Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Возможность управления функциональным состоянием клеток-мишеней путем их воздействия на клеточные рецепторы в условиях магнитного поля в последнее время стало одним из наиболее перспективных направлений в регенеративной медицине. На клеточной мембране содержатся механочувствительные рецепторы, которые активируют сигнальные белки в клетке. Стимуляция мембранных механочувствительных рецепторов в зависимости от типа рецептора и величины поля способна стимулировать или подавлять клеточные функции – апоптоз, сокращение, дифференциацию, миграцию, пролиферацию, секрецию. Процесс механотрансдукции, в котором происходит преобразование механической энергии в биохимический сигнал, играет важную роль в развитии патологии у человека. Это обстоятельство обусловило интерес к способу управления клеткой путем воздействия на механочувствительные рецепторы. Можно предположить, что такие рецепторы могут стать мишенью для терапевтического воздействия. Уникальными инструментами для управления клеткой с помощью механотрансдукции стали магнитные наночастицы, преимуществом которых является дистанционное управление. Магнитная маркировка клеток магнитными наночастицами позволяет ими манипулировать, а также контролировать функции клеток путем приложения внешнего магнитного поля. Немаловажным фактором является то, что размеры магнитных наночастиц сопоставимы с размерами биологических молекул. При таком размере каждая частица обладает одним магнитным доменом с суперпарамагнитными свойствами по сравнению с более крупными магнитными частицами, которые имеют множественные ферромагнитные домены с постоянными магнитными свойствами. Сила, которую внешнее магнитное поле оказывает на частицу, может варьировать от 10 пиконьютонов до 10 наноньютонов. Силы такого порядка сопоставимы с силами, которые клетки испытывают in vivo. Переменное магнитное поле способно вызывать колебания магнитных наночастиц и этот процесс лег в основу сравнительно нового метода магнитодинамического дистанционного управления клетками. Магнитомеханическая регуляция функциональным состоянием клеток с помощью функционализированных узнающими лигандами магнитных наночастиц – перспективная технология регенерации поврежденных тканей. Поэтому в последнее время магнитные наночастицы начинают успешно применять в тканевой инженерии. Работа в данной области была стимулирована исследованиями, показавшими, что меченые магнитными наночастицами стволовые эндотелиальные клетки, приводимые в движение магнитным полем, способны достигать места повреждения кровеносных сосудов и сердца и накапливаться в зоне повреждения, магнитомеханическая трансдукция с использованием магнитных частиц способна стимулировать пролиферацию, дифференцировку и миграцию стволовых клеток. Именно поэтому механотрансдукция является особо привлекательной в регенеративной медицине. Цель проекта – разработать технологию повышения эффективности процессов регенерации костной ткани путем дистанционного адресного управления функциональным состоянием мезенхимальнх стволовых клеток с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, специфичным рецептору интегрина. Задачи проекта: (1) получение первичной культуры остеобластов; (2) функционализация магнитных наночастиц пептидом RGD; (3) разработка методов дистанционного управления функцией остеобластов с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD; (4) исследование механизма действия магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, на остеобласты в условиях низкочастотного переменного магнитного поля. На первом этапе выполнения проекта выполнен обзор литературных источников, посвященных решаемым в проекте задачам; выбраны методы исследований; получены культуры остеобластов из костной ткани мышей ICR; подобраны и охарактеризованы 3 типа магнитных частиц, которые могут быть использованы для магнитомеханической трансдукции мезенхимальных стволовых клеток; на первичных культурах мезенхимальных стволовых клеток изучен механизм действия пептида RGD; функционализированы магнитные наночастицы пептидом RGD; подобраны параметры магнитного поля, способные стимулировать деление остеобластов. Для выделения мезенхимальных стволовых клеток был использован модифицированный протокол выделения клеток из костного мозга мышей. Для идентификации МСК использовали 2 параметра – способность адгезироваться к пластику при стандартных условиях культивирования и способность дифференцироваться в остеобласты. Направленную дифференцировку МСК в остеогенном направлении осуществляли путем добавления индукторов дифференцировки. Специфичность остеогенной дифференцировки подтверждали по накоплению минерализованных компонентов матрикса. Идентификацию кальциевых депозитов осуществляли путем гистохимического выявления солей кальция в культурах ализариновым красным S. Для криоконсерации первичных культур в качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид, который обеспечивал высокую жизнеспособность клеток и сохранял их морфофункциональные свойства. Для работ по магнитомеханической индукции регенерации костной ткани, т.е. дифференцировки МСК в остеобласты и остеоциты, были выбраны 3 типа магнитных частиц, отличающихся размерами и покрытием, которые могут быть функционализированы пептидом RGD. 1 тип магнитных наночастиц – ферроарабиногалактаны. Наночастицы на основе арабиногалактана были произведены в Иркутском институте химии имени Фаворского. Ультрадисперсные полимерные частицы гидратированного оксида железа имели высокую поверхностную энергию из-за их небольшого размера. Ферроарабиногалктан обладает магнитными свойствами благодаря «встроенным» нанодисперсным оксидам железа и проявляет ферромагнитное или ферримагнитное поведение. 2 тип магнитных наночастиц – наночастицы, полученные методом лазерной абляции и покрытые золотой оболочкой. Наночастицы Fe3O4, покрытые золотой оболочкой, были получены методом лазерной абляции отечественными разработчиками из Томского национального государственного университета с использованием композитных наноструктур. 3 тип – коммерческие микрочастицы, покрытые стрептавидином. Коммерческие магнитные микрочастицы, диаметр которых составляет 1-4 мкм, покрытые стрептавидином, MagnaBind (ThermoFisher Scientific). Все 3 типа магнитных частиц были использованы для связывания с трипептидом RGD. Для оценки связывания магнитных частиц с клетками, все частицы были предварительно модифицированы флуорофорами. Флуорофоры FAM были связаны с олигонуклеотидами, которые легко могут адсорбироваться на частицах с арабиногалактаном. Для связывания олигонуклеотидов, модифицированных флуорофорами с золотой поверхностью, использовались олигонуклеотиды, модифицированные с одной стороны тиоловыми группами (для связывания с золотой поверхностью) и FAM – с другой стороны. Для связывания с микрочастицами использовали биотинилированные олигонуклеотиды с флуорофором. Таким образом, происходило мечение всех магнитных частиц, которые можно наблюдать, используя флуоресцентный микроскоп. Трипептид RGD на поверхности магнитных частиц, меченных флуоресцентными метками, адсорбировался пассивно. Способность магнитных частиц, модифицированных пептидом RGD, связываться с мезенхимальными стволовыми клетками, была продемонстрирована с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Для исследования механизма действия RGD на мезенхимальные стволовые клетки без применения магнитных наночастиц была использована первичная культура клеток, выделенных из костного мозга мыши. Результаты исследований показали, что трипептид RGD (Arg-Gly-Asp) не влиял на жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток (доля нежизнеспособных клеток во всех образцах была одинаковой), но ускорял пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток. Для подбора параметров магнитного поля, способного осуществлять магнитомеханическую стимуляцию и дифференцировку, мезенхимальные стволовые клетки после 3-х недельного культивирования помещали в планшет для культивирования. Для подбора параметров магнитного поля, способного стимулировать деление клеток, была использована установка для генерации переменного магнитного поля, частота в ней была стабильна и составляла 50 Гц, в то время как напряженность магнитного поля была переменным параметром. Для подбора условий магнитомеханической стимуляции пролиферации и дифференцировки использовали напряженность магнитного поля величиной 50 Э и 100 Э. Планшеты помещали в переменное магнитное поле на 20 мин. Первый планшет подвергали воздействию магнитного поля напряженностью 50 Э, а второй – 100 Э. Процедура повторялась ежедневно в течение 5 дней. Через 7 дней определяли скорость пролиферации клеток (по количеству клеток в лунке) и уровень дифференцировки (по активности щелочной фосфатазы). Исследования показали, что при напряженности магнитного поля 50 Э скорость деления клеток практически не отличалась от скорости деления контрольных клеток, тогда как увеличение напряженности магнитного поля до 100 Э увеличило скорость пролиферации. Тем не менее дифференцировка клеток ускорялась в условиях действия переменного магнитного поля 50 Э и 100 Э. Стоит отметить, что присутствие магнитных наночастиц ускоряло скорость дифференцировки и в условиях отсутствия магнитного поля. Как показывают данные литературы, механизм ускорения деления и дифференцировки клеток с помощью функционализированных RGD магнитных частиц в условиях действия магнитного поля связан с прямой механической стимуляцией рецепторов интегрина магнитными частицами путем изменения внутриклеточной кальциевой и митоген-активированной протеинкиназной активности в остеобластах. Результатами проекта стали: (1) первичная культура остеобластов мышей; (2) охарактеризованные магнитные наночастицы, пригодные для магнитомеханического дистанционного управления, функционализированные пептидом RGD; (3) фундаментальные знания о механизмах действия магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, на остеобласты; (4) функцинализированные пептидом RGD магнитные наночастицы, пригодные для магнитомеханического дистанционного управления с помощью переменного магнитного поля. Все запланированные Соглашением о предоставлении субсидий исследования были проведены в полном объеме в соответствии с календарным планом.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Возможность управления функциональным состоянием клеток-мишеней путем их воздействия на клеточные рецепторы в условиях магнитного поля в последнее время стало одним из наиболее перспективных направлений в регенеративной медицине. На клеточной мембране содержатся механочувствительные рецепторы, которые активируют сигнальные белки в клетке. Можно предположить, что такие рецепторы могут стать мишенью для терапевтического воздействия. Уникальными инструментами для управления клеткой с помощью механотрансдукции стали магнитные наночастицы, преимуществом которых является дистанционное управление. Магнитная маркировка клеток магнитными наночастицами позволяет ими манипулировать, и, кроме того, контролировать функции клеток путем приложения внешнего магнитного поля. Цель проекта – разработать технологию повышения эффективности процессов регенерации костной ткани путем дистанционного адресного управления функциональным состоянием мезенхимальнх стволовых клеток с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, специфичным рецептору интегрина. Задачи 2-го этапа проекта: (1) экспериментальные исследования стимуляции остеогенной дифференцировки МСК с помощью функционализированных пептидом RGD магнитных наночастиц в переменном магнитном поле; (2) исследование регенерации костной ткани на модели in vivo с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD; (3) изучение распределения магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, в организме мыши с помощью ЯМР-томографии. В процессе выполнения проекта проведены экспериментальные исследования стимуляции остеогенной дифференцировки МСК с помощью функционализированных пептидом RGD магнитных наночастиц в переменном магнитном поле; исследована эффективность регенерации костной ткани на модели in vivo с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, методом магнитомеханической трансдукции в низкочастотном переменном магнитном поле; определено распределение магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, в организме мыши с помощью ЯМР-томографии. Исследования стимуляции остеогенной дифференцировки с помощью магнитомеханической трансдукции было проведено на мезенхимальных стволовых клетках (МСК), выделенных из костного мозга мышей. Остеогенную дифференцировку оценивали по накоплению минерализованных компонентов матрикса, которые определяли с помощью ализаринового красного S. Экспериментальные исследования стимуляции остеогенной дифференцировки МСК с помощью функционализированных пептидом RGD магнитных наночастиц в переменном магнитном поле показали, что сразу после магнитомеханической стимуляции в условиях переменного магнитного поля функционализированными пептидом RGD ферроарабиногалактанами, в клетках, подвергшихся магнитомеханической трансдукции, значительно возрос мембранный потенциал, уровень катионов кальция и содержание АФК. При исследовании регенерации костной ткани на модели in vivo с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, в качестве модели повреждения была использована модель дефекта костей свода черепа, обычно использующаяся при работе с грызунами, поскольку структура кости позволяет создать стандартизированный дефект. Для доказательства стимуляции регенерации костной ткани с помощью механотрансдукции было использовано 4 контрольных группы животных. Контрольным мышам группы №1 в место дефекта черепа вводили физиологический раствор. Контрольным мышам группы №2 вводили только наночастицы (FeАГ). Контрольным мышам контрольной группы №3 вводили функционализированные пептидом RGD частицы (FeАГ-RGD), но в магнитное поле не помещали. Контрольные мыши группы №4 помещались с периодичностью в одни сутки в переменное магнитное поле (50 Гц, 100 Э) на 10 мин. Исследование результатов магнитомеханической стимуляции регенерации костной ткани гистологическими методами показало, что в группе животных после лечения FeАГ, функционализированными пептидом RGD, дефект черепа был практически восстановлен уже через 7 дней, а после 9 дней магнитомеханической терапии дефект черепа у животных опытной группы был полностью восстановлены. При этом в группах контрольных животных восстановления дефекта черепа за это время не происходило. Недостатком использования трипептида RGD для функционализации ферроарабиногалактанов при регенерации костной ткани является его способность связываться с разными клетками, на мембране которых присутствуют рецепторы интегрина. Изучение распределения с помощью ЯМР-томографии функционализированных RGD ферроарабиногалактанов, введенных в хвостовую вену, показало, что магнитные наночастицы накапливались в печени, кишечнике, селезенке и почках. Следовательно, использование метода восстановительной регенерации с помощью функционализированных RGD ферроарабиногалактанов ограничено, поскольку магнитные наночастицы могут оказывать воздействие на любые клетки с неконтролируемым эффектом. Очевидно, что для предотвращения нежелательныех последствий необходимо функционализировать ферроарабиногалактаны молекулами, нацеленными на клетки-мишени. Наиболее подходящими для этой цели являются аптамеры, аффинные и специфичные МСК. Поэтому в качестве продолжения проекта планируется получение аптамеров, аффинных МСК человека, для адресного воздействия на эти клетки с целью их остеогенной дифференцировки при восстановительной регенерации костной ткани. Результаты 2-го этапа проекта: (1) фундаментальные знания о механизмах магнитомеханической стимуляции остеогенной дифференцировки МСК с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD, в переменном низкочастотном магнитном поле; (2) метод магнитомеханической стимуляции остеогенной дифференцировки с помощью магнитных наночастиц, функционализированных пептидом RGD; (3) фундаментальные знания о механизмах стимуляции регенерации костной ткани с помощью магнитомеханической трансдукции in vivo. Результаты, полученные в рамках проекта, являются новыми. Впервые получены покрытые арабиногалактаном суперпарамагнитные наночастицы, функционализированные пептидом RGD, способные стимулировать остеогенную дифференцировку МСК с помощью магнитомеханической трансдукции в низкочастотном переменном поле in vitro и in vivo. Уровень выполняемых работ соответствует мировому. Магнитные наночастицы, функционализированные пептидом RGD, позволяют дистанционно с помощью переменного магнитного поля управлять регенерацией костной ткани, что, как предполагается, значительно снизит срок восстановления костной ткани, поврежденной при травме, остеопорозе и других заболеваниях. Это позволит уменьшить продолжительность реабилитации пациентов, улучшит качество их жизни и снизит затраты на лечение. Все запланированные Соглашением о предоставлении субсидий исследования были проведены в полном объеме в соответствии с календарным планом.