Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Грамотрицательные бактерии Serratia, часто выделяемые из дыхательных и мочевых путей, являются факультативными патогенами для хозяев с ослабленным иммунитетом (Grimont and Grimont 2006; Mahlen, 2011). Наиболее патогенными и наиболее изученными бактериями рода Serratia являются Serratia marcescens. Стойкие к стандартным методам стерилизации и дезинфекции S. marcescens становятся источником внутрибольничных инфекций, колонизируя больничные инструменты, такие как катетеры и эндоскопы. У человека S. marcescens вызывает широкий спектр инфекций: пневмонию, менингит, сепсис, инфекции мочевых путей, конъюнктивит и заражение раны (Hejazi, Falkiner, 1997). Впервые данные об инвазии бактерий рода Serratia были опубликованы Hertle и Schwarz в 2004 году, они сообщали об инвазивной активности бактерий Serratia marcescens. Для этих бактерий обнаружено два фактора вирулентности порообразующий токсин (гемолизин) ShlA, который вызывает инвазию и необходим для лизиса мембран клетки-хозяина (Hertle, Schwarz, 2004) и внеклеточная желатиназа серрализин, обладающая цитотоксическим эффектом (Marty et al., 2002). Исследования, проведенные в нашей лаборатории, впервые показали, что к инвазии в клетки эукариот способны также бактерии S. grimesii и S. proteamaculans, синтезирующие актин-специфические протеазы гримелизин (Bozhokina et al., 2008) и протеализин (Цаплина и др., 2009), соответственно. Эти протеазы ограниченно расщепляют актин в сайте Gly42-Val43 с образованием 36 кДа фрагмента. Такое расщепление приводит к обратимой потере способности актина к полимеризации. Трансформация плазмидой, несущей ген любой из этих протеаз, придает неинвазивным E.coli способность проникать в клетки эукариот (Bozhokina, Tsaplina et al., 2011). С помощью масс-спектрометрии мы показали, что бактериальными субстратами протеализина могут быть белки GroEL и OmpX. GroEL из S. proteamaculans на 95% гомологичен GroEL из E. coli. В первичной структуре GroEL из S. proteamaculans обнаружено 6 сайтов Gly-Val, характерных для расщепления протеализином. Все эти сайты есть в GroEL из E. coli. В бактериальной клетке GroEL представляет собой сложный олигомерный белковый комплекс, состоящий из 14­ти идентичных субъединиц. В этом комплексе специфические для протеализина сайты могут становиться недоступными для протеолиза. Для проверки чувствительности GroEL к протеализину, его олигомер GroEL14 инкубировали с протеализином в концентрации в 100 раз выше концентрации, достаточной для полного расщепления актина с образованием 36 кДа фрагмента. На нативных белках было показано, что GroEL не является субстратом протеализина. Ранее мы показали, что трансформация бактерий E. coli плазмидой, несущей ген OmpX S. protemaculans, вызывает увеличение адгезии бактерий на поверхность клеток эукариот в 3 раза. Кроме того, OmpX из бактериального экстракта расщепляется протеализином (Цаплина, 2018). В структуре OmpX из S.proteomaculans, заякоренного в мембране, только один сайт Gly40-Val41, характерный для расщепления протеализином, доступен для протеолиза. Этот сайт расположен в поверхностной петле и доступен для протеолиза внеклеточной протеазой. В норме протеализин не секретируется из бактерий, но это не может исключить его попадание во внеклеточную среду во время инкубации с эукариотическими клетками в результате разрушения бактерий. Было показано, что протеализин в культуральной среде не приводит ни к изменению интенсивность адгезии E.coli, синтезирующих OmpX, ни к изменению интенсивности инвазии S.proteamaculans дикого типа и S.proteamaculans с инактивированным геном протеализина. Таким образом, протеализин не может регулировать адгезию и инвазию путем расщепления и модификации свойств уже встроившегося в поверхностную мембрану OmpX. Протеализин – внутрибактериальная протеаза, поэтому он может воздействовать на OmpX внутри бактериальной клетки на стадии транспортировки и правильного сворачивания OmpX. Для определение роли протеализина в функционировании OmpX были получены E.coli, трансформировные плазмидой, несущей укороченный ген OmpX без 40 N-концевых аминокислот, и E.coli, трансформировные плазмидой, несущей ген полноразмерного OmpX и протеализина. Было показано, что в обоих штаммах бактерий накапливается укороченный белок OmpX с одинаковой подвижностью по электрофорезу. Эти данные подтверждают наше предположение о сайте расщепления OmpX протеализином. Кроме того, на дермальных фибробластах человека DF-2 и эпителиоподобных клетках карциномы печени человека M-НеLa было показано, что трансформация бактерии плазмидой, несущей ген укороченного OmpX или одновременно гены полноразмерного OmpX и протеализина, не приводит к усилению адгезии и появлению инвазивной активности у E.coli. Это указывает на то, OmpX теряет способность связываться с эукариотической клеткой в результате ограниченного расщепления протеализином. Интенсивность адгезии на поверхности клеток эукариот может зависеть от набора поверхностных рецепторов и белков внеклеточного матрикса, синтезируемых клеткой-хозяином. Для белков семейства OmpX показана способность связываться с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР) и фибронектином (Tsang et al., 2010; Wiedemann et al., 2016), который дальше связывается с интегринами, тем самым вызывая прикрепление бактерий к клеточной поверхности и захват клеткой-хозяином. Мы показали, что усиление адгезии E.coli в результате трансформации плазмидой, несущий ген OmpX из S.proteamaculans, может быть результатом связывания полноразмерного OmpX с фибронектином. Трансформация бактерий E.coli плазмидой, несущей ген OmpX, увеличивала адгезию бактерий к фибронектину. Дополнительно к запланированной работе было исследовано перераспределение поверхностных рецепторов клеток карциномы легкого человека A549 и карциномы шейки матки M-HeLa в ответ на бактериальное заражение. В работе были прослежены изменения локализации ЭФР, а также a5- и b1- субъединиц интегрина, образующих рецептор фибронектина, в эпителиальных клетках, зараженных бактериями S. proteamaculans. Оказалось, что в клетках M-HeLa в ответ на заражение происходит накопление a5- и b1-субъедениц интегрина на поверхности клетки-хозяина и интенсивное прикрепление бактерий в местах локализации a5-интегрина. В клетках А549 a5-субъединица не была выявлена, локализованная равномерно по периметру клетки b1-субъединица рецептора, в ответ на контакт с бактериальными клетками накапливалась в цитоплазме, а рецептор ЭФР в ответ на заражение образовывал гранулы в цитоплазме. Похожее перераспределение рецептора ЭФР происходит в ответ на связывание с ЭФР. Полученные результаты указывают на то, что инвазия бактерий S. proteamaculans в клетки эпителия разного происхождения проходит в результате взаимодействия с разными поверхностными рецепторами.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Грамотрицательные бактерии Serratia, часто выделяемые из дыхательных и мочевых путей, являются факультативными патогенами для хозяев с ослабленным иммунитетом (Grimont and Grimont 2006; Mahlen, 2011). Стойкие к стандартным методам стерилизации и дезинфекции Serratia становятся источником внутрибольничных инфекций, колонизируя больничные инструменты, такие как катетеры и эндоскопы. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, впервые показали, что к инвазии в клетки эукариот способны также бактерии S. proteamaculans, синтезирующие актин-специфическую протеазу протеализин (Цаплина и др., 2009). Эта протеаза ограниченно расщепляет актин в сайте Gly42-Val43 с образованием 36 кДа фрагмента. Такое расщепление приводит к обратимой потере способности актина к полимеризации. Трансформация плазмидой, несущей ген протеализина, придает неинвазивным E.coli способность проникать в клетки эукариот (Bozhokina, Tsaplina et al., 2011). Однако инактивация гена протеализина привела не к уменьшению интенсивности инвазии S. proteamaculans, а к её увеличению в два раза (Tsaplina et al., 2020). Причиной увеличения инвазии может служить накопление нерасщепленного поверхностного белка бактерий OmpX, который является субстратом протеализина (Tsaplina et al., 2020). Ранее мы показали, что трансформация бактерий E. coli плазмидой, несущей ген OmpX S. protemaculans, вызывает увеличение адгезии бактерий на поверхность клеток эукариот в 3 раза. Кроме того, OmpX из бактериального экстракта расщепляется протеализином (Цаплина, 2018). Интенсивность адгезии на поверхности клеток эукариот может зависеть от набора поверхностных рецепторов и белков внеклеточного матрикса, синтезируемых клеткой-хозяином. Для белков семейства OmpX показана способность связываться с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР) и фибронектином (Tsang et al., 2010; Wiedemann et al., 2016), который, связываясь с интегринами, вызывает прикрепление бактерий к клеточной поверхности и захват бактерии клеткой-хозяином. С помощью иммуно-флюоресцентного анализа было показано, что рецептор ЭФР в контрольных клетках локализован с актиновыми филаментами. Заражение бактериями S. protemaculans эпителиальных клеток карциномы легкого человека А549 приводит к образованию гранул похожих на эндосомы, возникающие при связывании рецептора с ЭФР (Цаплина, 2020). При заражении бактериями S. protemaculans в клетках карциномы шейки матки HeLa схожее перераспределение происходит только в отдельных клетках, а в фибробластах кожи DF-2 перераспределения рецептора ЭФР не происходит. После 2-3 часов совместной инкубации локализация бактерий с рецептором ЭФР не обнаруживается. Таким образом, данные конфокальной микроскопии позволяют предположить запуск сигнального каскада с участием рецептора ЭФР в эпителиальных раковых клетках зараженных бактериями S. protemaculans. С помощью конфокальной микроскопии было также показано, что в клетках HeLa в ответ на заражение происходит накопление β1- и α5-интегринов на поверхности клеток зараженных бактериями S. protemaculans. β1-интегрин равномерно покрывает поверхность зараженных клеток, а α5-интегрин образует локусы, в которых обнаруживается усиление адгезии бактерий S. protemaculans (Цаплина, 2020). В клетках А549 α5-интегрин не окрашивается, а β1-интегрин в ответ на заражение бактериями S. protemaculans накапливается в цитоплазме зараженных клеток (Цаплина, 2020). В контрольных клетках DF-2 интегрины локализованы в фокальных контактах, и заражение бактериями S. protemaculans делает структуру фокальных контактов аморфной, но не приводит к существенному перераспределению β1-, α5-интегринов. Заражение бактериями E.coli, трансформированными плазмидой несущей ген OmpX, приводит к схожему, но более слабому перераспределению рецепторов. Таким образом, заражение бактериями вызывает глобальное перераспределение рецепторов и перестройки актинового цитоскелета только в эпителиальных клетках. На первом этапе работы мы показали, что усиление адгезии E.coli в результате трансформации плазмидой, несущий ген OmpX из S.proteamaculans, может быть результатом связывания полноразмерного OmpX с фибронектином. Покрытие культуральной посуды фибронектином увеличивало адгезию бактерий E.coli трансформированных плазмидой, несущей ген OmpX. Однако покрытие фибронектином культуральной посуды не усиливало адгезию бактерий S.proteamaculans. Инактивация гена протелизина приводит к усилению бактериальной адгезии к пластику, однако покрытие культуральной посуды фибронектином не привело к дополнительному усилению адгезии, как и для бактерий дикого штамма. Таким образом, бактерии S.proteamaculans не взаимодействуют с фибронектином. С помощью количественного микробиологического метода было показано, что предварительная инкубация в растворе с фибронектином бактерий S. proteamaculans не влияет на интенсивность инвазии S. proteamaculans ни в клетки А549, ни в фибробласты DF-2, а интенсивность инвазии в клетки HeLa даже снижается в два раза. Предварительная инкубация с фибронектином бактерий S. proteamaculans с инактивированным геном протеализина приводила к такому же влиянию на интенсивность инвазии бактерий. Таким образом, фибронектин не участвует в инвазии бактерий S. proteamaculans в клетки эукариот. Эти данные мы подтвердили и с помощью siRNA против гена фибронектина. Обработка siRNA уменьшала экспрессию целевого гена, но не влияла на чувствительность клеток HeLa ни к бактериям S. proteamaculans, ни к бактериям S. proteamaculans с инактивированным геном протеализина. Однако как мы показали ранее заражение эпителиальных клеток бактериями S. proteamaculans приводила к существенному перераспределению как β1-интегрина, так и рецептора ЭФР. Обработка клеток HeLa siRNA против гена β1-интегрина уменьшила в два раза чувствительность клеток к заражению бактериями S. proteamaculans и бактериям S. proteamaculans с инактивированным геном протеализина. Таким образом, бактерии S. proteamaculans взаимодействуют с β1-интегрином напрямую, не используя фибронектин. В то же время обработка клеток HeLa siRNA против рецептора ЭФР уменьшала на 35% чувствительность клеток к инвазии. Совместно с результатами конфокальной микроскопии полученные данные позволяют предположить, что в инвазии S. proteamaculans ключевым является колоколизация рецептора ЭФР с β1-интегрином в мембранных рафтах на поверхности клеток HeLa и сигнальный каскад, запускаемый рецептором ЭФР. С помощью количественной ОТ-ПЦР было показано, что заражение клеток карциномы шейки матки HeLa бактериями S. proteamaculans приводит к увеличению экспрессии рецептора ЭФР и β1-интегрина в 2,5 раза и практически не влияет на экспрессию α5-интегрина и фибронектина. К такому же эффекту приводит заражение бактериями E.coli, синтезирующими OmpX, в отличие от заражения контрольными E.coli, которое не влияет на экспрессию проверенных генов зараженных клеток эукариот. Это позволяет предположить, что связывание OmpX с поверхностью клетки-хозяина служит сигналом к увеличению экспрессии рецепторов, участвующих в инвазии S. proteamaculans.