Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Устойчивость патогенов к антибиотикам – одна из самых острых проблем современного здравоохранения. Для ее преодоления и предотвращения очень часто используется комбинированная терапия, в которой сочетаются средства разных классов действия. Однако появление штаммов с множественной лекарственной устойчивостью у многих патогенных бактерий вынуждает искать новые комбинации, основанные на новых механизмах. Недавно было обнаружено, что значительный вклад в гибель клеток бактерий, подвергающихся воздействию бактерицидных антибиотиков нескольких классов, вносит окислительный стресс. В связи с этим системы антиоксидантной защиты и репарации окислительных повреждений у бактерий в настоящее время рассматриваются как многообещающие мишени для повышения чувствительности к антибиотикам. Проект призван оценить функции одной из таких систем, GO-системы, ответственной за репарацию окислительных повреждений ДНК, из условно-патогенного микроорганизма Staphylococcus aureus, который служит одной из основных причин больничных инфекций и представляет значительную угрозу в связи с распространенностью антибиотикорезистентных штаммов во всем мире. GO-система входит в систему эксцизионной репарации оснований ДНК и необходима для корректной репарации 8-оксогуанина (oxoG) — одного из самых распространенных окислительных повреждений ДНК. Из-за способности oxoG образовывать неканоническую пару oxoG:A это основание высокомутагенно, а его репарация требует действия двух ферментов — Fpg, удаляющего oxoG из пар oxoG:C, и MutY, удаляющего A из пар oxoG:A для предотвращения мутаций. В отличие от хорошо изученной GO-системы E. coli, S. aureus имеет два гомолога белка Fpg, свойства которых не исследованы, равно как и свойства гомолога MutY. За отчетный период клонированы гены fpg1, fpg2 и mutY из S. aureus, получены штаммы для суперпродукции кодируемых ими белков, белки выделены в рекомбинантном виде. Показано, что белки SauFpg1 и SauFpg2 обладают очень похожими ферментативными свойствами. Оба фермента преимущественно удаляют из ДНК остатки 8-оксогуанина и несколько менее эффективно – окисленные пиримидиновые основания (5-гидроксиурацил, 5,6-дигидроурацил). Как SauFpg1, так и SauFpg2 преимущественно расщепляют ДНК, содержащую повреждения напротив C, и с наименьшей эффективностью – в случае повреждений напротив A. Оба фермента показывают максимальную эффективность при слабощелочных значениях pH (7,0–9,0) и концентрации NaCl 50–100 мМ. Показано, что фермент SauMutY по своей субстратной специфичности значительно отличается от ДНК-гликозилазы MutY из E. coli. В то время как последний преимущественно расщепляет ДНК, содержащую пары A:oxoG, и обладает на порядок более низкой активностью по отношению к парам A:G, фермент SauMutY расщепляет ДНК, содержащую пары A:G, и не обладает заметной активностью по отношению к парам A:oxoG. Таким образом, не исключено, что GO-система S. aureus функционирует иначе, чем система E. coli.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Устойчивость патогенов к антибиотикам – одна из самых острых проблем современного здравоохранения. Для ее преодоления и предотвращения очень часто используется комбинированная терапия, в которой сочетаются средства разных классов действия. Однако появление штаммов с множественной лекарственной устойчивостью у многих патогенных бактерий вынуждает искать новые комбинации, основанные на новых механизмах. Недавно было обнаружено, что значительный вклад в гибель клеток бактерий, подвергающихся воздействию бактерицидных антибиотиков нескольких классов, вносит окислительный стресс. В связи с этим системы антиоксидантной защиты и репарации окислительных повреждений у бактерий в настоящее время рассматриваются как многообещающие мишени для повышения чувствительности к антибиотикам. Проект призван оценить функции одной из таких систем, GO-системы, ответственной за репарацию окислительных повреждений ДНК, из условно-патогенного микроорганизма Staphylococcus aureus, который служит одной из основных причин больничных инфекций и представляет значительную угрозу в связи с распространенностью антибиотикорезистентных штаммов во всем мире. GO-система входит в систему эксцизионной репарации оснований ДНК и необходима для корректной репарации 8-оксогуанина (oxoG) — одного из самых распространенных окислительных повреждений ДНК. Из-за способности oxoG образовывать неканоническую пару oxoG:A это основание высокомутагенно, а его репарация требует действия двух ферментов — Fpg, удаляющего oxoG из пар oxoG:C, и MutY, удаляющего A из пар oxoG:A для предотвращения мутаций. В отличие от хорошо изученной GO-системы E. coli, в геномах разных штаммов и изолятов S. aureus обнаруживаются несколько гомологов белков Fpg и MutY, свойства которых не исследованы. За отчетный период была завершена биохимическая характеристика ферментов Fpg1, Fpg2 и MutY S. aureus (SauFpg1, SauFpg2 и SauMutY соответственно) и исследовано их действие при гетерологичной экспрессии в клетках E. coli, дефицитных по генам GO-системы. По данным стационарной ферментативной кинетики эффективность расщепления субстратов ферментами SauFpg1 и SauFpg2 падала в ряду апурин-апиримидиновый (АП-)сайт > oxoG > 5-гидроксиурацил > 5,6-дигидроурацил, что отличает гомологи Fpg из S. aureus от фермента Fpg из E. coli. Фермент SauMutY примерно с одинаковой эффективностью гидролизовал N-гликозидную связь в остатках 2’-дезоксиаденозина в парах A:G и A:oxoG, однако скорость высвобождения продукта реакции в первом случае была гораздо выше. Ферменты SauFpg1 и SauFpg2 расщепляют ДНК по механизму β,δ-элиминирования при наличии в ней поврежденных оснований и по механизму β-элиминирования при наличии АП-сайта. При этом в ходе реакции образуется ковалентный интермедиат – основание Шиффа. Фермент SauMutY не катализирует элиминирование, а лишь гидролиз N-гликозидной связи, но с невысокой эффективностью способен образовывать ковалентный интермедиат, возможно, имеющий сложноэфирную природу. Была исследована функциональность белков GO-системы S. aureus in vivo при экспрессии их генов в клетках E. coli. Экспрессия в штамме E. coli, дефицитном по собственным генам fpg и mutY, приводила к значительному снижению частоты спонтанных мутаций. Примечательно, что инактивация GO-системы в E. coli приводила к снижению чувствительности бактерий к хлорамфениколу, налидиксовой кислоте, ампициллину и канамицину – антибиотикам с разным механизмом действия. Эти результаты свидетельствуют в пользу модели сенсибилизации бактерий к действию антибиотиков при окислительном стрессе, вызываемой массированным окислением пула нуклеотидов, их включением в ДНК и летальности из-за разрыва хромосомы в местах включения. Гетерологичная экспрессия гена fpg1 S. aureus частично восстанавливала чувствительность к канамицину и налидиксовой кислоте. Нокаут гена fpg E. coli сопровождался повышением чувствительности бактерий к β-лактамным антибиотикам цефалоспоринового ряда – цефтриаксону и цефотаксиму, а гетерологичная экспрессия генов fpg1 и fpg2 S. aureus снижала чувствительность в нокаутных штаммах. Чувствительность возрастала еще больше при дополнительном окислительном стрессе, вызванном перекисью водорода. В совокупности полученные результаты говорят о перспективности фармакологического подавления активности фермента Fpg для сенсибилизации бактерий к действию цефалоспоринов, но не к действию аминогликозидов, хлорамфеникола, ингибиторов ДНК-гиразы и β-лактамов пенициллинового ряда.