КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-74-00045

НазваниеИзучение разнообразия зрительных пигментов (опсинов) эндемичных амфипод озера Байкал и поиск связи видоспецифичных особенностей зрения с экологией и окраской животных

РуководительДроздова Полина Борисовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Иркутский государственный университет", Иркутская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2019 - 06.2021

Конкурс№40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-105 - Эволюционная биология

Ключевые словаБайкал, амфиподы, эндемики, эволюция, опсины, окраска животных, каротиноиды, зрение, адаптивная радиация

Код ГРНТИ34.15.61

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Исследования окраски животных и связи между окраской, зрением и поведением — одно из актуальных и активно развивающихся направлений современной биологии. Особый интерес представляет разнообразие механизмов, используемых разными видами животных для достижения одной и той же цели — различения предметов. Восприятие света животными основано на сигнальном каскаде, который запускают белки опсины. Благодаря наличию разных опсинов, воспринимающих разные части оптического спектра, формируется цветовое зрение. Цветное зрение известно у всех основных групп членистоногих. Подробно изучены опсины пауков, насекомых и десятиногих раков и исследована необычная система зрения раков-богомолов, включающая у некоторых видов 12 опсинов, а также систему восприятия направления поляризации света. Тем не менее, опсины амфипод (Amphipoda, Crustacea), являющихся важным компонентом большинства континентальных водных экосистем, практически не изучены. Амфиподы оз. Байкал представляют особый интерес как чрезвычайно разнообразная группа близкородственных организмов, приспособленных к разным условиям обитания от литоральной зоны до глубины более полутора километров, однако механизм формирования этого разнообразия не всегда очевидно связан с приспособлением к условиям обитания. Одним из наиболее ярких аспектов этого разнообразия являются выраженные различия в цвете и рисунке окраски амфипод. Так, общая интенсивность окраски тела меняется в широком диапазоне от почти прозрачной или белой до кроваво-красной, тёмно-зелёной, сине-фиолетовой, голубой или оранжевой, а для некоторых видов известны внутривидовые морфы разных цветов. Тем не менее, молекулярные механизмы, обеспечивающие окраску байкальских амфипод, не изучены. Так, известен состав каротиноидов нескольких видов байкальских амфипод, обитающих на разных глубинах, однако белки, с которыми они связаны, не исследованы вовсе. Изучение особенностей зрительной системы и формирования окраски байкальских амфипод могут иметь большое значение для понимания механизмов видообразования, приведших к имеющемуся разнообразию. В частности, это позволит проверить гипотезы о том, могла ли окраска тела амфипод и их способность видеть в определённых световых диапазонах являться фактором естественного отбора: например, изменяя успешность охоты или, напротив, защищая от нападения хищника, а также служить фактором при выборе полового партнёра. В рамках предлагаемого проекта будет изучен репертуар опсинов и физиологические параметры зрительной системы нескольких видов амфипод, различающихся по окраске, глубине обитания и положению в пищевой сети, а также будет предпринята попытка установить механизм формирования их окраски (благодаря изучению белков, связывающих каротиноиды) и выявить связь между этими особенностями. В качестве объектов исследования будут использованы представители различных экологических и систематических групп байкальских амфипод: массовые бентические литоральные виды Eulimnogammarus verrucosus, E. cyaneus и E. vittatus, пелагический вид Macrohectopus branickii, глубоководные бентические виды Ommatogammarus albinus и O. flavus, а также палеарктический вид Gammarus lacustris для проведения сравнения с байкальскими амфиподами. Результаты изучения разнообразия опсинов и механизмов формирования окраски байкальских амфипод могут иметь широкий спект биотехнологического применения. В частности, в современной биомедицине большое внимание уделяется оптогенетике — технологиям генетической модификации клеток, использующим активируемые светом белки для изучения внутриклеточных сигнальных путей в мозге и управления ими. В процессе выполнения проекта могут быть обнаружены новые опсины, потенциально применимые в оптогенетике. Оптогенетические разработки на данный момент имеют большие перспективы применения в методиках лечения различных заболеваний нервной системы, в том числе болезни Альцгеймера. Кроме того, изучение пигментов каротиноидной природы и путей их биосинтеза имеет отдельную значимость для развития аквакультуры и пищевой промышленности. Применение разнообразных каротиноидов необходимо при выращивании рыб и ракообразных как для здоровья самих животных, так и для повышения качества получаемых из них продуктов питания. Кроме того, представители группы амфипод являются одним из наиболее перспективных тест-объектов для биомониторинга водоемов. Данные, полученные в ходе проекта, могут лечь в основу развития новых высотехнологичных способов мониторинга пресноводных экосистем, в том числе и озера Байкал, а также могут быть использованы для осуществления промышленного контроля чистоты агро- и аквахозяйств.

Ожидаемые результаты
В ходе предлагаемого проекта на примере байкальской эндемичной фауны будут получены принципиально новые данные, характеризующие возможности зрительной системы и механизм формирования окраски амфипод. Сравнение байкальских амфипод с Gammarus lacustris, ранее изученным G. minus и другими ракообразными позволит сделать общие заключения о работе исследуемых механизмов для амфипод как таксономической группы. Будут определены последовательности генов опсинов ряда байкальских видов амфипод и G. lacustris, а также предсказаны последовательности соответствующих белков. На основе этих, а также известных из литературы белковых последовательностей будет построено филогенетическое дерево и выдвинуты гипотезы об общих физиологических свойствах зрительной системы изучаемых видов амфипод. Будет определена чувствительность зрительной системы амфипод к разным диапазонам спектра: будут использованы полевые эксперименты (отлов и определение видового состава амфипод, концентрирующихся вблизи источника света с определённым светофильтром) и лабораторные эксперименты (определение реакции животных на направленное освещение глаз разными диапазонами видимого, ультрафиолетового и инфракрасного излучения). Помимо этого, будет получена информация о поглощении разных диапазонов видимого, ультрафиолетового и инфракрасного света покровами тела и глаз животных. На основе объединения данных о последовательностях генов опсинов, физиологической реакции амфипод на свет и характеристики поглощения их покровов будут выбраны наиболее интересные опсины (в первую очередь предположительно возбуждаемые дальним красным или инфракрасным светом) для продукции в гетерологичных системах. Гены выбранных опсинов будут амплифицированы с помощью специфичных праймеров, подобранных с использованием известных данных секвенирования транскриптомов, и клонированы в вектора для гетерологичной продукции белка в клетках бактерий, дрожжей или насекомых. Полученные конструкции в дальнейшем позволят подробно изучить спектр поглощения и другие физические свойства этих белков в мембране клеток или после выделения и оценить их применимость для оптогенетических технологий, в том числе для повышения дальности распространения оптического сигнала в глубоких тканях. Будут выявлены каротиноид-связывающие белки в гемолимфе животных разных цветовых морф внутри одного вида и изучено наследование окраски на примере вида E. cyaneus с контрастными цветовыми морфами. Эти данные будут объединены с результатами биоинформатического анализа транскриптомов с целью поиска ферментов метаболизма каротиноидов и литературными данными о содержании каротиноидов у разных видов байкальских эндемичных амфипод и позволят впервые охарактеризовать молекулярные механизмы формирования окраски у этих организмов. Изучение особенностей зрительной системы и формирования окраски байкальских амфипод могут иметь большое значение для понимания эволюционных механизмов, приведших к возникновению имеющегося разнообразия. Значимым практическим результатом работы станет то, что данные о разнообразии опсинов и механизмах формирования окраски байкальских амфипод могут быть применены в современных биомедицинских разработках, таких как оптогенетика. Эта область науки включает технологии генетической модификации клеток, использующие активируемые светом белки для отслеживания возбуждения нейронов в мозге и управления ими. Оптогенетические разработки на данный момент имеют большие перспективы применения в методиках лечения различных заболеваний нервной системы, в том числе болезни Альцгеймера. В процессе выполнения проекта будут обнаружены новые опсины, потенциально применимые в оптогенетике. Следует особо отметить, что исследование репертуара опсинов ярко окрашенных раков-богомолов (Crustacea: Stomatopoda) недавно позволило обнаружить опсины с чувствительностью к дальнему красному участку спектра. Поскольку дальний красный свет и инфракрасное излучение наиболее слабо поглощаются тканями человека, такие опсины могут быть особенно полезны для оптогенетических конструкций, и их поиск в ранее не изученных группах животных представляет особый интерес. Помимо этого, изучение каротиноидов, а также путей их биосинтеза и метаболизма, важно для развития сельского хозяйства и аквакультуры: достаточное количество каротиноидов необходимо при выращивании рыб и ракообразных как для здоровья самих животных, так и для пользы получаемых из них продуктов питания. Для человека показаны противораковые, антиоксидантные и другие полезные свойства каротиноидов. Каротиноиды положительно влияют на иммунную систему и общее физиологическое состояние ракообразных, в том числе амфипод. Таким образом, изучение окраски может быть важно для выращивания ракообразных в аквакультуре.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Амфиподы оз. Байкал представляют особый интерес как чрезвычайно разнообразная группа близкородственных организмов, обитающих в разных условиях от литоральной зоны до глубины более полутора километров. При этом морфологическое разнообразие не всегда очевидно связано с приспособлением к условиям обитания. Одним из наиболее ярких аспектов этого разнообразия являются выраженные различия в цвете и рисунке окраски амфипод, но молекулярные механизмы, обеспечивающие окраску байкальских амфипод, ранее не были изучены. С окраской животных неразрывно связано их зрение. Восприятие света животными основано на сигнальном каскаде, который запускают белки опсины. Благодаря наличию разных опсинов, воспринимающих разные части оптического спектра, формируется цветовое зрение, известное у всех основных групп членистоногих. Тем не менее, опсины амфипод изучены очень мало, а опсины гаммарид озера Байкал не были изучены вообще. В первый год проекта мы подробно изучили механизм формирования окраски байкальских амфипод на примере двух видов с внутривидовым разнообразием, Eulimnogammarus cyaneus и E. vittatus, а также нескольких других видов. В ходе проекта были впервые получены данные об оптических свойствах покровов амфипод с помощью гиперспектральной камеры: мы выявили, что покровы байкальских литоральных амфипод отражают дальний красный и инфракрасный свет. В результате проведённых экспериментов мы обнаружили, что окружающая среда (в первую очередь, вероятно, состав корма) вносит значительный вклад в формирование окраса. Кроме того, мы обнаружили, что общее содержание каротиноидов (основных пигментов, обеспечивающих окраску членистоногих) не определяет окрас животных, а репертуар ферментов биосинтеза каротиноидов у видов с разной интенсивностью окраски схож. Ранее у некоторых групп ракообразных, таких как омары и некоторые креветки, были обнаружены специфичные для ракообразных белки крустацианины, относящиеся к семейству липокалинов и образующие с каротиноидом астаксантином окрашенные в голубой цвет комплексы. Поиск таких белков у амфипод привёл нас к обнаружению белков, содержание которых существенно различалось у амфипод одного вида, но разного окраса. С помощью масс-спектрометрии мы определили, что эти белки не сходны с классическими крустацианинами декапод и не относятся к семейству липокалинов, но несколько сходны с феромон/одорант-связывающими белками. Последние связывают широкий круг гидрофобных молекул и в недавнее время привлекают большое внимание исследователей, открывающих новые функции этих белков. Таким образом, мы обнаружили белки, которые действуют подобно классическим крустацианинам, однако не похожи на них по последовательности. Мы предлагаем называть эти белки аналогами крустацианинов, а механизм их действия заслуживает более тщательного изучения. Также мы изучили реакцию амфипод на разные участки видимого диапазона света с помощью полевых экспериментов и наблюдали привлечение молоди разных видов, а также взрослых самок планктонного вида Macrohectopus branickii разными диапазонами видимой области спектра. Кроме того, мы оценили физиологические параметры зрительной системы нескольких видов литоральных амфипод и глубоководных амфипод в лаборатории и выявили выраженную реакцию избегания различных частей видимого диапазона световых лучей у вида E. cyaneus. В то же время, представители этого вида не реагировали на инфракрасное излучение. В совокупности эти данные позволяли сделать предварительный вывод о сходстве диапазона воспринимаемого света у байкальских амфипод с человеческим. Тем не менее, проведённый биоинформатический анализ репертуара опсинов убедительно показал, что ни один из 65 видов байкальских амфипод, для которых доступны транскриптомные данные, не обладает опсинами, относящимися к классу чувствительных к коротковолновому излучению, в то время как европейские представители сем. Gammaridae обладают большим разнообразием опсинов, включающим чувствительные как к длинноволновому, так и к коротковолновому излучению. Несоответствие результатов, полученных in vivo и in silico, приводит нас к вопросу о восприятии коротковолного излучения байкальскими амфиподами. Одной из возможностей является сдвиг диапазона поглощения опсинов, известный для некоторых членистоногих, однако это предположение требует дальнейшей проверки. Исследование проведено в соответствии с календарным планом. Часть данных направлена для публикации. Собраны некоторые образцы для исследования и получены данные для работы во второй год проекта.

Публикации

1. Дроздова П.Б., Саранчина А.Е., Моргунова М.М., Кизенко А.И., Лубяга Ю.А., Бадуев Б.К., Тимофеев М.А. The levels of putative carotenoid-binding proteins as the mechanism of color formation in two species of endemic Lake Baikal amphipods PeerJ, - (год публикации - 2020)

2. Саранчина А.Е., Дроздова П.Б., Моргунова М.М., Бадуев Б.К., Тимофеев М.А. Сравнительная характеристика формирования окраса эндемичных амфипод озера Байкал Eulimnogammarus cyaneus и E. vittatus СБОРНИК ТЕЗИСОВ 24-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», 307 (год публикации - 2020)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Ранее в рамках проекта мы обнаружили, что транскриптомы байкальских амфипод содержат опсины класса LWS и не содержат опсинов, принадлежащих к филогенетическому классу MWS. Причиной отсутствия MWS-опсинов в транскриптомах байкальских амфипод могла быть их крайне низкая экспрессия или полное отсутствие таковой. Был проведён подробный анализ данных об экспрессии генов и поиск опсинов в геномах с помощью как биоинформатических, так и лабораторных методов. Полученные результаты свидетельствуют в пользу отсутствия генов MWS-опсинов (потере соответствующего участка ДНК или существенном изменении его последовательности, препятствующем посадке праймеров). В течение второго года проекта мы дополнили полученные ранее данные о спектральной чувствительности глаз амфипод, а именно изучили реакцию избегания света у распространённого литорального вида Gmelinoides fasciatus, принадлежащего к древней кладе байкальских амфипод, и выяснили, что представители этого вида реагируют на свет в диапазоне от ультрафиолетового до красного, то есть по крайней мере от 380 до 600 нм. Эти данные косвенно свидетельствуют о наличии нескольких зрительных пигментов с разными спектрами поглощения, что полностью соответствует данным биоинформатического анализа, предсказывающего наличие у этого вида четырёх LWS-опсинов. Ранее мы высказывали гипотезу об отборе мутаций в генах LWS-опсинов, приводящих к изменению их спектров. Для проверки этой гипотезы мы изучили MWS-подобные замены в последовательностях LWS-опсинов байкальских амфипод. Действительно, мы обнаружили значительное число таких замен. Хотя этих данных недостаточно для уверенных выводов о спектральной чувствительности LWS-опсинов байкальских амфипод (необходимо непосредственное измерение), они очевидно показывают наличие потенциала для сдвига спектра поглощения. В продолжение этого исследования были впервые получены плазмидные вектора и гетерологичные системы для продукции опсинов, которые после подбора условий культивирования и сверхпродукции белка позволят оценивать спектр поглощения. Кроме того, в рамках проекта мы изучили возможность изменения окраса амфипод в течение жизни и вклад получаемых с пищей каротиноидов в формирование цвета. В рамках этой задачи был проведён ряд долгосрочных наблюдений и экспериментов и анализ животных из естественной популяции. В совокупности полученные данные говорят о том, что цвет E. cyaneus может существенно изменяться на протяжении жизни, а ни один из использованных кормов не позволяет полностью поддерживать характерный цвет представителей этого вида. Механизм формирования цвета у амфипод пока изучен очень слабо, и мы в предыдущей работе установили независимое происхождение каротиноид-связывающих белков у декапод и амфипод; вполне возможно, что каротиноиды, которые связывают крустацианины и амфицианины, тоже различаются. Для проверки этой гипотезы был проведён масс-спектрометрический анализ каротиноидов. Согласно предварительным данным, наиболее вероятным кандидатом на роль кофактора амфицианинов представляется 7,8-дидегидро-φ,φ-каротин (кофактором крустацианинов декапод является астаксантин). Получены гетерологичные системы для продукции амфицианинов для непосредственной проверки этой гипотезы и изучения функциональности этих белков.

Публикации

1. Дроздова П.Б., Кизенко А.И., Саранчина А.Е., Гурков А.Н., Фирулева М.М., Говорухина Е.Б., Тимофеев М.А. The diversity of opsins in Lake Baikal amphipods (Amphipoda: Gammaridae) BMC Ecology and Evolution, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1186/s12862-021-01806-9

2. Дроздова П.Б., Саранчина А.Е., Моргунова М.М., Кизенко А.И., Лубяга Ю.А., Бадуев Б.К., Тимофеев М.А. The level of putative carotenoid-binding proteins determines the body color in two species of endemic Lake Baikal amphipods PeerJ, 8:e9387 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.7717/peerj.9387

3. Саранчина А.Е., Дроздова П.Б., Мутин А.Д., Тимофеев М.А. Diet affects body color and energy metabolism in a Baikal endemic amphipod Eulimnogammarus cyaneus maintained in laboratory conditions Biological Communications, - (год публикации - 2021)

4. Дроздова П.Б., Долгих А.В., Назарова А.А., Лубяга Ю.А., Тимофеев М.А. Transcriptome-based analysis of lectins and carotenoid metabolism enzymes in amphipods of the Lake Baikal region Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2020) : The Twelfth International Multiconference (06–10 July 2020, Novosibirsk, Russia); Abstracts, с. 12-13 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.18699/BGRS/SB-2020-008

5. Дроздова П.Б., Кизенко А.И., Тимофеев М.А. PIA3, a pipeline for mining assemblies for opsin protein sequences FEBS Open Bio, - (год публикации - 2021)

6. Дроздова П.Б., Саранчина А.Е., Тимофеев М.А. Spectral sensitivity of the visual system of endemic Baikal amphipods Limnology and Freshwater Biology, Т. 4. С. 781-782 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.31951/2658-3518-2020-A-4-781

7. Саранчина A.E., Дроздова П.Б., Моргунова М.М., Бадуев Б.К., Тимофеев М.А. Факторы, влияющие на окраску эндемичного вида амфипод озера Байкал Eulimnogammarus cyaneus Гены и клетки, Т. XV, № 3, Приложение, с. 148 (год публикации - 2020)

8. - Proteomics goes outdoor: proteomics in marine and environmental sciences HUPO Human Proteome Organisation, - (год публикации - )

9. - Почему байкальские рачки разного цвета? Иркутские учёные нашли ответ Вести Иркутск, - (год публикации - )

10. - Пеструю окраску байкальским рачкам придают белки, которые у других отвечают за распознавание запахов Индикатор, - (год публикации - )

11. - От рачков к ярким биотехнологиям Официальный сайт Иркутского государственного университета, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Результаты, касающиеся особенностей поведения байкальских амфипод и влияния на них света, не только расширяют знания о физиологии этих уникальных эндемиков, но и актуальны в контексте проблемы светового загрязнения. Кроме того, в ходе проекта получены принципиально новые сведения о белках эндемичных байкальских амфипод. Обнаруженные белки могут найти применение в медицине, фармацевтике и разработке новых генетических технологий.