механизма создания защитных возможностей адаптивного иммунитета бактерий, но и могут быть использованы на практике для решения конкретных биотехнологических задач. В частности, реализация проекта поможет оценить влияние CRISPR-Cas систем на процессы поддержания стабильности генома и дать новые возможности для модификации или контроля копийности плазмидной ДНК в бактериальных клетках.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---