Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Исследование клеток и тканей в системах in vitro является попыткой воспроизвести очень сложные взаимодействия между различными типами клеток в многоклеточных организмах. Однослойные клеточные культуры с одним типом клеток не позволяют показать все возможные паракринные взаимодействия между различными типами клеток. Способность воспроизводить межклеточные взаимодействия и переход из одного функционального состояния в другое предоставляет исследователям модельные системы для изучения различных физиологических процессов и патологических состояний. В культуре с одним типом клеток уникальная трехмерная структура ткани теряется, в то время как в комбинированных культурах наличие прямых межклеточных контактов может влиять на функциональное состояние клеток, в связи с чем невозможно оценить только паракринное влияние клеток друг на друга. В таких культурах невозможно выделить отдельные популяции клеток и изучить их отдельно. В то же время разделение типов клеток в культуральном сосуде позволяет оценить только их паракринный эффект. Эти молекулярные взаимодействия могут определять клеточный метаболизм, что позволяет оценить влияние совместного культивирования на рост и физиологическое состояние одного или обоих типов клеток без маркировки клеточной популяции. Системы совместного культивирования клеток широко используются и способны воспроизводить условия межклеточных взаимодействий. В то же время основным недостатком этой системы является высокая цена и невозможность воспроизвести их самостоятельно в лаборатории. Кроме того, такие вкладыши создаются из материалов (поликарбонатов), которые не могут полностью копировать нативную адгезивную поверхность для клеток. В нашем исследовании мы получили системы совместного культивирования клеток из доступных реагентов непосредственно в лаборатории. Наш проект предлагает новую систему совместного культивирования клеток, основанную на левитации в магнитном поле в культуральной среде магнитной белковой мембраны с клетками. Разработанная система совместного культивирования клеток может быть изготовлена ​​в любой лаборатории из доступных реагентов и имеет низкую стоимость производства. Полученные мембраны очень тонкие, пластичные, хорошо зависают в магнитном поле в толще питательной среды. Поверхность таких мембран за счёт покрытия адгезивными веществами (фибронектин, коллаген и полилизин) способствует миграции и распластыванию клеток на поверхности. При этом клетки формируют монослой и при длительном культивировании на мембране способны формировать многослойные структуры. Благодаря белковой природе мембран, впервые показана возможность заливки в парафин и смолы для электронной микроскопии и последующее исследование срезов в световом и электронном микроскопах. С помощью этого можно оценить межклеточные контакты, взаимодействия клеток с мембраной и распределение антигенных маркёров в клетках. В то же время коммерческие аналоги систем сокультивирования клеток не предусматривают возможности получать срезы мембран. В исследовании показано, что нет принципиальных отличий между поверхностями пластика и белковой мембраны с адгезивными покрытиями для культивирования клеток на поверхности. Предлагаемая система культивирования клеток может быть изготовлена ​​в лабораторных условиях и представляет собой экономически выгодную альтернативу коммерчески доступным мембранным вставкам.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В нашем исследовании мы показали влияние ряда факторов роста на состояние клеточных линий фибробластов и эпителиальных клеток при совместном культивировании клеток с использованием наших сконструированных систем со-культивирования на основе мембран. Усовершенствована методика полимеризации мембран, которая позволяет избежать деформации мембраны. Для совместного культивирования клеток в магнитном поле была сконструирована энергонезависимая система на основе имеющихся в продаже постоянных магнитов NdFeB. Для масштабирования этого, помимо магнитного держателя для одной чашки Петри была предложена модель магнитного держателя для многолуночного планшета. В качестве альтернативы магнитной системы были разработаны пластиковые цилиндрические вставки, напечатанные на 3D-принтере. Белковая мембрана может быть вставлена между двумя цилиндрами и прилегать ко дну культуральной лунки. Было оценено влияние факторов роста (EGF, FGF-10, PDGF-D, TGFb‑1) на отдельные популяции клеток и во время совместного культивирования клеток. В качестве контроля использованы чистые (раздельно культивируемые) клеточные линии фибробластов и эпителиальных раковых клеток, их выращивали без дополнительных факторов роста. Для оценки паракринного взаимодействия различных клеточных типов (фибробластов и эпителиальных клеток A549) осуществлялся эксперимент с со-культивированием клеток без использования факторов роста с последующей оценкой фибробластов и эпителиальных клеток. Выделено 22 образца: культуры клеток A549 и HFF (интактные клетки, 4 GF для каждой линии клеток), совместное культивирование клеток A549 и HFF (интактные клетки, четыре разных GF и комбинация GF). Эффекты факторов роста определяли путем инкубации клеток в течение 4 дней в бессывороточной среде. Используя наши системы совместного культивирования, мы оценили влияние этих факторов на отдельные клеточные линии и их совместное культивирование. Среди всех факторов роста добавление FGF-10 к клеткам A549 вызвало самые драматические изменения, в результате чего профиль экспрессии генов виментина, фибронектина, Snail1 и Zeb1 увеличился. Менее выраженный эффект был для TGF-1 и EGF, что характерно для EMT. Однако наблюдается неоднозначный эффект FGF-10 и других факторов роста на экспрессию E-кадгерина: FGF-10 активирует его экспрессию, в то время как другие факторы подавляют. Вероятно, это может быть связано с участием FGF-10 в морфогенезе легочной ткани, из которой происходит эта клеточная линия. И все наблюдаемые изменения экспрессии генов под влиянием FGF-10 могут быть объяснены активацией сигнальных путей, вовлечённых в морфогенез лёгких. Во время совместного культивирования эпителиальные клетки A549 изменяют ответ на факторы роста. В большинстве образцов экспрессия фибронектина и виментина снижается и усиливается только при добавлении TGFb-1. Это особенно заметно при совместном культивировании клеток в отсутствие дополнительных факторов роста. Добавление экзогенных факторов поддерживает активацию клеток, а маркеры EMT (Snail1 и Zeb1) увеличиваются всеми факторами роста во время совместного культивирования клеток. Наибольшее влияние на индукцию Snail1 и Zeb1 оказало добавление TGFb-1 в культуральную среду. В то же время экспрессия Е-кадгерина снижалась во всех образцах под влиянием факторов роста и при совместном культивировании клеток. Межклеточные взаимодействия разных типов клеток привели к потере чувствительности к FGF-10 и усилению ответа на TGFb-1. Таким образом, во всех образцах во время совместного культивирования клеток отмечается инициация и прогрессирование экспрессии генов ЕМТ. Интересно, что совместное культивирование клеток без факторов роста подавляет процессы EMT и активации клеток, а уровень транскрипции маркеров снижается. Клетки, вероятно, секретируют растворимые факторы роста, которые определяют взаимное ингибирование ЕМТ. Добавление любых факторов роста к фибробластам вызывало активацию экспрессии α-SMA, FAP и FSP1. TGFb-1 оказывает наиболее выраженное влияние на усиление экспрессии α-SMA и немного подавляет экспрессию FSP1, что согласуется с его фиброгенными свойствами. Экспрессия FGF10 снижена во многих образцах; однако добавление самого FGF10 к культуральной среде усиливает его экспрессию, что указывает на наличие петли положительной обратной связи в фибробластах. При совместном культивировании эпителиальных клеток и фибробластов наблюдаются парадоксальные изменения профиля экспрессии генов. Экспрессия α-SMA заметно снижается, экспрессия FGF10 исчезает. При добавлении TGFb-1 уровень экспрессии FAP сохраняется относительно культуры фибробластов, в то время как FSP1 снижается. При совместном культивировании клеток без факторов роста и в присутствии EGF, FGF-10, PDGF-D наблюдается обратная картина: уровень экспрессии FAP снижается, но FSP1 сохраняется. Таким образом, влияние факторов роста на отдельные популяции клеток и совместное культивирование показало различную биологическую активность. Четко показано, что наличие разных типов клеток и межклеточной коммуникации полностью меняет реакцию на факторы роста. В нашей модельной системе для совместного культивирования с использованием эпителиальных и фибробластных клеток мы показали, что действие факторов роста изменяется во время межклеточного взаимодействия. Межклеточные паракринные взаимодействия могут иметь решающее значение для регулирования реакции на растворимые факторы роста. Одним из возможных механизмов изменения чувствительности клеток при сокультивировании к факторам роста является конкуренция рецепторов за добавленные молекулы факторов роста. Изменения, полученные в эксперименте, показывают важность контекста межклеточных взаимодействий. Кратковременное совместное культивирование нормальных фибробластов и опухолевых клеток привело к подавлению активности обоих типов клеток. Для изменения физиологии фибробластов на CAF-позитивный фенотип может потребоваться больше времени. Предложенные модели сокультивирования клеток позволяют изучать паракринное влияние на морфологическое и биохимическое состояние разделенных популяций клеток. Применение систем совместного культивирования разных типов клеток позволяет проанализировать общее влияние на физиологию клеток. Наша система совместного культивирования может быть использована для моделирования паракринных взаимодействий между разными типами клеток. Системы сокультивирования клеток могут быть произведены в любой лаборатории с использованием 3D-печати и доступных реагентов и представляют собой экономичную альтернативу коммерчески доступным мембранным вставкам.