Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Настоящий проект посвящен комплексному междисциплинарному исследованию гомо- и гетероолигосахаридов, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов опаснейших грибковых и бактериальных патогенов и созданию с их помощью конъюгированных вакцин 3-его поколения и иммуноферментных диагностикумов. Целевыми объектами данного исследования являются олигосахариды, отражающие структурные фрагменты антигенных полисахаридов бактерий - полирибозилрибитолфосфата Haemophilus. influenzae тип b, альгината Pseudomonas. aeruginosa (синегнойная палочка), галактанов 1-3 и маннанов Klebsiella pneumoniae, дигетерогликана Enterococcus faecalis; а также полисахаридов грибковых патогенов – галактоксиломаннана Cryptococcus neoformans и альфа- и бета-маннанов Candida albicans. Сведения о выполненных в отчетном году работах и полученных научных результатах сгруппированы в соответствии с объектами исследований. I. Исследования, направленные на создание вакцины 3-его поколения против H. influenzae типа b. Haemophilus influenzae относится к грамотрицательным бактериям, клеточная стенка которых окружена полисахаридной капсулой. Наиболее патогенной для человека является H. influenzae типа b, которая вызывает гнойный менингит, пневмонию, сепсис, острый артрит, отит, синусит, перикардит и другие заболевания. Главным компонентом капсулы данного возбудителя является полирибозилрибитолфосфат. В 2019 году был осуществлен препаративный синтез спейсерированных олигосахаридов, соответствующих ди-, три- и тетрамеру повторяющегося звена цепи полирибозилрибитолфосфата H. influenzae типа b. Целевые олигосахариды были получены в виде спейсерированных производных, содержащих аминогруппу, пригодную для конъюгации. Исходя из данных соединений были получены и охарактеризованы конъюгаты с вакцинными белками-носителями (CRM-197, dTT), а также контрольный иммуноген с BSA. Кроме того, для оценки интенсивности и типирования иммунного ответа были синтезированы покывающие-антигены - конъюгаты олигосахаридов с биотином. Проведенные серии иммунизаций лабораторных животных показали способность исследуемых вакцинных кандидатов индуцировать образование специфичных иммуноглобулинов IgG. В случае ряда полученных продуктов достигается иммунный ответ, превышающий таковой при использовании импортных вакцин. II. Исследовательские работы, направленные на создание клебсиельной вакцины и иммуноферментного диагностикума. K. pneumoniae вызывает тяжелые, трудно подающихся лечению внутрибольничные инфекции, бактериемии, инфекции дыхательных путей. С целью разработки клебсиельной вакцины и иммуноферментного диагностикума был впервые проведён синтез спейсерированных олигосахаридов, родственным основным О-антигенам бактерии K. pneumoniae, галактану I и галактану II, содержащих до 6 углеводных остатков. С помощью полученных соединений был проведен скрининг сывороток лабораторных животных, полученных при иммунизации инактивированными клетками различных штаммов бактерии K. pneumoniae. В результате было показано, что синтезированные олигосахариды хорошо мимикрируют природные полисахаридные антигены бактерии K. pneumoniae, что позволяет использовать полученные олигосахаридные лиганды в качестве основы для разработки диагностикумов и вакцинных препаратов для выявления и предотвращения клебсиеллезных инфекций. III. Исследовательские работы, направленные на создание вакцины против P. aeruginosa на основе синтетических олигосахаридов, отражающих иммунодетерменантные фрагменты альгината. Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) – грамположительная условно-патогенная бактерия, которая является частой причиной внутрибольничных инфекций. Лечение синегнойной инфекции осложняется растущей антибиотикорезистентностью, из-за чего эта бактерия включена Всемирной Организацией Здравоохранения в группу патогенов, представляющих особую опасность для человечества («группа ESKAPE»). Альгинаты являются компонентом бактериальной капсулы P. aeruginosa и представляют собой перспективную мишень для разработки средств иммунотерапии (вакцины, терапевтические антитела) и иммунодиагностики. В рамках данного проекта были синтезированы спейсерированные лиганды, соответствующих три- и пентасахаридному фрагментам альгината P. aeruginosa, а также конъюгаты данных лигандов с белками-носителями (CRM-197, BSA) и биотином, с которыми начаты биохимические исследования. IV. Исследовательские работы, направленные на создание вакцины и терапевтических антител против E. faecalis на основе синтетических фрагментов дигетерогликана. Enterococcus faecalis – грамположительные кокки, обитающие в кишечнике человека. Однако в ряде случаев они способны вызывать тяжелые септические состояния, обусловленные высоковирулентными штаммами E. faecalis, обладающими антибиотикорезистентностью. Особо опасные штаммы E. faecalis продуцируют полисахарид дигетерогликан, который является перспективной мишенью для разработки вакцинных препаратов. В раках данного проекта был осуществлен синтез серии олигосахаридных фрагментов, родственных дигетерогликану и содержащих от 2 до 8 моносахаридных остатков. Исходя из полученных олигосахаридов были получены требуемые конъюгаты с биотином и иммуногены. Была осуществлена иммунизация кроликов полученными препаратами и показано, что вырабатываемые антитела обладают протективным действием в отношении бактерий E. faecalis как in vitro (эксперименты по опсонофагоцитозу), так и in vivo (модель сепсиса у мышей). Полученные результаты указывают на высокую перспективность выбранных гаптенов для разработки вакцины 3-го поколения против E. faecalis. V. Исследовательские работы, направленные на создание кандидозной вакцины и иммуноферментного диагностикума на основе синтетических олигосахаридов, отражающих иммунодетерменантные фрагменты маннана C. albicans. В 2019 году был осуществлен препаративный синтез новых спейсерированных лигандов, соответствующих основным антигенным факторам C. albicans и получены все необходимые гликоконъюгаты (иммуногены, покрывающие реагенты). На основе биотинилированных конъюгатов был создан тематический гликоряд (GlycoArray) - инструмент анализа специфичности иммунного ответа и поиска специфических антигенных маркеров. С его помощью была исследована углеводная специфичность антител, в том числе и моноклонального антитела CA1 из наиболее широко используемого в мире диагностикума Platelia Candida компании BioRad, и показано, что производителем допущена ошибка в определении углеводной специфичности антител СА1 и их выборе для использования в диагностикуме. Изучены иммуногенные свойства серии олигоманнозидов и показано их иммуностимулирующее действие. На основании полученных данных были выбраны оптимальные антигенные маркеры для разработки иммуноферментного диагностикума и приготовлены соответствующие иммуногены для генерации требуемых моноклональных антител. VI. Исследовательские работы, направленные на создание криптококковой вакцины и иммуноферментного диагностикума на основе синтетических олигосахаридов отражающих иммунодетерменантные фрагменты галактоксиломаннана C. neoformans. Впервые проведён синтез олигосахаридов, родственных вицинально разветвлённому фрагменту галактоксиломаннана C. neoformans, содержащих до 5 моносахаридных звеньев. Данные соединения были переведены в конъюгаты с БСА и биотином, которые будут использоваться в следующем году для исследования их гликобиологической роли. Был проведен спектральный и конформационный анализ, продемонстрировавший соответствие синтетических лигандов и природному антигенному полисахариду галактоксиломаннану. Результаты исследований в 2019 году опубликованы и приняты в печать в специализированных международных журналах, главным образом из списка Q1. Согласно требованиям Конкурсной документации в сентябре 2019 года в ИОХ РАН была проведена школа молодых ученых «ГЛИКОНАУКИ И ГЛИКОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ» по тематике проекта (химия и биохимия углеводов, гликотехнология, вакцины и диагностикумы) с участием в качестве лекторов 11 ведущих российских и зарубежных ученых. Для участия в школе зарегистрировалось 68 участников (50 участников в возрасте до 35 лет). Информация о конференции доступна на сайте ИОХ РАН http://zioc.ru/events/conferences/2019/glyco.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий проект посвящен комплексному междисциплинарному исследованию олигосахаридов, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов опасных грибковых и бактериальных патогенов и созданию на их основе конъюгированных вакцин 3-его поколения и диагностических тест-систем. Целевыми объектами исследований являются олигосахариды, отражающие структурные фрагменты антигенных полисахаридов бактерий: (1) Haemophilus. influenzae тип b – полирибозилрибитолфосфат; (2) Pseudomonas. aeruginosa (синегнойная палочка) – бактериальный альгинат, PEL-полисахарид; (3) Klebsiella pneumoniae – галактаны I-III, маннаны; (4) Enterococcus faecalis – дигетерогликан; (5) Candida albicans – α-, β-маннаны, глюканы; (6) Cryptococcus neoformans – галактоксиломаннан; (7) Streptococcus pneumoniae – капсулярный полисахарид типа 3. Сведения о выполненных в отчетном году работах и полученных научных результатах сгруппированы по патогенам. I. Исследования, направленные на создание вакцины 3-его поколения против H. influenzae типа b В соответствии с заявленным планом работ в 2020 году были проведены испытания вакцинных кандидатов в экспериментах in vivo. Среди синтезированной обширной серии кандидатных вакцинных препаратов, различающихся структурой вакцинного лиганда, типом спейсера, соединяющего углеводный лиганд и вакцинный белок носитель, а также степенью конъюгации было отобрано соединение лидер Хиб.R4M3. Для данного соединения были детально изучены различные режимы иммунизации, доза и наличие адъюванта. Кроме того, была изучена возможность применения данного препарата в составе комбинированного многоцелевого вакцинного препарата Хиб + АКДС. Было показано, что создаваемый в рамках данного проекта вакцинный препарат Хиб.R4M3 хорошо формулируется с другими вакцинами и превосходит по протективному эффекту используемый сейчас клинической практике и производимый из импортной субстанции препарат Хиб с.11. II. Исследовательские работы, направленные на создание клебсиельной вакцины и иммуноферментного диагностикума. K. pneumoniae является грамотрицательной бактерией, способной вызывать тяжелые, трудно подающихся лечению внутрибольничные инфекции, бактериемии, инфекции дыхательных путей и др. Известно, что фактором антибиотикорезистентности данной бактерии является наличие на поверхности клетки особого полисахарида, так называемого галактана III. В 2020 году был осуществлен синтез репрезентативной библиотеки олигосахаридных лигандов, родственных фрагментам галактана III. Из синтезированных олигосахаридов были получены конъюгаты с биотином, в результате чего была собрана панель синтетических антигенов строго определенного строения для выяснения профиля углеводной специфичности антител, возникающих в ответ на клебсиеллезную инфекцию. Данные образцы будут использованы для выявления иммунодоминантного эпитопа галактана III. Информация о его строении будет использована на следующих этапах выполнения проекта для выбора оптимального олигосахаридного лиганда для создания конъюгированной вакцины и диагностического набора. В ходе реализации проекта в 2020 году были также синтезированы олигоманнозиды, отвечающие повторяющемуся звену O-цепи ЛПС, соответствующие O3 типу бактерии K. рneumoniae (третий по эпидемиологической распространенности тип K. рneumoniae). Иммунологические исследования этих олигосахаридов будет продолжено на следующих этапах проекта. III. Исследовательские работы, направленные на создание вакцины против P. aeruginosa В ходе реализации проекта в 2020 году были синтезированы все необходимые для проведения гликобиологических исследований конъюгаты олигосахаридов, родственных фрагментам альгинатов бактерии P. aeruginosa. Помимо альгинатов, и другие полисахариды участвуют в образовании бактериальной капсулы P. aeruginosa и тем самым являются перспективными мишенями для вакцинотерапии и вакцинопрофилактики, а также специфическими маркерами для разработки иммуноферментных диагностикумов. Одним из таких компонентов является PEL-полисахарид P. aeruginosa, построенный из α-(1→4)-связанных остатков галактозамина и N-ацетил галактозамина. В рамках реализации данного проекта в 2020 году впервые получены биотинилированые олиго-α-(1→4)-галактозамины и их N-ацетилированные производные, отвечающие фрагментам PEL-полисахарида P. aeruginosa, а также структурно родственные галактозаминогалактану – полисахаридному компоненту клеточной стенки и фактору вирулентности опасного грибкового патогена A. fumigatus. Специально подобранная комбинация защитных групп обеспечила α-стереонаправленный контроль реакции гликозилирования. Проведены исследования иммунологических свойств полученных соединений, в частности, их адъювантной активности (активация экспрессии цитокинов), а также в качестве инструмента для оценки профиля углеводной специфичности антител в сыворотках больных инвазивным, бронхолёгочным и аллергическим аспергиллёзом. По результатам данной части исследований опубликована статья в одном из наиболее топовых химических журналах The Journal of the American Chemical Society (Q1) [1] и обзоре в журнале Pure and Applied Chemistry (Q2) [4] по использованию метода азидофенилселенелирования для синтеза труднодоступных олигосахаридов. IV. Исследовательские работы, направленные на создание вакцины и терапевтических антител против E. faecalis на основе синтетических фрагментов дигетерогликана. В рамках реализации данного проекта была синтезирована серия олигосахаридов, родственных фрагментам дигетерогликана (ДГГ) – нового полисахаридного антигена бактерии Enterococcus feacalis, представляющей серьезную угрозу в качестве возбудителя трудноизлечимых госпитальных инфекций. В сотрудничестве с коллегами из Лейденского университета (Нидерланды) с использованием специально разработанных методов олигосахаридного синтеза была получена репрезентативная серия углеводных лигандов, различающихся длиной цепи и строением повторяющегося дисахаридного звена. Сотрудниками ИОХ РАН все полученные соединения были переведены в иммуногены (конъюгаты с бычьим сывороточным альбумином), а также меченные биотином производные для анализа профиля специфичности вырабатываемых антител. Совместно с немецкими и итальянскими коллегами был изучен протективный эффект полученных антител в экспериментах in vitro и in vivo, и показано, что выбранные структуры являются перспективными вакцинными лигандами, позволяющими вырабатывать антитела, защищающие от инкапсулированных штаммов E. faecalis. По результатам данной части исследований опубликована статья в специализированном научном журнале ACS Infectious Diseases (Q1). V. Исследовательские работы, направленные на создание кандидозной вакцины и иммуноферментного диагностикума на основе синтетических олигосахаридов, отражающих иммунодетерменантные фрагменты маннана C. albicans. В 2020 году были получены новые олигоманнозиды необходимые для выработки и отбора диагностических антител. На настоящий момент конъюгаты данных олигосахаридов с БСА, KLH, биотином и полиакриламидом используются для получения высокоаффинных моноклональных антител, по специально созданным биотехнологическим схемам. С помощью собранных библиотек лигандов определены эпитопные специфичности антител, используемых коммерческой тест-системе для определения маннана C. albicans и выявлена причина неточности этих тестов. Также изучена углеводная специфичность одного из важнейших рецепторов иммунных клеток DC-SIGN. В 2020 году был дополнительно проведен синтез олигосахаридных фрагментов β-(1→3)-глюкана и хитина, а также конъюгатов на их основе, с помощью которых проводится выбор наиболее специфичных и аффинных антител для обнаружения антигенных маркеров грибковых инфекций в сыворотке крови пациентов. Синтезированные с использованием специальных подходов олигосахариды родственные хитину грибов были также исследованы на предмет их иммуномодулирующих свойств. Материалы данного исследования опубликованы в журнале Frontiers in Chemistry (Q1). VI. Исследовательские работы, направленные на создание криптококковой вакцины и иммуноферментного диагностикума на основе синтетических олигосахаридов отражающих иммунодетерменантные фрагменты галактоксиломаннана C. neoformans. В ходе реализации данной части проекта с использованием оптимизированной схемы синтеза в 2020 году были получены модельные олигосахариды, родственные ключевому разветвленному фрагменту галактоксиломаннана С. neoformans. С использованием полученных модельных олигосахаридов был проведен детальный структурный и конформационный анализ данного разветвленного фрагмента полисахарида. Участниками проекта были разработаны специальные компьютерные методики анализа геометрии и реакционной способности углеводных молекул. Эти теоретические работы, а также их сопоставление с экспериментальными ЯМР данными суммированы в автообзоре, опубликованном в виде главы в периодической книжной серии «Carbohydrate Chemistry – A Specialist Periodical Reports» издательства королевского химического общества (RSC). VII. ДРУГИЕ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ. В 2020 году осуществлялись и методологические исследования, направленные на оптимизацию экспериментальных протоколов для исследования углевод-белкового взаимодействия (например, взаимодействия углеводных лигандов с антителами и белками-рецепторами), изучение углеводной иммунологии применительно к возбудителям бактериальных и грибковых инфекций, развитие новых методов, применимых к иммуноферментному анализу на различных технологических платформах. В этих работах были использованы олигосахаридные лиганды, полученные в рамках рассмотренной выше исследовательской программы, а также модельные соединения, которые использовались в лаборатории Руководителя настоящего проекта (чл.-корр. РАН Н.Э. Нифантьев) раньше и которые могут выступать в роли удобных активных стандартов. Продолжено исследование иммунологических свойств синтезированных на предыдущем этапе олигосахаридов, структурно родственных фрагментам капсулярного полисахарида Streptococcus pneumonia типа 3. Исследовано распознавание олигосахаридов противобактериальными антителами, а также адъювантные свойства оликосахаридов и профиль индуцируемых ими цитокинов. Синтезированы конъюгаты олигосахаридов с белком-носителем БСА и подтверждена их способность индуцировать образование опсонизирующих антител. Результаты работы опубликованы в отечественном журнале ЖМЭИ [2], а также в специализированном международном журнале Frontiers in Immunology (Q1) [8]. Кроме этого, для поиска оптимальных углеводных лигандов для создания вакцин проанализированы накопленные участниками проекта и зарубежными исследователями перспективы создания поливидовых вакцин широкого спектра действия на основе поли-β-(1→6)-N-ацетилглюкозаминов и их дезацетилированных производных. Результаты исследования суммированы в приглашенном обзоре, опубликованном в журнале Drug Discovery Today: Technologies (Q1) [6]. Начаты работы по созданию вакцинных конъюгатов новых типов на основе нелинейных белковых носителей и олигосахаридов, родственных фрагментам поли-β-(1→6)-N-ацетилглюкозаминов и их дезацетилированных производных. Результаты этих работ будут рассмотрены в отчётах на следующих этапах выполнения проекта. Всего опубликовано 5 статей в журналах из списка Q1 и 3 другие статьи, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus; таким образом, принимая специальный учёт статей в журналах Q1, публикационные результаты проекта существенно превышены, по сравнению с требовавшимися по плану работ в 2020 году. Согласно требованиям Конкурсной документации 2-го декабря 2020 года в ИОХ РАН была проведена школа молодых ученых «ГЛИКОНАУКИ И ГЛИКОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ» по тематике проекта (химия и биохимия углеводов, гликотехнология, вакцины и диагностикумы) с участием в качестве лекторов 11 ведущих российских ученых. Как и в 2019 году, школа, хотя и вынужденно проводилась режиме онлайн, вызвала очень большой интерес. В школе приняли участие 94 зарегистрированных участника, среди которых 64 участника молодые учёные в возрасте до 35 лет. Информация о конференции доступна на сайте ИОХ РАН http://zioc.ru/events/conferences/glyco. Согласно требованиям конкурсной документации, в состав научного коллектива на основании открытого конкурса приняты три постдока в возросте до 35 лет: к.м.н. Антонец А.В. для выполнения микологических работ по Проекту и апробации диагностических наборов на клиническом материале; к.х.н. Полинская М.С. – для разработки сенсоров и тест систем на грибковые и бактериальные антигены; к.б.н. Герасимов А.С. – для разработки биотехнологических методов получения рекомбинантных белков - вакцинных носителей.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект посвящен комплексному междисциплинарному исследованию олигосахаридов, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов опасных грибковых и бактериальных патогенов и созданию на их основе конъюгированных вакцин 3-его поколения и диагностических тест-систем. Целевыми объектами исследований являются олигосахариды, отражающие структурные фрагменты антигенных полисахаридов бактерий: (1) Haemophilus influenzae (тип a и тип b) – полирибозилрибитолфосфаты двух типов; (2) Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) – бактериальный альгинат, PEL-полисахарид; (3) Klebsiella pneumoniae – галактаны I-III (серотипы O1-O2), маннаны (серотип O3); (4) Enterococcus faecalis – дигетерогликан; (5) Candida albicans – α-, β-маннаны, глюканы; (6) Cryptococcus neoformans – галактоксиломаннан; (7) Streptococcus pneumoniae – капсулярные полисахариды. Сведения о выполненных в отчетном году работах и полученных научных результатах сгруппированы по патогенам. I. Исследования, направленные на создание вакцины 3-его поколения против H. influenzae типа b В 2021 году в соответствии с исходной заявкой и годовым планом работ была проведена оптимизация методик синтеза антигенных олигосахаридов, структурно родственных капсулярному полисахариду H. influenzae типа b и впервые начаты работы по получению антигенов бактерии H. influenzae типа а. Капсулярные полисахариды H. influenzae типов а и b имеют похожую структуру и являются псевдополисахаридами из-за присутствия в цепи фосфатного мостика. На фоне расширяющейся вакцинации против H. influenzae типов b, в мире, в том числе и в России, началось увеличение эпидемиологического значения H. influenzae типа а. С использованием вновь полученных в 2021 году, а также с полученными нами ранее в рамках данного проекта олигорибозилрибитолфосфатами, были начаты исследования по изучению титров антител в сыворотках пациентов, заражённых H. influenzae типами а и b, а также определение возможной кросс-реактивности антител после иммунизации вакциной против типа b по отношению к антигенам, отвечающим типу а. II. Исследовательские работы, направленные на создание клебсиельной вакцины и иммуноферментного диагностикума. В ходе реализации данного поднаправления проекта в 2021 году были синтезированы новые олигосахаридные структуры, отвечающие антигенным полисахаридам бактерии Klebsiella pneumoniae. В частности, в 2021 году были впервые получены олигосахариды, несущие на невосстанавливающем конце олигосахаридной цепи остаток галактофуранозы и олигоманнозиды с метилфосфатным остатком, родственные О-цепи ЛПС бактерии K. pneumoniae серотипа O3. Эти олигосахариды пополнили тематическую панель антигенных лигандов, родственных K. pneumoniae, и были исследованы в качестве покрывающих антигенов для анализа специфических антител в сыворотках пациентов, перенесших клебсиеллезную инфекцию, а также в качестве гаптенов в экспериментальных вакцинных препаратах для профилактики данной опасной инфекции. Полученные результаты позволили выявить группу олигосахаридов, конъюгаты которых с белком-носителем обладают протективным действием и увеличивают выживаемость лабораторных животных зараженных K. pneumoniae. Для ряда олигосахаридов был продемонстрирован высокий диагностический потенциал при использовании в качестве покрывающих антигенов в иммуноферментном анализе. Данные олигосахариды позволяют разработать на их основе диагностические наборы для определения и типирования K. pneumoniae. III. Исследовательские работы, направленные на создание вакцины против P. aeruginosa Синтезированные в ходе выполнения проекта β-(1→4)-олигоманнурониды, родственные бактериальным альгинатам P. aeruginosa, и α-(1→4)-олигогалактозамины, родственные PEL-полисахариду P. aeruginosa, были использованы для скрининга антител в сыворотках крови пациентов, перенесших инфекцию, вызванную P. aeruginosa, а также в сыворотках крови иммунизированных лабораторных животных. Было продемонстрировано, что обнаружение антител к олиго-α-(1→4)-галактозаминам (в ацетилированной и дезацетилированной формах) может быть ассоциировано не только с P. aeruginosa, но и с другими грибковыми (плесневые грибы рода Aspergillus) и бактериальными (например, Campylobacter jejuni) патогенами. Для ряда образцов наличие инфекции, вызванной P. aeruginosa, было подтверждено обнаружением IgG иммуноглобулинов, специфичных к олигосахаридным фрагментам альгината, что подтверждает диагностический потенциал для данного типа олигосахаридов для определенных серотипов P. aeruginosa. IV. Исследовательские работы, направленные на создание вакцины и терапевтических антител против E. faecalis на основе синтетических фрагментов дигетерогликана. В 2021 году были разработаны методики получения и анализа иммунологического препарата на основе вакцинного носителя CRM-197 с учетом требований и стандартов, предъявляемым к процессам получения фармацевтических препаратов и контроля качества. Для выяснения особенностей 3D-строения фуранозил-содержащих олигосахаридов, влияющих на их иммунологические свойства, проведены теоретические исследования конформационной подвижности галактофуранозильных остатков как в виде моносахаридов, так и в составе олигосахаридов. Было показано, что в моносахаридах, модифицированных остатком молочной кислоты (звено дигетерогликана E. faecalis), вращение данного остатка может вызывать конформационные переходы в фуранозидном кольце, чего обычно не наблюдается в пиранозидных структурах. V. Исследовательские работы, направленные на создание кандидозной вакцины и иммуноферментного диагностикума на основе синтетических олигосахаридов, отражающих иммунодетерменантные фрагменты маннана C. albicans. Проблема грибковых заболеваний существенно возросла в 2021 году в связи с распространением новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Кандидоз, вызываемый грибами рода Candida, является самым распространенным грибковым заболеванием среди пациентов с COVID-19. Инвазивный кандидоз, ассоциированный с COVID-19, существенно увеличивает смертность среди пациентов в связи с чем в последние «Временные рекомендации по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (СOVID-19) (версии 12 и 13) Министерства здравоохранения РФ» включён специальный раздел посвященный данной проблеме. В связи с недостаточной эффективностью существующих диагностических наборов первоочередное внимание было уделено разработке новых чувствительных, специфичных и малоинвазивных диагностикумов. В 2021 году осуществлен синтез новых олигосахаридов, рассматриваемых в качестве потенциальных маркеров инвазивного кандидоза. Среди них три-, пента- и гексасахариды отвечающие полисахаридам клеточной стенки дрожжевых грибов C. albicans; пентасахарид, родственный глюкоманнану Candida utilis; гетеросахариды, объединяющие в своей структуре элементы сразу двух полисахаридных антигенов грибов: β-(1→3)-глюкана и маннана, β-(1→3)-глюкана и хитина. Данные соединения были использованы для генерации специфических моноклональных антител и конструированию сенсоров на их основе для обнаружения грибковых антигенов с использованием различных технологических платформ. VI. Исследовательские работы, направленные на создание криптококковой вакцины и иммуноферментного диагностикума на основе синтетических олигосахаридов отражающих иммунодетерменантные фрагменты галактоксиломаннана C. neoformans. В 2021 году были получены новые олигосахариды, родственные фрагментам галактоксиломаннана C. neoformans, которые пополнили библиотеку олигосахаридных лигандов уже синтезированных в рамках настоящего проекта. Был проведен структурный и конформационный анализ ключевого разветвленного фрагмента с выявлением основных пространственных характеристик данного эпитопа. VII. ДРУГИЕ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ. В 2021 году проводились методологические исследования, направленные на оптимизацию экспериментальных протоколов необходимых для поиска оптимальных вакцинных лигандов для разработки эффективных и безопасных иммунологических препаратов. В качестве одного из новых объектов исследований изучались олигосахаридные антигены, родственные фрагментам капсулярных полисахаридов Streptococcus pneumonia, содержащих фосфатный мостик и относящихся к 6-ой группе серотипов. Спейсерированное производное, содержащее псевдотетрасахаридный фрагмент, отвечающий структуре повторяющегося звена капсулярного полисахарида S. pneumonia серотипа 6В, было синтезировано в рамках данного проекта ранее. В 2021 году было получено аналогичное производное, отвечающее повторяющемуся звену капсулярного полисахарида S. pneumonia серотипа 6А. Всего за отчетный период опубликовано 4 статьи в журналах из списка Q1 и 5 других статей, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и РИНЦ; таким образом, принимая специальный учёт статей в журналах Q1, публикационные результаты проекта существенно превышены, по сравнению с требовавшимися по плану работ в 2021 году.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект посвящен междисциплинарному исследованию гомо- и гетероолигосахаридов, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов опаснейших грибковых и бактериальных патогенов, а также созданию с их помощью углеводных вакцин 3-его поколения и иммуноферментных диагностикумов, требуемых для обнаружения и предотвращения инфекций. В данном отчёте рассмотрены результаты химических, физико-химических и иммунохимических исследований углеводных антигенов следующих патогенных микроорганизмов (1) Haemophilus influenzae; (2) Klebsiella pneumoniae; (3) Pseudomonas aeruginosa; (4) Enterococcus faecalis; (5) Candida albicans; (6) Cryptococcus neoformans. В 2022 году в соответствии с исходной заявкой и годовым планом работ была разработана эффективная схема синтеза дисахаридного блока, необходимого для синтеза псевдоолигосахаридов, родственных моно-, ди- и тримеру повторяющегося звена капсулярного полисахарида H. influenzae типа A. Начаты иммунохимические исследования данных соединений и продемонстрированы их антигенные свойства. Кроме того разработаны синтетические подходы к получению олигосахаридов, родственных H. influenzae типа E и типа F, что ранее не планировалось, но крайне важно в связи с ростом заболеваемости, вызванной патогенами этих типов. В 2022 году была синтезирована серия биотинилированных олигосахаридов, родственных О-цепям ЛПС K. pneumoniae серотипов О3 и 2Oac. Было выполнено полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР, измерены ядерные эффекты Оверхаузера и гетероядерные константы спин-спинового взаимодействия, отвечающие межзвеньевым связям. В результате проведенных структурных исследований было показано, что пространственное строение синтезированных олигосахаридных моделей полностью соответствует природным антигенам. Проведенные иммунохимические исследований показали, что использование биотинилированных производных синтезированных олигосахаридов в качестве покрывающих антигенов позволяет выявлять специфические к K. pneumoniae антитела в сыворотках лабораторных животных и пациентов с подтвержденной клебсиеллезной инфекцией. В 2022 году были продолжены работы по сбору и анализу сывороток с использованием тематического гликоряда (GlycoArray) на основе олигосахаридов, родственных бактериальным альгинатам P. aeruginosa. Помимо клинических образцов и образцов специально иммунизированных лабораторных животных, в отчётном году собраны т проанализированы образцы ветеринарного профиля, что особенно важно для разработки вакцины ветеринарного назначения. В 2022 году с использованием оригинальных методик были получены образцы конъюгатов синтетических олигосахаридов, родственных полисахаридам E. faecalis и сертифицированного вакцинного носителя CRM-197. Для данных экспериментальных образцов вакцинных препаратов были детально изучены различные режимы иммунизации, доза и наличие адъюванта. В результате проведенных экспериментов in vitro, была исследована поляризация Т-лимфоцитов под действием экспериментального вакцинного препарата, а также профиль индуцированной выработки про- и противовоспалительных цитокинов в супернатантах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови. В 2022 году было завершено комплексное исследование распознавания рецептором врождённого иммунитета DC-SIGN синтетических олигоманнозидов, отвечающих различным антигенным факторам маннана Candida albicans. Результаты исследования связывания меченого DC-SIGN с синтетическими олигоманнозидами выявили строгие закономерности субстратной специфичности DC-SIGN. Определен минимальный пентасахаридный фрагмент распознаваемый DC-SIGN, а с использованием различных лиганд-ориентированных и рецептор-ориентированных ЯМР-методик (ЯМР-титрование, STD и др.) были картированы контакты молекулы белка и молекулы лиганда. Были проведены измерения константы равновесия углевод-белкового взаимодействия, которые лежат в субмикромолярном диапазоне. В 2022 году был исследован анти-маннановый антительный ответ в случайной выборке из 31 сыворотки крови здоровых доноров на панели из 11 синтетических манноолигосахаридов различной структуры. Был обнаружен высокий титр антител для антигенов, содержащих β-маннозидные звенья, причем наивысшие значения достигались при наличии двух (1→2)-связанных β-маннозных остатков. Для антигенов, содержащих только α-маннозные остатки, значимого уровня антител практически не выявлено. Таким образом, β-маннаны, по-видимому, являются гораздо более сильными антигенами, а обнаружение антител к ним в сыворотках крови здоровых доноров может являться источником ложноположительных результатов при серологической диагностике кандидозной инфекции. Результаты этого исследования, кроме фундаментального и методологического значений, имеют перспективу для практического использования при создании кандидных иммуноферментных диагностикумов. В 2022 году были получены новые олигосахариды, родственные фрагментам галактоксиломаннана C. neoformans, и в частности, был получен пентасахарид родственный разветвленному фрагменту полисахаридной цепи. Было проведено исследование антисывороток против капсульного полисахарида C. neoformans с использованием синтетических лигандов, которое позволило обнаружить специфические антитела против разветвленного фрагмента галактоксиломаннана, что показало иммунологическую значимость синтезированных олигосахаридов и их возможное использование при создании криптококковых вакцины и диагностикумов. Последние широко востребованы сегодня но в РФ представлены в виде импортных продуктов. В 2022 году было завершено изучение углеводной специфичности гидролазы мутаназы, расщепляющей α-(1→3)-D-глюкан – антигенный полисахарид, продуцируемый грибковым патогеном Aspergillus fumigatus. В этом исследовании в качестве модельных субстратов использованы α-(1→3)-D-глюкоолигосахаридные производные, полученные в данном проекте ранее, а также некоторые новые соединения указанного ряда. Разработаны методы проведения стереонаправленного гликозилирования, получения фосфат-связанных псевдоолигосахаридов, биологически активных производных углеводов, а также подходов для изучения специфичности углевод-белковых взаимодействий, синтеза конъюгатов с белками носителями и другими неуглеводными функциональными соединениями.