Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За отчетный период было выявлено влияние среды хранения и культивирования на проявление литической активности L. capsici в отношении различных живых тест-объектов. Оптимальной для поддержания культуры и ее литических свойств является криозаморозка. Однако при хранении на средах LBs и PMA и последующего культивирования на различных средах было обнаружено перераспределение литической активности в отношении различных тест-культур. Результаты свидетельствуют об индукции синтеза различных агентов - антимикробных и антифунгальных. Это могут быть соединения разных классов: бактериолитические ферменты, антибиотики. Показано, что при культивировании бактерии на средах PYKM, SYM и KSP после хранения на LBs значения бактериолитической активности культуры имеют один порядок, при этом литический потенциал бактерии в отношении живых тест-объектов различается. При культивировании бактерии на PYKM такое литическое действие отсутствует полностью. При высоких значениях ЛЕ/мл на средах RM и LB литическое действие в отношении живых тест-объектов наблюдается только на среде RM. Максимальный спектр литической активности в отношении бактерий и грибов наблюдался на среде SYM (LBs среда хранения). Активность в отношении всех бактериальных тест-объектов проявлялась на средах SYM, KSP и RM (среда хранения LBs). При хранении на среде PMA и последующем культивировании на различных жидких питательных средах антимикробная активность постепенно утрачивалась. Полученные результаты важны при выборе условий культивирования с целью выделении антимикробных соединений, а также при изучении регуляции их синтеза. Были подобраны оптимальные условия для индукции синтеза литических агентов. В качестве индуктора были использованы живые клетки-мишени, которые добавляли в среду культививирования. Установлено, что оптимальной для индукции живыми клетками является минеральная среда. Показано, что при сокультивировании L. capsici с живыми клетками S. aureus 209P при 29 оС в течение 48 ч происходит увеличение общей бактериолитической активности культуры в 4 раза, измеренное турбидиметрическим методом с использованием живых клеток стафилококка. Спот-тест показал, что литический потенциал индуцированной культуры L. capsici усилился в отношении живых клеток M. luteus В 1819 (на 2.9±0.2 см2 площадь зоны лизиса больше), A. niger (на 1.4±0.4 см зона лизиса больше), F. solani (на 0.25±0.08 см зона лизиса больше) и S. sclerotiorum (на 0.29±0.15 см зона лизиса больше). Этот результат свидетельствует в пользу того, что живые клетки S. aureus 209P индуцируют синтез литических агентов (бактериолитические ферменты, антибиотики). При использовании в качестве индуктора живых клеток B. subtilis W-23 изменения общей бактериолитической активности L. capsici, не происходило. Однако методом спот-теста выявлено усиление литического действия в отношении A. niger (на 0.63±0.04 см зона лизиса больше), F. solani (на 0.75±0.03 см зона лизиса больше), S. sclerotiorum (на 0.71±0.10 см зона лизиса больше), B. subtilis W- 23 (на 0.42±0.15 см2 площадь зоны лизиса больше) по сравнению с не индуцированной культурой. Данный результат свидетельствует в пользу того, что B. subtilis W-23 индуцирует у L. capsici синтез литических агентов. Тот же эффект наблюдался и в случае индукции грибными клетками F. solani и S. sclerotiorum. Поскольку при индукции L. capsici живым стафилококком наблюдался самый мощный литический ответ, этот вариант был выбран для транскриптомных исследований. Общая бактериальная РНК была выделена из индуцированных и контрольных клеток L. capsici в двух независимых повторах с помощью набора RNAqueous™ Total RNA Isolation Kit (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендацией фирмы-производителя с модификацией. Электрофоретичекий анализ в 4% ПААГ с 8М мочевиной, а также измерения на приборе NanoPhotometer P360 (IMLEN, Германия) показали, что были получены образцы интактной общей РНК, свободной от белковых загрязнений и ДНК. Была выделена геномная ДНК из L. capsici с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QiaGen, США) в соответствии с рекомендацией фирмы производителя. Образцы общей бактериальной РНК и геномной ДНК были переданы в Автономную некоммерческую образовательную организацию высшего образования «Сколковский институт науки и технологий». Сверх задач в рамках данного Проекта за первый год исследований были разработаны подходы для создания гомологичной экспрессионной системы для бактериолитических белков на основе Lysobacter. Был проведен скрининг плазмид, которые реплицируются (pBBR1-MCS5) и которые не реплицируются (pJQ200SK) в Lysobacter. Были отработаны условия электропорации на плазмиде pBBR1-MCS5 с помощью прибора MicroPulser (Bio-Rad, США). Химическая трансформация была не эффективна. Для редактирования генома Lysobacter, включая встраивание генов промотора или других регуляторных элементов, был отработан метод гомологичной рекомбинации. Для этого был выбран штамм Lysobacter sp. XL1, геном которого секвенирован и аннотирован; в качестве гена-мишени – ген alpB, продукт которого, бактериолитический фермент Л5, хорошо изученный в лаборатории исполнителей Проекта. Для введения мутации в ген alpB Lysobacter sp. XL1 была создана конструкция на основе суицидного вектора pJQ200SK в результате последовательного клонирования фланкирующих alpB последовательностей геномной ДНК по сайтам рестрикции SacI и SmaI (downstream fragment – 924 bp), а также по XhoI и SmaI (upstream fragment – 825 bp). Также была клонирована тетрациклиновая кассета для последующего маркирования делеции (1430 bp). В результате была получена рекомбинантная плазмида pJQ200SKΔalpB, которую вводили в Lysobacter sp. XL1 методом электропорации. Об интеграции плазмиды в геном Lysobacter sp. XL1 свидетельствовала устойчивость трансформантов к Gm, Tc и чувствительностью к сахарозе. Разрешение меродиплоидов проводили на модифицированной агаризованной среде LB с Tc и сахарозой. Длина ампликонов, полученных в ходе ПЦР отобранных клонов и плазмиды pJQ200SKΔalpB, составляет 3 177 п.о., что соответствует фрагменту ДНК, содержащему делеционный вариант гена alpB, в который был введен маркер устойчивости к Tc. Длина ампликона с геномной ДНК Lysobacter sp. XL1 соответствует полноразмерному гену alpB и составляет 2623 п.о. Секвенирование 3 177 bp ПЦР-продукта с использованием специфических праймеров показало, что в область между 209 bp и 1084 bp в гене alpB встроен ген маркера устойчивости к тетрациклину, остальные участки ПЦР-продукта соответствуют участкам ДНК Lysobacter sp. XL1. Таким образом, была успешно введена мутация в ген alpB. Этот результат свидетельствует в пользу того, что мы отработали метод для дальнейшего редактирования генома. Для создания экспрессионной системы на основе Lysobacter необходимо подобрать оптимальный промотор. Был выбран промотор groEL L. enzymogenes. В качестве маркерного гена использовали ген флюоресцирующего белка TurboGFP. Была сконструирована плазмида pBBR1-MCS5TurboGFP, в результате последовательного клонирования генов TurboGFP по сайтам рестрикции HindIII и BamHI; гена промотора groEL по сайтам рестрикции HindIII и KpnI; генов терминаторов Т1 и Т2 rrnB по сайтам рестрикции XbaI и BamHI. Подтверждение правильности конструкции было осуществлено посредством секвенирования на базе ЗАО Евроген. Рекомбинантная плазмида была введена в клетки L. capsici и L. enzymogenes методом электропорации. В результате были отобраны клоны L. capsici и L. enzymogenes на селективной модифицированной агаризованной LB среде с антибиотиком Gm. Исследование интенсивности флюоресценции клеток L. capsici и L. enzymogenes с плазмидой pBBR1-MCS5TurboGFP осуществлялось на спектрофлюориметре F5 (Molecular devices, США), которое показало, что клетки обладают в 21 и 24 раза большими значениями этого показателя по сравнению с контрольными клетками, не несущими плазмиду pBBR1-MCS5TurboGFP. Этот результат свидетельствует в пользу возможности использования промотора groEL для создания гомологичной системы экспрессии в Lysobacter.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В результате реализации Проекта за второй год были выполнены все запланированные задачи: 1. Было проведено секвенирование геномной ДНК L. capsici VKM B-2533T. Секвенирование библиотеки проводили на платформе Illumina NextSeq 500 (Illumina, США). Общий размер геномной сборки составляет 6196943 п.н. со средним G+C составом 66.9%. В результате аннотации было предсказано 5078 генов, кодирующих белки (1250 из которых кодируют белки с неустановленной функцией), 50 тРНК, 3 рРНК и 4 нкРНК. Для сравнительного анализа геномные последовательности представителей рода Lysobacter были получены из базы данных GenBank. В результате подсчета ANI со всеми представителями рода Lysobacter, доступными в базе данных GenBank, было выявлено 4 генома (L. capsici KNU-14, L. capsici X2-3, L. capsici 55, L. capsici AZ78), для которых расчетные значения выше порога отнесения к одному виду. В результате построения филогеномного дерева и поиска ортологических генов было выявлено, что L. capsici ВКМ В-2533Т наиболее близко кластеризуется и имеет наибольшее количество общих ортологических групп белок-кодирующих генов с L. enzymogenes ATCC 29487T и L. antibioticus ATCC 29479T. Данный результат особенно интересен, так как позволят выделить в общем филогеномном дереве типовых штаммов рода Lysobacter отдельную антимикробную кладу. Это связано с тем, что только преимущественно для видов L. capsici, L. enzymogenes и L. antibioticus была показана антимикробная активность. Дополнительно была проведена аннотация с использованием базы данных COG (Clusters of Orthologous Groups) с целью функциональной категоризации генов. Среди генов, кодирующих белки, 73.4% генов были отнесены к категориям COG. Полученная геномная сборка штамма L. capsici ВКМ В-2533Т была депонирована в международные базы данных DDBJ/ENA/GenBank под номером JACXXL000000000, сырые прочтения — под номером SRR12790239. 2. Было проведено секвенирование РНК штамма L. capsici VKM B-2533T, индуцированного S. aureus 209P, и L. capsici VKM B-2533T без индукции. Секвенирование осуществляли на секвенаторе Illumina NextSeq 500 (Illumina, США) с длиной прочтения 76 нуклеотидов. В ходе работы было получено количество прочтений, позволяющее провести подсчет дифференциальной экспрессии генов. Коэффициент корреляции Спирмена между биологическими повторами превышает 0.98. В целом, количество генов, уменьшивших свою экспрессию при добавлении индуктора, несколько выше, чем количество генов, увеличивших экспрессию. Значительная часть генов, изменивших уровень экспрессии, не относится к известным COG. Обращает на себя внимание более выраженное увеличение экспрессии генов (при добавлении индуктора), относящихся к группам «Defense mechanisms», «Extracellular structures» и «Signal transduction mechanisms», а также «Replication, recombination and repair», «Transcription» и «Translation, ribosomal structure and biogenesis». На основании данных транскриптомного анализа и результатов, полученных при культивировании L. capsici VKM B-2533T на разных средах, были выбраны гены, кодирующие следующие белки: сериновая протеаза (Serp) (MBD3938257.1) (COG: Posttranslational modification, protein turnover), бета-литическая протеаза (Blp) (MBD3936558.1) (COG: Cell wall/membrane/envelope biogenesis), альфа-литическая протеаза (Alp) (MBD3939114.1) (COG: Posttranslational modification, protein turnover), N-ацетилглюкозаминидаза (Nag) (MBD3936696.1) (COG: Carbohydrate transport and metabolism). Было проведено предсказание предполагаемых промоторных областей для четырех генов, кодирующих выбранные белки. Установлено, что каждый из этих генов находится под контролем индивидуального промотора. В дальнейшем планируется более детальное изучение промоторных областей, включая изучение транскрипционных факторов, для возможной регуляции генов интереса. 3. Была разработана схема-очистки выбранных белков-интереса, которая включала фракционирование культуральной жидкости L. capsici VKM B-2533T посредством добавления сульфата аммония, катионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. В результате были очищены до электрофоретически гомогенного состояния Blp с ММ 19 кДа, Alp с ММ 21 кДа, Nag с ММ 26 кДа и Serp с ММ 26 кДа, которые являются белками-интереса, а также смесь двух сериновых трипсиноподобных протеаз с ММ 29 кДа. Идентификация белков осуществлялась с помощью пептидного масс-фингерпринтинга на базе Института биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича. Все белки обладали бактериолитической активностью в отношении автоклавированных клеток S. aureus 209P, которая составила 30 345 ЛЕ/мг для Blp, 13 000 ЛЕ/мг для Alp, 55 ЛЕ/мг для Nag, 598 ЛЕ/мг для Serp, и 7 367 ЛЕ/мг для смеси двух сериновых трипсиноподобных протеаз. Таким образом, из культуральной жидкости L. capsici VKM B-2533T впервые выделены четыре бактериолитических белка в электрофоретически гомогенном виде: Serp, Blp, Alp, Nag. Идентичность выделенных белков с ранее очищенными из L. enzymogenes составляет: Serp идентична на 28.64% лизинспецифической протеазе (P15636.1), Blp – на 62% Blp (P27458.1), Alp – на 77.83% Alp (P00778.3), Nag не идентична ни одному из выделенных белков. Основываясь на двух критериях (показатель бактериолитической активности и % идентичности с уже выделенными белками) для дальнейшей работы были отобраны два белка – Blp и Serp. 4. Были охарактеризованы белки Blp и Serp. В качестве субстрата для определения оптимальных условий работы были использованы автоклавированные клетки S. aureus 209P. Blp (EC 3.4.24.32) согласно классификации базы данных протеаз MEROPS относится к семейству M23 (подсемейство M23A) клана MO. Было установлено, что для проявления бактериолитической активности оптимальными являются значения pH 9.0, концентрации буфера 5.0 мМ, температуры 50°С. Температура полуинактивации фермента составила 57 °С. Фермент стабилен при pH от 4 до 7 и от 10 до 11. Ингибиторный анализ показал, что помимо чувствительности к хелатирующим агентам, фермент обладает высокой чувствительностью к ингибиторам сериновых и цистеиновых протеаз, что не типично для металлопротеаз. Специфичность действия фермента определяли в отношении субстратов, характерных для протеаз. Методом спот-теста было показано, что Blp гидролизует гемоглобин, эластин, желатин, коллаген, азофибрин. Тип гидролизуемой связи определяли с использованием в качестве субстратов миоглобина, гемоглобина, овальбумина, овамукоида методом пептидного масс-фингерпринтинга. Blp гидролизует во всех субстратах связь Gly-X. В ряде субстратов фермент гидролизует также связи Ser-X, Lys-X, Ala-X, Val-X, Glu-X и Phe-X. Было изучено действие Blp в отношении живых клеток-мишеней. Показано, что фермент лизирует клетки метициллинрезистентного стафилококка с высокой эффективностью (МИК 2.85 мкг/мл). Наибольшая бактериолитическая активность фермента обнаружена в отношении M. luteus – 69500±6364 ЛЕ/мл. Фермент лизировал и другой вид этого рода M. roseus с активностью 25.0±4.2 ЛЕ/мл. Активность фермента в отношении живых клеток S. aureus 209P составила 270.0±2.8 ЛЕ/мл. В отношении B. subtilis W23 и E. coli K12 фермент был неактивен. Serp (EC 3.4.21.50) согласно классификации базы данных протеаз MEROPS относится к семейству S1 (подсемейство S1D) клана PA. Для Serp L. capsici VKM B-2533T установлено, что для проявления бактериолитической активности оптимальными являются значения pH 8.0, концентрации буфера 5.0 мМ, температуры 80°С. Также была установлена способность данного фермента гидролизовать азофибрин. 5. Была апробирована экспрессионная система на основе коммерческого штамма E. coli BL21(DE3)/pLysE. Гены blp (1059 п.о.) и serp (1323 п.о.) без сигнального пептида (определен с помощью программы SignalP 4.1 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) с тегом 6His на N-конце были амплифицированы с геномной ДНК L. capsici VKM B-2533T и клонированы в экспрессионный вектор pET19mod по сайтам рестрикции NdeI/BamHI. Рекомбинантные штаммы выращивали на жидкой среде LB с Amp и Cm при 37 оС. Индукция экспрессии генов blp и serp осуществлялась 1 мМ IPTG. В результате было выявлено, что весь белок концентрируется в осадке в виде телец включения. Низкая температура культивирования после индукции небольшой концентрацией ИПТГ (0.1 мМ), а также использование плазмиды pT-GroE, несущей ген шаперона GroEL, не способствовал повышению растворимости белка. Для ренатурации Blp была разработана схема: подобраны оптимальные компоненты буфера для рефолдинга; время ренатурации и способ активации белка. В результате был получен рекомбинантный белок Blp в электрофоретически гомогенном состоянии с удельной активностью 4 400 ЛЕ/мг. Удельная активность нативного белка составляет 45 000 ЛЕ/мг. Снижение активности рекомбинантного белка может быть обусловлено не совсем правильным фолдингом в процессе ренатурации, что является распространенной проблемой при рефолдинге. В целом, полученные результаты по экспрессионной системе на основе E. coli BL21(DE3)/pLysE показали необходимость разработки гомологичной системы экспрессии, которая оптимальна для столь «агрессивных» для других бактерий белков. 6. Была разработана экспрессионной системы на основе L. capsici VKM B-2533T для Blp и Serp. Было проведено исследование по проверке работы промоторов GroEL и модифицированного GroEL (увеличение расстояния от старт-кодона до области Шайна — Дальгарно посредством добавления нуклеотида A) (Wang et al., 2019) в L. capsici VKM B-2533T. В результате были получены два рекомбинантных штамма L. capsici gfp PGroEL(A), L. capsici gfp PGroEL. Сравнение интенсивности флюоресценции показало, что у штамма L. capsici gfp PGroEL(A) показатель выше в 58 раз по сравнению с L. capsici VKM B-2533T и в 2.7 раза по сравнению с L. capsici gfp PGroEL. В результате для конструирования экспрессионного вектора был выбран промотор GroEL(A). Полноразмерный ген blp (1161 п.о.) был клонирован в плазмиду PBBR1-MCS5gfp-PGroEL(A), в результате чего была получена плазмида PBBR1-MCS5blp-PGroEL(A). В результате электропорации L. capsici VKM B-2533T был отобран штамм L. capsici blp PGroEL(A). Была проведена работа по сравнительной оценке уровня экспресии blp L. capsici VKM B-2533T дикого типа и L. capsici blp PGroEL(A) методом RT-qPCR. В качестве референсного гена был использован ген gntR (SD 0.74, CV 3.8%). Относительный уровень экспрессии определяли с использованием сравнительного метода количественной оценки (E-ΔΔCp) на основе четырех независимых повторов для каждого образца с использованием L. capsici VKM B-2533T в качестве контрольного образца. В результате было выявлено, что уровень экспрессии blp у L. capsici blp PGroEL(A) в 261 раз выше по сравнению с L. capsici VKM B-2533T дикого типа. Таким образом, нам удалось значительно повысить уровень экспрессии гена blp в рекомбинантной системе. Белок Blp был очищен из культуральной жидкости L. capsici VKM B-2533T дикого типа, L. capsici blp PGroEL(A) по разработанной схеме. Удельные активности очищенных белков Blp равны и составляют порядка 40 000 ЛЕ/мг. Все остальные показатели (общая бактериолитическая активность, выход белка) выше у рекомбинантного штамма. В целом, из культуральной жидкости рекомбинантного штамма L. capsici blp PGroEL(A) было очищено Blp в 9.6 раза больше по сравнению с L. capsici VKM B-2533T дикого типа. Выход Blp в случае рекомбинантного штамма составляет 12.366 мг/л. Необходима дальнейшая доработка гомологичной системы экспрессии, т.к. уровень экспрессии гена значительно выше, чем клетка может секретировать во внеклеточное пространство. Ген serp с 6His на C-конце (1413 п.о.) был также клонирован в плазмиду PBBR1-MCS5gfp-PGroEL(A). В результате электропорации сконструированной плазмидой был отобран штамм L. capsici serp PGroEL(A). Очистка Serp производилась с использованием аффинной хроматографии на колонке His Trap FF 5 мл (GE Healthcare, США). В результате был получен электрофоретически гомогенный белок с удельной активностью 15 697 ЛЕ/мг. При этом нативный белок Serp обладал удельной активностью 27 268 ЛЕ/мг. Понижение активности может быть связано с влиянием тега 6His на C-конце. В целом, из культуральной жидкости рекомбинантного штамма L. capsici serp PGroEL(A) было очищено Serp в 10 раза больше по сравнению с L. capsici VKM B-2533T дикого типа. Таким образом, благодаря проведенной работе из культуральной жидкости L. capsici VKM B-2533T впервые выделены четыре бактериолитических белка в электрофоретически гомогенном виде: Serp (MBD3938257.1), Blp (MBD3936558.1), Alp (MBD3939114.1), Nag (MBD3936696.1). Два бактериолитических фермента: Blp и Serp, были частично охарактеризованы. Blp обладает мощной литической активность в отношении S. aureus 55 (MRSA). Разработаны основы для создания в будущем биотехнологически ценной гомологичной системы экспрессии для бактериолитических ферментов бактерий.