КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-74-00096
НазваниеИсследование нового подхода коррекции метастатического потенциала рака поджелудочной железы, основанного на иммунизации к металлопротеиназе MT1-MMP
РуководительМитькин Никита Александрович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2019 - 06.2021 |
Конкурс№40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые словаМатриксные металлопротеиназы, рак поджелудочной железы, метастазирование, вакцина
Код ГРНТИ34.15.33
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Рак поджелудочной железы (РПЖ) занимает одно из лидирующих мест среди всех онкозаболеваний по неблагоприятному прогнозу выживаемости. Основным способом терапии первичной опухоли является ее хирургическое удаление, однако у 85% пациентов наблюдаются местные рецидивы в течение 3 лет после операции. Ранняя диагностика рецидивов затруднена, а существующие методы адъювантной химиотерапии демонстрируют крайне низкую эффективность. В таких условиях актуальной стратегией представляется замедление роста рецидивной опухоли и ее локализация, позволяющие сохранить ее в операбельном состоянии на момент обнаружения. В качестве перспективных мишеней для медикаментозной терапии РПЖ в настоящий момент рассматривают матриксные металлопротеиназы (MMP), экспрессия которых повышена в клетках РПЖ, что ассоциировано с усилением способности опухоли к пролиферации, инвазии и миграции. Основной проблемой использования ингибиторов и терапевтических антител к MMP является тот факт, что свою максимальную эффективность они демонстрируют в узком временном промежутке на ранних бессимптомных стадиях заболевания.
Данная проблема может быть решена методом активной иммунизации к собственным MMP на стадии обнаружения первичной опухоли – терапевтический эффект могут оказывать специфичные антитела, продукция которых возобновлялась бы при появлении рецидивов. В рамках текущего проекта будет исследована возможность длительного подавления активности металлопротеиназы MT1-MMP/MMP-14 в РПЖ с использованием подхода активной иммунизации. Будет подобран оптимальный способ иммунизации лабораторных животных (пептидный антиген или плазмида, кодирующая антиген), протестирована ингибирующая активность полученных антисывороток в отношении MT1-MMP и их кросс-специфичность к другим MMP, изучено их влияние на инвазию клеток линии РПЖ in vitro, а также произведено тестирование эффективности активной иммунизации к MT1-MMP/MMP-14 на прогрессию и метастазирование рака поджелудочной железы в мышиной модели.
В перспективе, результаты, полученные в ходе исследования, могут положить начало разработке препарата для терапии РПЖ, а предлагаемый нами подход ляжет в основу целого ряда других противоопухолевых таргетных препаратов, требующих пролонгированного действия.
Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будут получены следующие результаты:
1) Будет подобран оптимальный метод иммунизации мышей линии C57BL/6 к собственному белку MT1-MMP/MMP14 (в виде пептидной вакцины или ДНК плазмиды), позволяющий достичь наибольшего титра MT1-MMP-специфичных антител в сыворотке.
2) Будет произведен отбор антисывороток, наиболее эффективно подавляющих ферментативную активность MT1-MMP при отсутствии влияния на MMP-9. Данная характеристика является принципиальной в связи с тем, что MMP-9 в настоящий момент расценивается как нежелательная мишень антираковой терапии.
3) Способность отобранных антисывороток подавлять инвазию клеток рака поджелудочной железы будут показаны в in vitro метастатической системе с использованием мышиной линии клеток РПЖ.
4) Будет изучено влияние антисывороток на активности MMP-2 и TGF-β в кондиционной среде и лизатах клеток модельной линии, что позволит оценить их дополнительные антираковые свойства, связанные с подавлением способности MT1-MMP к протеолитической активации ряда опухолевых модуляторов.
5) Функциональное исследование влияния активной иммунизации к MT1-MMP на прогрессию трансплантированной опухоли поджелудочной железы будет произведено в аллографтной мышиной модели РПЖ (PANC-02- C57BL/6). Проведение данного эксперимента в двух вариациях (трансплантация до и после иммунизации) позволит оценить эффект иммунизации на прогрессию как уже существующей опухоли (модель терапии первичной опухоли), так и вновь индуцированной (модель предупреждения развития рецидивов).
6) Наличие в эксперименте групп животных, получающих, помимо иммунизации, агент гемцитабин, позволит сделать выводы о влиянии длительного подавления MT1-MMP на восприимчивость к химиотерапии.
7) Сравнение показателей роста и развития первичной опухоли между группами иммунизированных животных и животных, получающих MT-MMP1-ингибирующее антитело, позволит выявить отличия в терапевтических эффектах между иммунизацией и использованием ингибиторов.
8) С моделью прогрессии опухоли будут также сопоставлены уровни активности MT-MMP1, MMP-2, MMP-9 и TGF-β в поджелудочной железе, что позволит сделать определенные выводы о влиянии данных белков на рост и метастазирование опухоли, а также подтвердить их роль в качестве прямых или непрямых мишеней иммунизации.
Таким образом, на in vivo модели будет изучен подход иммунизации к MT1-MMP, который в перспективе может лечь в основу нового антиракового препарата с пролонгированным действием. При этом различные in vitro эксперименты, запланированные в ходе реализации проекта, позволят не только выявить специфические механизмы, но и исследовать дополнительные функциональные противоопухолевые эффекты иммунизации.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Активная иммунизация мышей линии C57BL/6 к собственному белку металлопротеазе MT1-MMP с использованием разных типов антигенов - пептидных фрагментов MT1-MMP (конъюгированных с белком-носителем KLH и вводимых вместе с адъювантом на основе гидроксида алюминия) и плазмидных ДНК-вакцин, кодирующих эти пептидные фрагменты – позволила получить антисыворотки, содержащие высокие титры антител к мышиному белку MT1-MMP, также демонстрирующие кросс-специфичность к человеческому MT1-MMP. Были определены сыворотки, содержащие наибольшие титры специфичных антител. На 30 сутки после старта иммунизации уровни антител не зависели от типа вакцины: пептидный фрагмент и плазмида, кодирующая этот же пептидный фрагмент, давали схожие титры.
Все антисыворотки продемонстрировали ингибирующее действие в отношении специфической ферментативной активности MT1-MMP, а степень этого эффекта была пропорциональна уровням антител. Сыворотки, полученные при иммунизации животных с использованием ДНК-плазмид, кодирующих полный каталитический домен MT1-MMP или его крупный фрагмент, обладали также ингибирующей активностью в отношении MMP-9, что является нежелательным эффектом с точки зрения терапии РПЖ. В результате, для дальнейших исследований были выбраны 2 наиболее перспективные сыворотки (полученные в результате использования в качестве антигена короткого пептидного фрагмента MT1-MMP или кодирующей этот фрагмент плазмиды), продемонстрировавшие наилучшую ингибирующую активность в отношении MT1-MMP и не обладающие аффинностью к MMP-9. Мы показали, что обе отобранные антисыворотки обладают выраженной функциональной активностью, которая выражается в способности подавлять инвазию клеток линии РПЖ мыши PANC-02 в in vitro метастатической системе. В дополнение к этому было показано, обе антисыворотки значимо снижают как активность MMP-2 в среде, так и содержание в ней активной формы TGF-β. Данный факт является дополнительным подтверждением ингибирующей активности полученных антисывороток в отношении процессов, играющих ключевую роль в метастазировании клеток РПЖ.
Таким образом, в результате текущего отчетного периода мы подобрали оптимальный антиген для активной иммунизации к MT1-MMP, позволяющий получать высокий титр высокоспецифичных антител в сыворотке, обладающих ингибирующей активностью по отношению к процессам, играющим ключевую роль в прогрессии и метастазировании РПЖ. В качестве отдельного положительного результата стоит считать вывод о том, что для подобной иммунизации можно использовать не только пептидный фрагмент, но и кодирующую его плазмиду.
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В результате выполнения работ в текущем отчетном периоде мы создали аллографтную ортотропная мышиную модель рака поджелудочной железы (PANC-02-C57BL/6), а также провели иммунизацию экспериментальных животных ранее отобранной плазмидой, кодирующей фрагмент белка MT1-MMP, в двух режимах: до трансплантации опухоли и после. Для трансплантации были использованы полученные с помощью лентивирусной трансдукции клетки PANC-02-GFP, стабильно экспрессирующие GFP, с целью облегчения визуализации метастазировавших клеток в печени и селезенке.
В обеих экспериментальных группах иммунизация привела к продукции высоких титров MT1-MMP-специфичных антител, детектировавшихся на 22 сутки после трансплантации. Режим иммунизации не повлиял на уровни антител в сыворотке, что свидетельствует о сохранении титров в течение как минимум 23 дней после завершения иммунизации.
Взвешивание образцов опухолей на 22 сутки после трансплантации показало, что формирование опухоли произошло во всех экспериментальных группах, а иммунизация или введение антител LEM-2/15 не оказали влияние на формирование первичной опухоли.
В результате оценки характера образования метастазов в печени и селезенке методом проточной цитофлуориметрииметрии мы показали, что как ежедневное введение блокирующих антител LEM-2/15 в течение всех 22 суток после трансплантации, так и превентивная иммунизация плазмидой привели к статистически достоверному снижению уровней PANC-02-GFP в печени, а в селезенке данные клетки фактически не детектировались. При этом эффект иммунизации сопоставим с уровнем эффекта для LEM-2/15. Иммунизация после трансплантации опухоли не оказала достоверного влияния на метастазирование раковых клеток, что, по всей видимости, связано со слишком медленным формированием необходимых уровней MT1-MMP-специфичных антител.
В результате сравнительного анализа уровней активности MT1-MMP, MMP-2 и MMP-9, а также уровня представленности активного TGF-β в образцах тканей поджелудочной железы мышей разных экспериментальных групп мы показали, что как введение антител LEM-2/15, так и иммунизация в обоих режимах привели к снижению активности MT1-MMP, MMP-2 и содержания активной формы TGF-β1 в образцах опухолей, при этом не повлияв значимо на уровни активности MMP-9.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что превентивная иммунизация мышей плазмидой, кодирующей фрагмент MT1-MMP, приводит к продукции высокого и стабильного титра MT1-MMP-специфичных антител, способных ингибировать активность как самой MT1-MMP, так и других индукторов прогрессии РПЖ – MMP-2 и TGF- β1, что в итоге выражается в снижении метастатического потенциала клеток РПЖ в трансплантируемой сингенной модели PANC-02-C57BL/6. При этом иммунизация после трансплантации опухоли также приводит к продукции ингибирующих антител, но скорость образования антител, по всей видимости, не достаточна для предотвращения формирования метастазов на ранних этапах прогрессии опухоли.
В целом, превентивная активная иммунизация плазмидой, кодирующей фрагмент металлопротеиназы MT1-MMP, представляется перспективной стратегией подавления метатстатического потенциала РПЖ, что может способствовать борьбе с прогрессией рецидивных новообразований в первичном сайте опухоли на самой ранней стадии.
Публикации
1. Митькин Н.А., Устюгова А.С., Уварова А.Н., Румянцев К.А., Корнеев К.В., Павшинцев В.В. Сыворотки, полученные в результате активной иммунизации металлопротеиназой MT1-MMP, снижают метастатический потенциал клеток рака поджелудочной железы Молекулярная биология, - (год публикации - 2021)
2. Митькин Н.А., Горбачева А.М., Устюгова А.С., Уварова А.Н., Корнеев К.В., Павшинцев В.В. Antibody-based approach of MT1-MMP metalloprotease inhibition results in decreased invasive properties of pancreatic cancer cells Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 8, A713 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1136/jitc-2020-SITC2020.0713
Возможность практического использования результатов
В перспективе результаты исследования могут стать заделом для разработки лекарственного препарата для терапии рака поджелудочной железы.