Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Транскрипция бактериальных, архейных и эукариотических ядерных генов осуществляется с помощью многосубъединичных ДНК-зависимых РНК-полимераз (РНКП), сложных молекулярных машин, имеющих общее эволюционное происхождение. В отличие от всех ранее охарактеризованных РНКП клеточных организмов, в невирионной РНКП (нвРНКП) фага AR9 отсутствуют универсально консервативные α субъединицы, необходимые для сборки фермента. Кроме того, а также в отличие от всех других клеточных РНКП, AR9 нвРНКП способна к промотор-специфической транскрипции однонитевой ДНК, что указывает на новую стратегию распознавания промотора этим ферментом. В отчетный период мы показали, что AR9 нвРНКП имеет новый механизм элонгации транскрипции: в отличие от других многосубъединичных РНКП, AR9 нвРНКП формирует длинный РНК/ДНК гибрид при промотор-специфической транскрипции как однонитевой ДНК, так и двунитевой ДНК; вытеснение РНК в раствор происходит при повторной транскрипции матрицы, которая содержит РНК/ДНК гибрид. Чтобы понять молекулярные механизмы работы нвРНКП AR9, мы работаем над определением структуры этого фермента. Для этого в отчётный период для AR9 нвРНКП холофермента связанного с промоторной ДНК с помощью метода криоэлектронной микроскопии была получена предварительная карта электронной плотности с разрешением 4.3 ангстрем. Дальнейшая работа с этими данными позволит определить структуру AR9 нвРНКП. Также в отчетный период были подобраны условия для формирования остановленного комплекса AR9 нвРНКП и клонирована AR9 нвРНКП со StrepII-тагом на субъединице, отвечающей за узнавание промотора. Полученные условия и плазмида понадобятся для изучения элонгации в следующий отчетный период. Также была клонирована многосубъединичная нвРНКП фага phiR1-37 и “гибридный” комплекс (кор AR9 нвРНКП с субъединицей, необходимой для узнавания промотора фага phiR1-37). Очистка и характеризация новых ферментов запланирована на следующий отчетный период. Помимо работы с AR9 и phiR1-37 нвРНКП, мы провели работу по изучению неканонической РНКП фага phi14:2, которая так же имеет общее эволюционное происхождение с РНКП клеточных организмов. А именно, в отчетный период мы провели секвенирование тотальной РНК выделенной из заражённых phi14:2 C. baltica клеток, что позволило классифицировать гены фага на разные временные классы. Мы показали, что транскрипция ранних генов фага устойчива к рифампицину (ингибитор РНКП бактерий), а значит ранние гены фага действительно должны транскрибироваться фаговой РНКП; транскрипция средних и поздних генов ингибировалась рифампицином, а значит осуществляется хозяйской РНКП. Для определения 5′-концов фаговых транскриптов мы провели реакции удлинения праймера (primer extension) с фаговой РНК. Перед ранними генами не удалось найти консервативный мотив, однако перед средними генами был действительно определен бактериальный промотор. Наиболее важно то, что мы показали, что белок phi14:2, имеющий каталитический мотив клеточных РНКП, действительно является активной РНКП in vitro и эффективно транскрибирует денатурированную ДНК phi14:2. Наконец, мы определили кристаллическую структуру новой РНКП. Оказалось, что большая часть структуры не похожа ни на какую многосубъединичную клеточную РНКП или на фаговую РНКП; самая консервативная часть новой структуры наиболее похожа на эукариотическую РНКП QDE-1 из Neurospora crassa, которая участвует в синтезе РНК для РНК интерференции для регуляции экспрессии генов в этом организме. Полученная нами структура важна как для понимания процесса эволюции ферментов транскрипции, так и для более детального прояснения механизмов транскрипции.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Бактериофаг AR9, инфицирующий Bacillus subtilis, необычен тем, что в его двунитевом ДНК геноме тимины полностью заменены на урацилы (Lavysh, Sokolova et al. 2016). Кроме того, в геноме AR9, как и в геномах некоторых других родственных ему фагов, закодированы две неканонические многосубъединичные РНКП – вирионная РНКП (вРНКП), упаковывающаяся в фаговые частицы вместе с ДНК фага, и невирионная РНКП (нвРНКП), присутствующая только в инфицированных фагом клетках (Lavysh, Sokolova et al. 2016). В начале инфекции вРНКП транслоцируется в клетку вместе с ДНК фага и транскрибирует ранние гены фага, включая гены субъединиц нвРНКП. Затем нвРНКП транскрибирует поздние гены фага, в том числе гены субъединиц вРНКП. Обе фаговые РНКП имеют общее эволюционное происхождение с РНКП клеточных организмов, поскольку состоят из полипептидов, являющихся дальними гомологами различных частей β- и β′-субъединиц бактериальных РНКП. Однако, фаговые РНКП не содержат гомологов других обязательных компонентов клеточных РНКП (таких как α субъединицы и σ фактор в бактериальном ферменте), что указывает на существование альтернативных принципов сборки многосубъединичных РНКП и механизмов узнавания ими промоторов в ДНК. Ранее нами было показано, что нвРНКП гигантского фага AR9 в отличие от бактериальной РНКП в процессе инициации транскрипции специфично узнает матричную нить промотора и обладает уникальной для всех известных многосубъединичных РНКП способностью промотор-специфично инициировать транскрипцию с однонитевой ДНK (Sokolova, Borukhov et al. 2017). Также было показано, что каталитически активный кор нвРНКП AR9 в отличие от кора бактериальной РНКП состоит только из гомологов β- и β′- субъединиц (четыре субъединицы гомологичные N- и C-концевым частям β и β′), тогда как для образования холофермента нвРНКП, узнающего промотор в ДНК, необходима пятая субъединица gp226, не имеющая гомологов с известной функцией. Кроме того, оказалось, что AR9 нвРНКП, в отличие от всех остальных известных РНКП, для своей работы требует присутствия в ДНК нестандартного для ДНК азотистого основания – урацила, тогда как ДНК со стандартным основанием (тимином) не может служить матрицей для промотор-специфической инициации транскрипции (таким образом фаговая РНКП отличает фаговую ДНК от ДНК бактерии во время инфекции) (Sokolova, Borukhov et al. 2017). Было показано, что холофермент AR9 нвРНКП узнает промотор с консенсусом 3′-−11UUGU−8-X6-AU+1-5′ (X – это любой нуклеотид, +1 – старт транскрипции). Замена урацила на тимин в положение -11 или -10 относительно старта транскрипции препятствует узнаванию промотора AR9 нвРНКП, тогда как остальные урацилы могут быть заменены на тимины без ингибирующего эффекта на транскрипцию. В данном проекте мы продолжили изучать свойства транскрипции AR9 нвРНКП, а также то, насколько эти свойства консервативны среди РНКП из других фагов. Самым главным результатом второго этапа работы стало определение структуры AR9 нвРНКП. Совместно с группой Петра Леймана (UTMB, США) с помощью рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии нами были определены структуры кора, холофермента и холофермента в комплексе с фрагментом ДНК, содержащим промотор с урацилами. Данные структуры позволили объяснить молекулярный механизм узнавания промотора, в частности то, каким образом AR9 нвРНКП отличает урацилы от тиминов в промоторе. Анализ структуры позволил получить мутантный фермент, который узнает промотор с урацилом и тимином в положении -10 с равной эффективностью. Также было определено, что механизм узнавания промотора в ДНК с урацилами консервативен среди всех фагов с такими геномами. Структура AR9 нвРНКП также позволила понять, каким образом формируется длинный РНК/ДНК гибрид во время элонгации AR9 нвРНКП, что невозможно для других многосубъединичных РНКП.