Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Развитие тканевой инженерии ставит перед наукой о материалах ряд принципиально новых задач. Известно, что клетки живого организма - фибробласты, остеобласты, миобласты, кардиобласты и особенно нейроны являются электроактивными, их функционирование зависит от внешнего электрического поля. Поэтому, для регенерации тканей применяют методы электростимуляции, воздействуя на биологический объект постоянным или переменным электрическим полем. Исследования показали, что электростимуляция особенно эффективна для регенерации тканей центральной и периферической нервной системы, аксонов, этим методом также можно лечить повреждение миокарда, восстанавливать скелетные мышцы, улучшать заживление ран, ускорять реконструкцию костной ткани. В настоящее время в качестве альтернативы электропроводящим металлам для использования в биомедицинских целях активно исследуется новый класс материалов – электропроводящие полимеры, например полипиррол (ППи). Эти полимеры являются полупроводниками с высоким уровнем электропроводности. Многочисленные исследования, как in vitro, так и in vivo, доказали хорошую биосовместимость электропроводящих полимеров, поэтому в настоящее время они могут быть использованы не только как долговременные электродные имплантаты, но и как электроактивная биологическая среда для пролиферации клеток и регенерации тканей. Перечисленное свидетельствует о том, что материалы на основе ППи полезны и востребованы в биомедицинской сфере. ППи, как правило, используют в составе композиционных материалов, т. к. его механические свойства весьма низкие. Поэтому, ППи совмещают с полимерными материалами, которые придают электроактивному композиту необходимые механические характеристики. В настоящее время получены и исследованы композиты, содержащие ППи, на основе ряда синтетических биосовместимых полимеров, таких как полиуретаны, полилактиды, поликапролактон. Однако необходимость расширения класса электроактивных полимеров для тканевой инженерии и трансплантологии требует поиска новых материалов. В настоящем проекте в качестве носителей ППи были использованы как резорбируемые, так и нерезорбируемые полимеры. В качестве основы для электропроводящих тканеинженерных конструкций были выбраны волокна, нановолокна и пористые трехмерные образцы – губки. Нерезорбируемым биосовместимым полимером был выбран алифатический сополиамид (СПА). Исследованию структуры и свойств материалов на основе этого спирторастворимого полимера авторы настоящего проекта посвятили ряд публикаций. Для получения нановолокон использовали гранулированный СПА, то есть сополимер ε-капролактама и гексаметилендиаминадипината с соотношением компонентов 40:60, молекулярной массой Mw = 30 кДa, Tпл =188 °C, производства ООО «АНИД» (Россия). В результате электроформования спиртосодержащего водного раствора СПА были получены плёнки толщиной около 350 мкм, состоящие из волокон. Полученный пленочный материал не содержит цитотоксичных остатков растворителя, в течение длительного времени сохраняет свою структуру и свойства на воздухе и в водных средах. Исследование структуры материала методом СЭМ показало, что пленка состоит из волокон диаметром около микрона. Размеры пор составляют десятки микрон. Материал с такой структурой может быть использован в качестве матриц для клеточных технологий. Однако, электропроводность СПА очень низкая, менее 10-12 См/см, что не позволяет использовать материалы на его основе в качестве электродов в биосенсорах, а также в качестве матриц для исследования влияния электрического поля на пролиферативную активность клеток. Для придания пористому материалу на основе волокон из СПА электропроводящих свойств предложено получение гибридных волокон, состоящих из ядра СПА и электропроводящей оболочки из ППи. Электропроводящие материалы, содержащие ППи, могут быть получены двумя способами: путем введения ППи в жидкую композицию, предназначенную для электроформования, или нанесением слоя ППи на поверхность волокон методом гетерофазного синтеза. В настоящей работе предложен метод полимеризации пиррола in situ, когда синтез ППи осуществлялся в реакционной среде, содержащей материал из волокон СПА. В этом случае синтез ППи может идти как в объеме реакционной среды, так и непосредственно на поверхности нановолокон с образованием слоя электропроводящего полимера. Выбор условий полимеризации позволяет корректировать вклады «объемной» и «поверхностной» реакции, обеспечивая таким образом приоритет роста нанослоя ППи на поверхности волокон СПА. С целью получения биосовместимого материала, синтез проводился в водной среде в отсутствии токсичных реагентов и приводил к полной (100%) конверсии пиррола в ППи. По данным электронной микроскопии видно, что СПА нановолокна имеют ровную, гладкую поверхность, их диаметр составляет около 1 мкм. После нанесения ППи структура волокон и материала в целом сохраняется. Однако, на поверхности волокон видны сферических частиц ППи диаметром порядка 100-150 нм или агрегаты таких частиц размером до 500 нм, данные частицы – результат нуклеации и роста ППи на поверхности волокон. Это типичная морфология пленок ППи, синтезированного на носителе методом гетерофазного синтеза. Этот метод синтеза обеспечивает формирование частиц сферической формы. При синтезе ППи в присутствии полимерных волокон, которые имеют к нему хорошую адгезию, процесс проходит преимущественно на поверхности волокон. Частицы, которые образовались в результате реакции протекающей в объеме, хорошо удаляются при промывке готового материала. Промывка волокнистого гибридного материала СПА-ППи после синтеза выявила только следовые количества осадка ППи, что свидетельствует о том, что практически весь ППи связан с поверхностью волокон СПА. Данные СЭМ также демонстрируют лишь небольшое содержание в материале сферических частиц ППи, несвязанных с поверхностью гибридных волокон. Высокий выход ППи в процессе синтеза подтверждается весовым методом. Прибавка веса материала на основе гибридных волокон за счет ППи составляет 6 мас. %, что соответствует 89 % выходу реакции полимеризации. Для решения задач тканевой инженерии одним из требований к материалу матриц тканеинженерных конструкций является его биорезорбируемость. Наиболее изученным и широко используемы полимером для материалов и изделий биомедицинского назначения является биорезорбируемый при взаимодействии с живым организмом полилактид (ПЛА). Для формирования материалов и конструкций, в частности кондуитов, для регенерации периферических нервов, необходимо придать трубчатым образцам требуемые электрофизические характеристики. В этом случае применяли модификацию поверхности нановолокон из ПЛА электропроводящим полимером - ППи. Модификацию поверхности электроформованных волокон проводили с использованием пиррола. Окислительную полимеризацию пиррола проводили при Т= 4°С в течение шести часов. Модифицированные ППи и получившие черную окраску образцы пленок из нановолокон ПЛА многократно промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе в фиксированном состоянии в течение суток. По данным СЭМ видно, что исходные волокна ПЛА, сформованные из раствора концентрацией 20 мас.%, обладают ровной гладкой поверхностью, их диаметр составляет 0,6-1,8 мкм. Такая структура характерна для большинства материалов на основе нановолокон, полученных из растворов полимеров методом электроформования. После синтеза ППи, который проводился в присутствии нановолокон ПЛА, волокнистая и пористая структура материала сохраняется. Вместе с тем видно, что в образцах присутствует как ППи, осажденный на поверхности волокон, так и значительное количество частиц ППи, слабо связанных с поверхностью исследуемого материала. Как следует из результатов анализа гидрофобности волокон ПЛА, углы смачивания θ пленок из ПЛА, полученных сушкой раствора в хлороформе, и на основе нановолокон существенно отличаются, угол смачивания пленки из нановолокон выше, чем для пленки полученной сухим формованием. Увеличение θ свидетельствует о росте гидрофобности материала. Таким образом, пленки на основе нановолокон из ПЛА обладают высокой гидрофобностью. Это осложняет контакт водной реакционной среды, в которой происходит синтез ППи, с поверхностью нановолокон. Следствием этого является большое количество слабо связанных с материалом частиц ППи в виде агрегатов на поверхности волокон. Электрическое сопротивление исходных материалов на основе нановолокон из СПА, ПЛА выше 105 КОм/квадрат, что превышает диапазон измерений и свидетельствует о высоких диэлектрических свойствах этих полимеров. В результате модификации поверхности этих полимеров с помощью ППи, сопротивление материалов снижается, величина сопротивления композита зависит от материала матрицы и, как следует из результатов электронно-микроскопических исследований, от характера взаимодействия ППи с поверхностью нановолокон. Чем более однородное покрытие формируется на поверхности волокон, тем выше электропроводность модифицированного материала. Самое низкое сопротивление имеет композиционный материал на основе нановолокон из СПА, модифицированных ППи. Анализ результатов показывает, что однородность и полнота покрытия зависит от смачиваемости полимерной матрицы водной реакционной средой. В случае гидрофобного полимера (ПЛА) окислительный синтез пиррола происходит в объеме с образованием изолированных частиц или их ассоциатов. Для гидрофильного полимера СПА происходи преимущественно гетерофазный синтез на поверхности нановолокон. Это приводит к существенному повышению электропроводности композиционного материала на основе нановолокон. Для получения электропроводящих гибридных волокон на основе биорезорбируемого полисахарида природного происхождения использовали хитозан. Гибридные волокна хитозан-ППи готовили следующим образом. Волокна хитозана обрабатывали 1 М раствором хлорида железа и затем выдерживали в реакционном сосуде, содержащем пары пиррола. Формирование слоя ППи на поверхности хитозанового волокна осуществлялось путем насыщения хитозановых волокон окислителем с последующей полимеризацией in situ паров мономера пиррола на поверхности хитозановых волокон. Микроскопические исследования показали, что однородность слоя ППи на поверхности волокон хитозана зависит от типа используемого растворителя. Когда использовался водный раствор хлорида железа, волокно лишь частично покрывалось ППи. В случае использования раствора метанола волокно было полностью покрыто ППи. Из проведенных исследований следует, что обработка волокон раствором окислителя в течение 1 часа с последующей полимеризацией пиррола в течение 1 часа не приводит к снижению механических характеристик композитов по сравнению с исходными хитозановыми волокнами. Были получены следующие значения: σ = 171,0 ± 4,1 МПа, ε = 6,7 ± 0,8% и E = 10,1 ± 1,0 ГПа для исходных волокон хитозана; σ = 170,6 ± 12,6 МПа, ε = 7,1 ± 1,9% и E = 10,6 ± 0,4 ГПа для композита соответственно. Таким образом, обработка хитозановых волокон окислителем в течение менее 4 часов не приводит к образованию слоев ППи на последующих стадиях. Увеличение времени воздействия окислителя на хитозановые волокна и увеличение времени полимеризации приводит к заметному снижению как прочности на растяжение, так и удлинения при разрыве, увеличению модуля упругости. Когда время воздействия окислителя составляет 48 часов, были получены следующие значения: σ = 115,6 ± 2,1 МПа, ε = 4,0 ± 0,1% и E = 12,9 ± 4,4 ГПа. Эти изменения в механических характеристиках могут быть объяснены следующим образом. Когда материал обрабатывается водным раствором окислителя, волокна значительно набухают, и в процессе полимеризации образование слоя ППи с жесткой цепью происходит не только на поверхности волокон хитозана, но и в приповерхностном слое. В результате волокно становится более жестким, о чем свидетельствует увеличение модуля упругости, и более «хрупким», что приводит к падению разрушающего напряжения и деформации до разрыва. В то же время, выдержка волокна в растворе хлорида железа в метаноле в течение 1 часа с последующей полимеризацией в течение 1 часа является достаточной для образования гомогенного слоя на поверхности волокна. ППи представляет собой полимер с жесткой цепью; таким образом, формирование in situ гомогенного поверхностного слоя приводит к увеличению прочности волокна и модуля упругости, а также к уменьшению величины удлинения при разрыве. Равномерное покрытие поверхности хитозановых волокон ППи существенно, почти на 10 порядков, повышает проводимость полученных гибридных волокон. Так, проводимость хитозана в исходном состоянии составляет около 1,1х10-11 S/м, в то время, как гибридное волокно, обработанное ППи характеризуется величиной электропроводности от 3,0х10-2 S/м до 3,0 S/м. Сочетание хороших прочностных и деформационных характеристик с высокой электропроводностью позволяет рекомендовать полученные гибридные волокна на основе хитозана и ППи в качестве электропроводящих матриц для тканевой инженерии, в частности для изготовления конструкций, позволяющих интенсифицировать пролиферативную активность аксонов периферических нервов. Для получения композиционных волокон, полученных коагуляционным методом, использовали хитозан и одностеннные углеродные нанотрубки (ОСУНТ) производства НПФ ООО «Углерод ЧГ» (Россия). Хитозан перемешивали в воде в течение 30 мин до его набухания. После этого в смесь вводили раствор уксусной кислоты при постоянном перемешивании, доведя концентрацию кислоты в растворителе до 2%. Концентрация полимера в растворе составляла 4,0 мас.%, эта концентрация является оптимальной для формования волокон коагуляционным способом Раствор хитозана перемешивали 90 мин, после чего фильтровали, а затем обезвоздушивали в вакуумной камере в течение не менее 24 часов при давлении 10 кПа. Для получения композиционных волокон углеродные нанотрубки диспергировали в воде в течение 10 мин на ультразвуковом диспергаторе УЗВ-1.3 (Россия) при частоте 40 кГц. В полученную водную дисперсию добавляли хитозан, далее растворы готовили по указанной выше схеме. Концентрация ОСУНТ в растворе хитозана составляла 0,01, 0,005 и 0,1 мас.%. Волокна формовали по коагуляционному методу, осадителем являлась спиртово-щелочная смесь. Формование проводили с использованием фильеры диаметром 0,6 мм. Скорость подачи раствора составляла 0,2 мл/мин, время осаждения – 150 с; степень фильерной вытяжки (λ) изменялась от 0 до 120 %, пластификационная вытяжка составляла 20%. Волокна промывали в дистиллированной воде, во вторую промывочную ванну добавляли катионный ПАВ. Затем нити сушили на воздухе при 50°С. Показано, что введение ОСУНТ в количестве до 0,1% приводит к небольшому снижению разрывного напряжения и модуля хитозанового волокна. В то же время удлинение при разрыве значительно увеличивается, что является позитивным фактором в силу недостаточной эластичности исходного хитозанового волокна. Из полученных данных следует, что электропроводность композиционных волоконна основе хитозана слабо зависит от концентрации ОСУНТ в хитозановой матрице и величины вытяжки композиционны волокон. Высказано предположение, что снижение разрывного напряжения, увеличения удлинения при разрыве и низкая проводимость композиционных волокон связано с недостаточно равномерным распределением ОСУНТ в хитозановой матрице. Работы по разработке методов диспергирования углеродных наночастиц в хитозановой матрице продолжаются. С помощью метода рентгеновской дифракции и СЭМ была исследована надмодмолекулярная структура ПЛА микроволокон, полученных методом электроформования. Трубки из ПЛА на основе микро- и нановолокон, полученные методом электроформования, могут быть использованы не только в качестве протезов кровеносных сосудов, но и в конструкциях (кондуитах) для регенерации периферических нервов. Пористая структура стенок трубок на основе нановолокон должна препятствовать проникновению фибробластов в зону диастаза (нарушения сплошности нервной ткани), в тоже время способствовать диффузии ионов K, Ca и других элементов, а также аминокислот в область разрыва периферических нервов, необходимых для их регенерации. Такие матрицы (кондуиты) в виде трубок должны обладать комплексом механических свойств как в сухом состоянии, так и в водных средах, обеспечивающим возможность их целевого использования, а также хирургических манипуляций, и стерилизации. Поэтому в рамках настоящего проекта было проведено изучение кристаллической структуры волокон из ПЛА. В настоящее время отсутствуют данные о структурных особенностях трубчатых образцов, влиянии термической обработки на их структуру и свойства. Поэтому, целью работы являлось исследование структуры микроволокон из ПЛА, а также влияния термической обработки на прочностные и деформационные свойства трубок, полученных на их основе. ПЛА относят к хорошо кристаллизующимся полимерам, о чем свидетельствуют результаты исследований его кристаллической структуры. Это подтверждают и результаты рентгеноструктурных исследований гранул исходного ПЛА, а также пленки, сформованной из раствора, кристаллизация которой происходила в условиях, приближенных к равновесным при температуре 20 °С. На дифрактограммах образцов ПЛА видны рефлексы на углах 2θ = 12.1º, 14.8º, 16.7º, 18.9º, 22.4º, 27.4º, 29.1º, соответствующие отражениям от плоскостей α-формы кристаллической ячейки ПЛА. На дифрактограммах микроволокон, полученных электроформованиеми обработанных при низких температурах, Т = 40 - 60 ºС, можно видеть только размытое гало, что свидетельствует об аморфной структуре этих микроволокон. Термообработка при более высоких температурах, 80 ºС и выше, существенно меняет дифракционную картину, на рентгенограммах появляются узкие дифракционные максимумы разной интенсивности, которые свидетельствует о наличии в термообработанных ПЛА микроволокнах кристаллических областей. Повышение температуры вплоть до 160°С принципиально не меняет дифракционную картину, однако можно отметить закономерное смещение пиков в большие углы, свидетельствующее о сжатии элементарной ячейки – преимущественно в направлениях b и c. Уменьшение размеров кристаллической ячейки в процессе термообработки свидетельствует об уменьшении дефектности кристаллов ПЛА, что, свою очередь, должно приводить к увеличению межмолекулярного взаимодействия. Из анализа приведенных данных можно сделать вывод о хорошо развитой кристаллической структуре микроволокон из ПЛА, подвергнутых термической обработке при температурах выше 80 °С. Микроволокна, в свою очередь, состоят из ламелей, включающих кристаллы α-модификации. Ламеллярная структура подтверждается исследованием поверхности микроволокон методом СЭМ. На поверхности волокон можно видеть значительное количество пор с размерами 100 - 300 нм (рис. 22а), а также ламелей с размерами ~ 20х200 нм. Высота ламелей, около 20 нм, близка к величине размеров кристаллитов микроволокон, определенных по данным большеугловой рентгеновской дифракции (25 – 34 нм). Ламеллярная структура характерна для большинства гибкоцепных полимеров в неориентированном состоянии. Складчатая структура макромолекул, наличие ламелей, препятствуют образованию проходных цепей, соединяющих отдельные элементы структуры. Такая надмолекулярная структура не позволяет реализовать высокие прочностные и упругие свойства полимера. Отметим, высокие прочности достигнуты на волокнах из ПЛА исключительно с фибриллярной структурой.Вторым фактором, снижающим прочность волокон, полученных из раствора методом электроформования, является их высокая пористость. Поры образуются в процессе удаления растворителя из микроструй, при их прохождении от фильеры к приемному электроду. Отметим, что метод электроформования является, по сути, вариантом метода сухого формования волокон. Как известно, большинство волокон, полученных "сухим" формованием из растворов, как правило, характеризуются высокой пористостью. Кристаллизация ПЛА исследовалась также методом ДСК. В процессе нагрева трубки на основе свежесформованных микроволокон из ПЛА наблюдается скачок теплоёмкости при Т = 60ºС, обусловленный увеличением сегментальной подвижности макромолекул при температуре стеклования полимера, что согласуется с данными работ других исследователей. При Т = 95 ºС на кривой можно видеть экзо-максимум, который, как показал рентгеноструктурный анализ, связан с кристаллизацией ПЛА, плавление кристаллитов происходит при Т = 179 ºС. Следует отметить, что плавление кристаллитов микроволокон происходит при более низких температурах, чем плавление кристаллитов гранул и это может быть связано с дефектностью кристаллитов микроволокон, их высокой пористостью. Наиболее термостабильной структурой обладают исходные гранулы ПЛА, при их нагреве вплоть до температуры плавления Т = 191 ºС практически не наблюдается никаких эндо- и экзо- эффектов. Похожая картина наблюдается и для пленки, полученной из раствора, однако, плавление кристаллитов в этом случае наблюдается при Т = 185 ºС, что несколько ниже, чем для гранул ПЛА. Такие различия в значениях температур плавления гранул и пленок, очевидно, связаны с различной дефектностью кристаллитов, а также разной степенью кристалличности, что следует из результатов рентгеноструктурного анализа. Поэтому, в работе проведено дополнительное исследование зависимости прочностных и деформационных характеристик трубок на основе микроволокон из ПЛА от температуры их термообработки. Термообработка приводит к существенному изменению характера зависимостей нагрузка-деформация. При температурах обработки выше 80 ºС резко уменьшается величина деформации образцов, повышается их прочность. Важно отметить, что практически на всех кривых напряжение-деформация наблюдается линейный участок, свидетельствующий о наличии упругой составляющей деформации, ее величина составляет 2.5 – 3.0%, что, как указывалось выше, очень важно для имплантатов сосудов. Максимальной прочностью ~ 3 МПа обладают трубки, обработанные при 90 ⁰С, что более, чем в 10 раз, превышает значения давления, действующего на сосуды человека при прохождении через них потока крови. При этом, образец обладает достаточной эластичностью, позволяющий проводить хирургические манипуляции без его хрупкого разрушения. Эти деформационно-прочностные характеристики обусловлены, помимо укладки волокон, надмолекулярной структурой микроволокон из ПЛА. Как показали дифракционные и ДСК-исследования, при температурах 80 - 100 ⁰С происходит кристаллизация ПЛА, увеличивается его степень кристалличности. Именно это и обуславливает существенное повышение прочности, уменьшение пластической деформации. Дальнейшее развитие кристаллизационных процессов, протекающих при температурах выше 110 ⁰С, приводит к повышению хрупкости трубчатых образцов, что делает невозможным их использование в хирургической практике. Таким образом, проведено исследование зависимости прочностных и деформационных характеристик трубчатых образцов на основе биосовместимого, биорезорбируемого ПЛА от условий термической обработки. Определен оптимальный режим, при котором формируется ламелярная структура микроволокон. Деформационные и прочностные характеристики трубок позволяют их рекомендовать для использования в качестве матриц тканеинженерных препаратов при разработке конструкций для регенерации периферических нервов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В течение второго года работы над проектом особое внимание было уделено разработке методов получения и исследованию диэлектрических и электропроводящих свойств композиционных пленок и волокон на основе биосовместимых полимеров, содержащих в качестве наполнителя одностенные углеродные нанотрубки (ОСУНТ), а также углеродные нановолокна (УНВ).Трубки на основе нановолокон из биосовместимых полимеров могут быть использованы в качестве элементов конструкций (кондуитов) для реконструкции периферических нервов. 1.Для этого были получены композиционные пленки на основе хитозана, содержащие в качестве наполнителя ОСУНТ. Показано, что введение 0,5 мас.% ОСУНТ приводит к уменьшению величины объемного электрического сопротивления пленки с 10(7) Ом*м для чистого хитозана до 10(3) Ом*м для композита, что свидетельствует об образовании кластерной структуры наполнителя. Дальнейшее увеличение содержания ОСУНТ, до 3 мас. %, приближает величину сопротивления к сопротивлению кожных покровов человека или животного, около 0,1 Ом*м. Определение диэлектрической проницаемости и проводимости позволяет прогнозировать совместимость имплантируемой композиционной пленки и кожного покрова. Показано, что диэлектрическая проницаемость чистого хитозана составляет от 6.5 до 4.5 в диапазоне частот от 1 до 10(6) Гц, при добавлении ОСУНТ в хитозановую матрицу существенно повышается величина диэлектрической проницаемости во влажном состоянии до ~ 60, что должно повышать совместимость имплантируемой пленки и кожного покрова, диэлектрическая проницаемость которого составляет ~ 100 (частота 1МГц). Таким образом, результаты комплексного исследования диэлектрических, электрических, и механических свойств композиционных пленок на основе хитозана и ОСУНТ позволяет рекомендовать эти материалы для использования в качестве электропроводящих матриц в тканевой инженерии, а также для исследования влияния электрического поля на пролиферативную активность стволовых и соматических клеток. 2. Исследование влияния электрического поля на пролиферативную активность клеток кожи (фибробластов). Разработана и смонтирована лабораторная установка, позволяющая варьировать токи и электрический потенциал, приложенный к полимерной матрице. Электростимуляция образцов электропроводящих полимерных хитозан/ОСУНТ плёнок проводилась в специально сконструированной ячейке. Было установлено, что наибольшая пролифератиная активность фибробластов человека наблюдался при напряжении 100 мВ. При электростимуляции на образец плёнки хитозан/ОСУНТ подавался П-образный сигнал со сменой полярности с верхней и нижней границей +100 и -100 мВ соответственно. Смена полярности сигнала необходима для уменьшения явлений поляризации электродов ячейки в результате формирования на интерфейсе твердой и жидкой фаз двойного электрического слоя, и для поддержания среднего значения ниспадающего тока на уровне не менее 1мкА. Показано, что электрическое сопротивление системы не увеличивается даже после 4 часов циклирования напряжения. Сигнал тока, протекающего через образец, имеет сложную форму. При подаче напряжения ток моментально принимает максимальное значение, однако затем плавно ниспадает до значений близких к 1 - 2 мкА. Такое поведение связано с наличием двух типов электропроводности в системе: электронной и ионной. Таким образом, проведены первые эксперименты по электростимуляции фибробластов человека, которые показали возможность использования разработанной ячейки для исследования влияния электрического поля на клеточные процессы в электропроводящих матрицах типа хитозан/ОСУНТ и на основе нановолокон из алифатического сополиамида (СПА), модифицированных полипирролом (описание разработки этих материалов СПА/полипиррол было представлено в отчёте за 2019 год). 3. Исследование электропроводящих свойств композиционных волокон на основе алифатического сополиамида и ОСУНТ, полученных методом электроформования Алифатический сополиамид (СПА) - сополимер ε-капролактама (-NH-(CH2)5-CO-) и гексаметилендиаминадипината (-NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO-), обладает высокой биосовместимостью, отсутствием негативного влияния на клетки и ткани живого организма. Растворителем СПА является спиртоводная смесь, что делает процесс формования волокон и пленок экологически безопасными. Материалы из этого полимера не содержат цитотоксичных остатков растворителя, сохраняют структуру и свойства в водных средах в течение длительного времени. Поэтому этот полимер был выбран в качестве модельного объекта для электроформования композиционных нановолокон, содержащих в качестве электропроводящего наполнителя ОСУНТ. Эксперименты по электроформованию показали, что содержание ОСУНТ в растворе выше 2 мас.% препятствует образованию нановолокон. Это может быть связано с повышением жесткости проводящего кластера за счет образования не только преимущественно линейных структур из ОСУНТ, но и значительного числа поперечных проводящих связей, т.е. формированием изотропной структуры кластера при высоком содержании ОСУНТ. Удельная электропроводность нановолокнистого материала из СПА, содержащего 2 мас.% ОСУНТ, составляет ~ 2,12*10(-5) См/м, в то время как аналогичная величина для пористой пленки из чистого СПА составляет ~ 1,87*10(-11) См/м. Таким образом, значения удельной электропроводности для матриц на основе нановолокон из СПА, содержащих 1,0 - 2,0 мас.% ОСУНТ, делает возможным их применение в качестве матриц электропроводящих тканеинженерных препаратов, например, кондуитов для регенерации периферических нервов. 4. Исследование электропроводящих свойств композиционных волокон на основе полилактида (ПЛА) и углеродных нановолокон (УНВ).Композиционные волокна на основе ПЛА и УНВ были получены по расплавной технологии как в ориентированном, так и в неориентированном состоянии. Диаметр УНВ ~ 150 нм, длина нановолокон в диапазоне 5-10 мкм. Процесс получения композиционных волокон состоял из двух стадий: на первой стадии происходила экструзия волокна, а на второй его ориентационная вытяжка. С целью повышения механических свойств полученные композиционные материалы подвергались ориентационной вытяжке в четыре и шесть раз (λ = 4, 6) при температуре 75 ± 5°C. Концентрации наполнителя составляли 0, 1, 3, 5, 7 и 10 масс.%. Электропроводящие свойства композиционных волокон оценивали по величине удельного объемного электрического сопротивления. Было измерено удельное объёмное электрическое сопротивление полученных композиционных волокон У неориентированных волокон при добавлении УНВ образуется две критические области: при концентрациях от 0,5 до 1 мас. % и от 7 до 10 мас. %. Можно предположить, что в первом диапазоне концентраций наполнителя от 0,5 до 1 мас. %, в объеме полимерной матрицы образуется перколяционная сетка, обеспечивающая снижение удельного объёмного сопротивления композиционного волокна на 7 порядков с 10(15) до 10(8) Ом*м. Это позволяет отнести данные неориентированные волокна к полупроводникам. При повышении концентрации УНВ до 10 мас.% сопротивление ПЛА волокон еще снижается на четыре порядка и достигает значения ρv=10(3) Ом*м, Отметим при этом, что уже при введении 1 масс% УНВ можно получить ПЛА волокна, обладающие повышенной прочностью и электропроводящими свойствами, достаточными для использования этих материалов для стимуляции клеточного роста и при разработке электропроводящих кондуитов для регенерации периферических нервов. 5. Композиционные трубки на основе нановолокон из полилактида и ε-капролактона. Композиционные трубки с внутренним диаметром ~ 1,5 мм и толщиной стенки ~ 0,5 мм на основе нановолокон из ПЛА и ε-капролактона (ПКЛ) получали из растворов этих полимеров в хлороформе методом электроформования. Образцы на основе ПЛА после электроформования подвергали термообработке в диапазоне температур 40 - 160°С в изотермическом режиме, время выдержки на воздухе составляло 1 час. Для трубок на основе свежесформованных микро- и нановолокон из ПКЛ дополнительная температурная выдержка не требовалась, так как ПКЛ обладает низкой температурой плавления и уже в процессе электроформования формируется его кристаллическая структура.Также были получены композиционные трубки из ПЛА и ПКЛ: 1) трубка с внутренним слоем из нановолокон ПЛА, которую обрабатывали при температуре 90°С, после чего сверху наносили слой из ПКЛ; 2) трубка, внутренний слой которой состоял из ПКЛ, а внешний из ПЛА, данный образец не подвергался дополнительной термообработке. Наиболее близкими по свойствам брюшной аорты крысы и бедренной артерии кролика, как показали измерения, являются трубки на основе нановолокон из сополимера ПЛА/ ПКЛ=70/30. В настоящее время проводятся эксперименты in vivo на полученных образцах, в которых, по предварительным результатам наилучшими характеристиками по кинетике резорбции и реконструкции нативной ткани показали композиционные трубки, состоящие из внутреннего слоя ПЛА и наружного ПКЛ. 6. Получение углеродные нановолокон из нановолокон полиимида. Ароматические полиимиды (ПИ) всё чаще находят применение при создании материалов биомедицинского назначения благодаря своим высокими прочностными и упругими характеристиками, термо- и крио-стойкости. Полученные на их основе материалы в течение долгого времени сохраняют свои эксплуатационные характеристики. Однако, до настоящего времени остается малоизученной возможность использования жесткоцепных ПИ для создания тканеинженерных препаратов, отсутствуют исследования по электроформованию нановолокон из полимеров этого класса. Целью работы являлись: а) разработка метода получения нановолокон из ароматического ПИ; б) исследование физико-механических свойств и биосовместимости плёночного материала на основе ПИ нановолокон; в) изучение возможности получения электропроводящих углеродных нановолокон методом пиролиза ПИ нановолокон, а также исследование их свойств. Для приготовления растворов жесткоцепной полиамидокилоты (ПАК) на основе 3,3′,4,4′-дифенилтетракарбоновой кислоты (ДФ) и о-толидина (ТД) был использован смешанный растворитель ДМАА-бензол с разным соотношением компонентов и концентрацией полимера в растворе. Использование смешанного растворителя необходимостью удаления растворителя за время прохождения раствора полимера от подающего к принимающему электроду. По достижению концентрации раствора 15 мас.% происходит стабильное формирование волокнистой структуры с развитой пористостью. Диаметр волокон лежит в диапазоне 100-300 нм, средний диаметр составляет 243±72 нм. Материал, полученный в процессе электроформования раствора, был подвергнут процессу ступенчатой термической имидизации с целью получения волокнистого материала, состоящего из волокон ароматического ПИ. Процесс имидизации способствует не только уменьшению диаметра волокон, но и увеличению среднего размера пор с 8,02 мкм до 9,42 мкм. Также незначительно уменьшается удельная поверхность материала. Можно предположить, что параметры структуры полученного материала на основе нановолокон из ароматического ПИ, в частности, диаметр волокон, а также размер пор, позволит их использовать в качестве матриц для клеточных технологий. Полученные материалы можно рекомендовать в качестве тканеинженерных конструкций для регенерации периферических нервов. Материалы на основе ПАК и ПИ являются диэлектриками и их значение поверхностного сопротивления превышает максимально возможное измеряемое значение метода – 600 МОм/квадрат. При карбонизации при Т=700 °C сопротивление падает до значения 3,8*10(5) Ом/квадрат. Это говорит о частичной карбонизации нановолокон и формировании структуры, обладающей высокой электрической проводимостью. При увеличении температуры карбонизации происходит значительное падение величины поверхностного сопротивления, которое становится сравнимо со значением, полученным для материала на основе композитных волокон СПА/ППи, а также углеродных волокон, полученных методом карбонизации ПАН и ГЦ волокон. С использованием культуры дермальных фибробластов человека провели предварительные исследование адгезии и выживаемости клеток при контакте с ПИ и карбонизованными нановолокнами. Вероятной причиной снижения биосовместимости при увеличении температуры обработки ПИ образцов нановолокон более 600°С, то есть когда они становятся электропроводящими, является ломкость волокон. Клетки располагаются в объеме образцов, но при большом увеличении видны острые края и фрагменты волокон, которые могут ухудшать взаимодействие клеток с материалом.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Получены композитные пленки на основе хитозана и одностенных углеродных нанотрубок (ОСУНТ). Проведено исследование их структуры с помощью методов сканирующей электронной микроскопии и рентгеновской дифракции. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что при наполнении хитозановой матрицы ОСУНТ наблюдается изменение морфологии поверхности композитных пленок. Анализ двумерного изображения поверхности композитной пленки и гистограммы распределения частиц по размеру позволяет сделать вывод, что ОСУНТ равномерно распределены в плоскости пленки, шероховатость растет с увеличением концентрации ОСУНТ в диапазоне от 0,1 мас.% до 3 мас.% . В композитной пленке, содержащей 0,5мас. % углеродных нанотрубок, распределение элементов структуры по размерам близко к Гауссовому со средним продольным размером около 50нм, поперечным – около 20 нм. Методом РФЭС проведено исследование химического состава поверхности хитозановой и композиционных пленок. Показано, что C1s РФЭ-спектры хитозановой пленки состоят из трех составляющих: С-Н (285,0 эВ); С-С (286,4 эВ); С-О-Н, С-О-О-Н (288,4 эВ). C1s РФЭ-спектры композитных пленок, содержащих 0,1; 0,5 и 1 мас.% ОСУНТ практитчески совпадают с РФЭ-спектрами хитозановой пленки. Однако, в спектрах образцов содержащих 2,5 и 3,0мас.% ОСУНТ, появляется составляющая С-С в области 283,4 эВ, относящаяся к углеродным нанотрубкам. N1s РФЭ–спектры образцов совпадают, пик соответствует N-H связи (399,0 эВ). Оптимальным для клеточных процессов, адгезии и пролиферации, является наличие в среде как ионной, так и электронной составляющих проводимости. В случае наличия ОСУНТ в поверхностном слое композиционного материала для образцов, содержащих 2-3 мас.% ОСУНТ, электронная составляющая проводимости в поверхностном слое будет выше по сравнению с образцами, содержащими 0,1-2 мас.% ОСУНТ. Полученные результаты представляют несомненный интерес для анализа адгезии и пролиферативной активности стволовых и соматических клеток на композиционных пленках. Композиционные волокна хитозан – PPy были получены окислительной полимеризацией пиррола; FeCl3 в парах мономера на поверхности волокон. Структура композитов исследована методом растровой электронной микроскопии. Показано, что образование PPy слоев на хитозановых волокнах приводит к появлению электропроводности волокон. Проводимость этих слоев, а также их механические характеристики, зависят от условий полимеризации. Тест МТТ (анализ для оценки метаболической активности клеток) показал хорошую биосовместимость композитных пленок хитозан – PPy; эти пленки содержат большее количество жизнеспособных клеток, чем пленки, отлитые из растворов чистого хитозана. Получены из расплава композиционные волокна на основе сополимера L- и D- лактидов с соотношением 96/4., наполненные углеродными нановолокнами. В процессе эксплуатации материалы из полимерных композитов подвергаются действиям статических и динамических нагрузок в течение продолжительного времени. В работе были исследованы механические свойства композиционных LD-ПЛА волокон в режиме длительного нагружения (ползучести). В работе показано, что при приложении нагрузки 30% от разрывной, ненаполненный LD-ПЛА растягивается до 3% за 20 мин эксперимента. Введение 1% УНВ повышает ползучесть LD-ПЛА волокон на 16%. Показано, что при введении электропроводящих частиц более 1% замедляются релаксационные процессы и при максимальном наполнении (Кунв=20%), их скорость снижается в 6 раз по сравнению с ненаполненным ПЛА. Частицы УНВ препятствую проскальзыванию полимерных фибрилл при растяжении друг относительно друга. При приложении нагрузки в рабочем диапазоне (около 30% от разрывной) ползучесть полимерной матрицы увеличивается. При сравнении зависимостей удельного объемного сопротивления плёнок и волокон на основе ПЛА и УНВ, можно сделать вывод, что перколяционный кластер у плёнок образуется при концентрации УНВ в диапазоне 0-3,0 мас.% УНВ. При концентрации УНВ равной 3,0 мас.% удельное объемное сопротивление снижается на 11 порядков до 104 Ом·м. Далее это значение сохраняется и при концентрации равной 5 мас.%. В работе проведено исследование формирования электропроводящего кластера из УНВ в полилактидной матрице. Данные, полученные методами сканирующей электронной микроскопии, рнтгеновской дифракции, а также ДСК, свидетельствуют о кластерной структуре электропроводящего наполнителя, ее изменении при увеличении концентрации УНВ. Был разработан экологически безопасный способ электроформования нановолокон из водного раствора соли полиамидокислоты. Получены композиционные нановолокона на основе ароматического полиимида, содержащие в качестве наполнителя ОСУНТ. Получали водные растворы триэтиламмонийной соли ПАК(СПАК) на основе пиромеллитового диангидрида и 4,4’ диаминодифенилового эфира. Для снижения вязкости и поверхностного натяжения в раствор добавляли этиловый спирт в соотношении с водой 70 / 30 мас. %. Для электроформования использовали раствор СПАК концентрацией 10 мас. %. Полученные нетканые материалы термически имидизовали при 250°C. Полноту прохождения реакции имидизации контролировали методом ИК спектроскопии. Структуру полученного нетканого материала изучали методом сканирующей электронной микроскопии. Проведено исследование структуры и свойств нетканых материалов на основе ароматического полиимида. Получены углеродные нановолокна на основе композиционных нановолокон из ароматического полиимида, содержащих ОСУНТ. Нетканые полиимидные материалы подвергали карбонизации при температурах от 600°C до 900°C в атмосфере азота. В итоге процесса карбонизации были получены углеродные нановолокна. Измерены механические свойства и электрическое сопротивление полученных материалов. Наблюдается устойчивый рост модуля упругости материала с увеличением температуры карбонизации, при этом прочность и предельная деформация после термообработки значительно сокращаются. Сопротивление материала, состоящего из углеродных нановолокон (УНВ), уменьшается с увеличением температуры карбонизации. Отмечено, что проводимость нетканого мата различается в зависимости от преимущественной ориентации углеродных нановолокон: при измерении вдоль волокон (перпендикулярно оси коллектора) зарегистрирована большая электропроводность материала, чем при измерении поперек волокон (вдоль оси). Оценку биосовместимости полученных материалов in vitro проводили методом MTT-теста. Вероятной причиной снижения биосовместимости при увеличении температуры обработки образцов является хрупкость волокон, ухудшающая взаимодействие клеток с материалом. Целью данной работы являлось исследование трубчатых кондуитов с ориентированными вдоль направления роста аксонов волокнистыми наполнителями для замещения дефектов нерва, диастазом, размером 3 и более см. Ранее была разработана технология получения трубчатых матриц с различными геометрическими параметрами (длина, внутренний диаметр и толщина) на основе нано- и микроволокон резорбируемого полимера – поли(L-лактида) методом электроформования, а также технология получения моно- и полифиламентных волокон на основе природного резорбируемого полимера – хитозана методом мокрого формования. Для получения трубчатых матриц использовали поли(L-лактида) (PLA) марки Purasorb PL10 (Corbion Purac, Нидерланды). 15% раствор PLA в трихлорметане с помощью инжекторного насоса подавали через фильеру в электрическое поле с напряженностью Е = 1.5 × 104–4.0 × 105 В/м. Осаждение микроволокон происходило на цилиндрическом электроде диаметром 1.5 мм, скорость вращения которого составляла 1500 об/мин, расстояние между электродами составляло 0,15 м. Далее выполняли термообработку матриц в фиксированном на цилиндрическом электроде состоянии при температуре 90°C в течение 1 ч, что приводило к частичной кристаллизации полимера и улучшению его механических свойств. Толщина стенки матрицы после термообработки составляла 350 мкм. Единственным методом объективной оценки функционального состояния периферических нервов на сегодняшний день остается электронейромиография (ЭНМГ) – метод диагностики, основанный на регистрации и анализе биоэлектрических потенциалов мышц и периферических нервов. Процедура ЭНМГ заключается в воздействии низкоинтенсивных электрических импульсов и фиксации реакции мышцы, иннервируемой этим нервом. Поскольку исследуются сразу несколько двигательных единиц, входящих в состав одной мышцы, то оценивается суммарный потенциал действия всех двигательных единиц М-ответ. Амплитуда М-ответа указывает на количество двигательных единиц в данной мышце, ее снижение может говорить о снижении количества двигательных единиц. Для проведения ЭНМГ животных иммобилизовали на манипуляционном столике, далее рефератный и стимулирующий электроды вводили в m. biceps femoris (двуглавая мышца бедра), заземляющий электрод фиксировали на стопе. Оценка восстановления двигательной функции после регенерации поврежденных седалищных нервов проведена путем определения функционального индекса (SFI). Для этого отпечатки задних лап фиксировали на предварительно подготовленных бумажных полосках: задние лапы животных погружали в раствор красителя в бытовом моющем средстве для предотвращения расплывания отпечатков. После животных опускали с целью их передвижения по бумажным полоскам по заданной траектории. Измеряемыми параметрами (как у нормальных (N), так и у экспериментальных (E) лап), являются длина отпечатка (PL, или длина от кончика самого длинного пальца до пятки), расстояние между пальцами (TS, или расстояние между 1-м и 5-м пальцами) и промежуточным разводом пальцев (IT, или поперечное расстояние между 2-м и 4-м пальцами). SFI вычисляли по следующей формуле.. Согласно формуле, SFI будет равен нулю у интактной конечности, тогда как SFI будет равен 100 у животных с нефункционирующим нервом. Исследование двигательно-координационных нарушений осуществляли с помощью аппаратно-программного комплекса «Ротарод» фирмы Orchid Scientifics (Индия). В основе методики положена способность мелких лабораторных животных удерживаться на вращающемся барабане. Для этого животных помещали в отсек аппарата и в реальном времени изменяли скорость вращения барабана в диапазоне от 8 до 12 ppm. Мотивационным стимулом являлась высота. Время падения с барабана считалось оценкой активности. В результате исследования определены длительность нахождения животного на барабане, скорость вращения барабана в момент падения и посадки животного, характер мотивационного стимула. Изучение восстановления нервно-мышечных функций проводили путем измерения силы захвата объекта конечностями с использованием измерителя силы захвата для мышей и крыс фирмы Orchid Scientifics (Индия). Для измерения указанного параметра в приборе используется цифровой силовой датчик. Датчик силы захвата связан с проволочной сеткой, крепящейся к анодированной базовой пластине. Стандартный сенсор рассчитан на нагрузку до 19.6 H. Животных аккуратно подносили к сетке, пока они не захватят проволоку исследуемыми конечностями. Удерживая туловище параллельно сетке, осторожно оттягивали животное назад от сетки. Скорость должна быть достаточно низкой, чтобы позволить развить сопротивление силе тяги. Значения пикового усилия регистрировали в момент высвобождения сетки. Исследование проводимости нервов Были исследованы трубчатые кондуиты полые и со следующими наполнителями: моноволокна хитозана (MChs), полифиламентные волокна хитозана (PChs), композитные моноволокна хитозана, содержащие 0,5%, 30% и 50% нанофибрилл хитина (Chs-ChNF). Диастаз составлял 3 см. ЭНМГ проводили на 30 и 120 сутки. В первом сроке обследования (через 30 суток) у животных опытных групп наблюдали изменение нервно-мышечной проводимости задних конечностей, заключающейся в значительном снижении амплитуды М-ответа и увеличении латентного периода по сравнению с интактными животными. Во втором сроке (через 120 дней) в группе аутоневральной вставки (АВ) наблюдали восстановление и значительное увеличение амплитуды М-ответа и уменьшение латентного периода. В группах с использованием направляющих кондуитов с различными наполнителями наблюдали следующее: А. Высокое значение амплитуды М-ответа в группах с моноволокнами хитозана по сравнению с группами с полифиламентными волокнами, что говорит о том, что моноволокно оказывает лучшее влияние на направление регенерации аксонов. При этом значения амплитуды в группе с полифиламентыми волокнами составляет 5.1 мВ, что соответствует значениям на 30 сутки, из чего сделан вывод об отсутствии регенерации нерва. Б. Увеличение амплитуды М-ответа при наличии нанофибрилл хитина в составе моноволокон хитозана. Ощутимых различий в амплитудах между группами с различными содержанием ChNF (0,5%, 30% и 50%) не обнаружено. В. Значения амплитуд при использовании моноволокон составляют 10.1-12.5 мВ, что близко по значениям с аутоневральной вставкой, являющейся «золотым» стандартом (12.7-14.9 мВ). Г. По сравнению с полыми трубчатыми кондуитами, наполненные оказывают большее влияние на направление роста, скорость регенерации и миелинизации. Изменению М-ответа может говорить об неравномерной миелинизации нерва, что и наблюдается при использовании полого кондуита. Наличие наполнителей увеличивает площадь поверхности, топографические сигналы. Исследование двигательно-координационных нарушений В результате исследования определены длительность нахождения животных на барабане, скорость вращения барабана в момент падения животного, характер мотивационного стимула. Мотивационным стимулом являлась высота. Время до падения с барабана считалось оценкой активности. Скорость вращения барабана 8-12 ppm. Каждые 5 секунд при условии способности животных удерживаться на барабане увеличивали скорость вращения на 1 ppm. А. Лучшую способность удерживать себя на вращающемся барабане наблюдали у животных в группах с моноволокнами хитозана, что говорит о лучшем двигательном восстановлении за счет лучшей регенерации нервного волокна с сохранением большего количества аксонов. Б. При этом наличие нанофибрилл хитина ускоряет двигательно-координационное восстановление повреждённых конечностей: с увеличением содержания нанофибрилл хитина в волокнистых наполнителях увеличивается степень восстановления. В. В группе полых кондуитов наблюдали вялое движение, отсутствие мотивации и неспособность удерживаться на барабане при скоростях более 8 ppm, то есть восстановление двигательно-координационных функций наблюдается, однако качество уступает группам с моноволокнами хитозана. Г. В контрольной группе животные находились на барабане при оборотах более 12 ppm. Исследование восстановления нервно-мышечных функций Животных аккуратно подносили к прибору, удерживая туловище параллельно сетке, после того как животные хватались за датчик их осторожно оттягивали. Значения пикового усилия регистрировали в момент высвобождения сетки. Результаты исследований представлены в таблице 3. Восстановление нервно-мышечных функций зависит от наполнителей. Наблюдали лучшее восстановление функции задних конечностей при введении в просвет трубчатого канала наполнителей, содержащих нанофибриллы хитина, при это степень восстановление увеличивается с увеличение концентрации последних. Функциональное восстановление при использовании полифиламентных волокон не наблюдали, животные не способны хвататься за объект (сетку) поврежденной конечностью. Полного восстановления как при использовании аутоневральной вставки, так и при имплантировании трубчатых кондуитов не наблюдали (в сравнении с интакстной конечностью). Однако, введение наполнителей в кондуит позволило достигнут результатов близких к результатам с применением метода аутоневральной вставки. Следует отметить, что скорость восстановления функционирования поврежденной конечности влияет на двигательную активность интактной части, так при плохом функционировании поврежденной лапки, ухудшается и состояние неповрежденной в связи с уменьшением подвижности животного. Например, в группах MChs, Chs-ChNF 0.5%, Chs-ChNF 30%, Chs-ChNF 50%, значения силы захвата объекта интактной конечностью выше тех же параметров в группе PLA (полый). Исследование восстановления двигательной активности Оценка восстановления двигательной функции после регенерации поврежденных седалищных нервов проведена путем определения функционального седалищного индекса (SFI) на 120 сутки (таблица 4). Функциональный индекс седалищного нерва SFI будет равен нулю у крыс с неповрежденным нервом, тогда как SFI будет равен 100 у крыс с нефункционирующим нервом. Оценка SFI подтверждает наличие функционального восстановления седалищного нерва при наполнении кондуитов моноволокнами, в то время как значения SFI при наполнении полифиламентными волокнами максимальное, то есть отсутствует восстановление. С увеличением нанофибрилл хитина увеличивается и степень функционального восстановления. И максимально приближение к показателям аутоневральной вставки отмечено в группах MChs и Chs-ChNF 50%. Степень восстановления функционирования при применении полых кондуитов значительно ниже, что подтверждает способность наполнителей ориентированных вдоль роста аксонов влиять как на скорость, так и на количество и направление роста регенерирующих аксонов. Проведение экспериментов in vivo по имплантации трубчатых образцов ок в качестве брюшной аорты крысы и бедренной артерии кролика. Для использования в качестве протеза аорты методом электроформования из водно-спиртового раствора триэтиламмонийной соли ПАК на основе пиромеллитового диангидрида и 4,4’ диаминодифенилового эфира были получены нетканые трубчатые образцы (рис. 6). Были оценены механические характеристики трубок диаметром 1,2 мм и средней толщиной стенки 300 мкм. Прочность и модуль упругости полученных трубчатых протезов сравнимы с параметрами нативных сосудов крыс и превосходят их для человека (Бегун, Афонин, 2004). Модуль упругости полиимидных нетканых трубок составляет 14–19 МПа (против 17 МПа для крыс и 1,0 МПа для человека), а прочность на разрыв — 1,8–2,2 МПа (против 2,3 МПа для крыс и 0,7 МПа для человека). Удлинение до разрыва для полиимидных протезов также сравнимо с удлинением нативных человеческих сосудов — 34% против 42%, соответственно. Матрицами протезировали инфраренальный отдел аорты крыс. Выполняли гистологическое исследование протеза и фрагментов нативной аорты спустя 1, 3 и 6 мес эксперимента. Во всех экспериментах имплантация не сопровождалась значимым кровотечением сквозь стенку протеза или по линии анастомозов. На внутренней поверхности протезов в короткие сроки образуется сплошной монослой эндотелиальных клеток, уменьшающий риск тромбообразования. Гиперплазии интимы, сопутствующей развитию ишемии, не наблюдается даже в районе анастомозов, что является позитивным прогностическим признаком. Присутствие макрофагов и гигантских многоядерных клеток инородных тел в умеренном количестве говорит о средне выраженной реакции макроорганизма на инородное тело, что является проявлением типичной иммунной реакции. Однако обращает на себя внимание появление в ряде случаев кальцинатов на границе между формирующейся неоинтимой и протезом в районе анастомозов, возможной причиной которых может являться низкая скорость интеграции (врастания) тканей нативного сосуда в стенку протеза. Во всех экспериментах стенка сохраняла целостность, признаков появления аневризм не было выявлено, что свидетельствует о стабильности упругих свойств материала.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Было исследовано фазовое состояние композиционных растворов хитозана, содержащие нанофибриллы хитина (НФХ), концентрация которых варьировалась от 0,01 до 30 мас.%. Построены фазовые диаграммы систем хитозан-уксусная кислота – нанофибриллы хитина, из которых следует, что существует область существования одной фазы, отделенная от двухфазных областей бинодалью и спинодаль, зависимостями верхней и нижней критической точек смешения от содержания НФХ в растворе хитозана. При температурах выше бинодали, в диапазоне Т= 25-55 ºС, происходит гомогенизация раствора. Построенная фазовая диаграмма позволили определить область температур раствора и концентраций наполнителя для получения гомогенной композиционного смеси. В зависимости от содержания нанофибрилл хитина начальные температуры смешения изменяются от 25 до 55 ºС, повышение температуры выше 80 ºС вновь приводит к разделению фаз. Высказано предположение, что однофазная смесь представляет собой систему ориентированных макромолекул хитозана, локализованных преимущественно вокруг НФХ. Этому способствует близость химической структуры и высокой адгезии хитина и хитозана. Высокая упорядоченность молекул хитозана повышает плотность полимера, приближает ее к плотности частиц хитина. Нижняя точка смешения, выше которой происходит увеличение плотностной гетерогенности, находится выше 80 ºС, что связано с деструкцией макромолекул хитозана и формированием плотностной гетерогенности.. Оптимальное содержание нанофибрилл хитина и гомогенность полученных композиционных растворов приводит к повышению механических характеристик хитозановых волокон. Проведено исследование реологических свойств растворов, для этого использовали хитозан с молекулярной массой Mm=(1,64-2,1)x105, и степенью деацетилирования DD = 92 % и хитозан с молекулярной массой Mm=(1,25-2,1)x105, и степенью деацетилирования DD = 89 %, которые растворяли в 2 % растворах уксусной и молочной кислот. Концентрация хитозана в растворе составляла 4% в обоих случаях. Исследования проводили на ротационном вискозиметре при Т= 20-80 ⁰С. Разработан режим формования композиционных волокон на основе диаграмм состояния раствор хитозана – НФХ, Получены композиционные волокна с повышенными прочностными и упругими характеристиками. Волокна, содержащие 0,3 -5,0 мас.% нанофибрилл хитина имеют прочность около 240 МПа, модуль упругости 14,5 ГПа. Эти значения заметно превосходят аналогичные параметры, приведенные в литературе [Tomura H, Tsuruta Yu et al. Preparation of chitosan filament applying of new coagulation system. Carbohydr Polym 2004; 56: 205-1 ], а также ранее полученные авторами настоящего проекта [Yudin V. E., Dobrovolskaya I. P., NeelovI. M., DresvyaninaE. N., PopryadukhinP. V., Ivan’kova E.M., ElokhovskiiV.Yu., Kasatkin I. A., Okrugin B. M., Morganti P. Wet spinning of fibers made of chitosan and chitin nanofibrils// Carbohydrate Polymers 108 (2014), pp. 176–182]. Полученные волокна представляют солевую форму хитозана, они набухают в воде, поэтому не могут быть использованы в качестве матриц для клеточных технологий. Термическая обработка солей хитозана переводит их в нерастворимую форму. При этом материал сохраняют высокую сорбционную способность. Такие хитозановые материалы могут быть использованы в качестве биосовместимых и биодеградируемых носителей лекарственных препаратов в медицине и косметологии. На поверхности термомодифицированных хитозановых пленок или губок можно наносить электропроводящие полимеры, такие как полипиррол, без дополнительных стадий подготовки материала, таким образом получая электроактивные биосовместимые материалы с высокой сорбционной способностью. Пленки из растворов хитозана в янтарной, молочной и янтарной кислотах получали формованием раствора через щелевую фильеру на стеклянную подложку.. Толщина пленок составляла 40 ± 10 мкм. Термическую обработку проводили в интервале Т = 80-120 ºС, в течение 3 часов. Повышение водостойкости пленок происходит вследствие разложения солей, образования сшитых структур, а также амидирования хитозана выделяющимися кислотами. Проведенные исследования кинетики набухания термомодифицированных хитозановых пленок в воде показали, что равновесная степень набухания: Q = 8-10 г/г . Исследования МТТ методом пленок, полученных из раствора хитозана в молочной или янтарной кислоте, показали отсутствие их цитотоксичности. Пленки и волокна на основе хитозана, содержащие ОСУНТ. Показано, что введение 0,5 мас.% ОСУНТ в хитозановую пленку приводит к уменьшению величины удельного объемного электрического сопротивления с 107Ом*м до 103 Ом*м. Дальнейшее увеличение содержания ОСУНТ, до 3 мас. %, приближает величину сопротивления к сопротивлению кожных покровов человека или животного, 0,1 Ом*м. Анализ поверхности композитной пленки позволяет сделать вывод, что ОСУНТ равномерно распределены в плоскости пленки, шероховатость поверхности растет с увеличением концентрации ОСУНТ в диапазоне от 0,1 мас.% до 3 мас.% . В композитной пленке, содержащей 0,5мас. % ОСУНТ, средний продольный размер неоднородностей 50 нм, поперечный –20 нм. Методом РФЭС проведено исследование химического состава поверхности хитозановой и композиционных пленок. Показано, что C1s РФЭ-спектры хитозановой пленки состоят из трех составляющих: С-Н (285,0 эВ); С-С (286,4 эВ); С-О-Н, С-О-О-Н (288,4 эВ). C1s РФЭ-спектры композитных пленок, содержащих 0,1; 0,5 и 1 мас.% ОСУНТ практически совпадают с РФЭ-спектрами хитозановой пленки. В спектрах образцов содержащих 2,5 и 3,0 мас.% ОСУНТ, появляется составляющая С-С в области 283,4 эВ, которая свидетельствует о наличии на поверхности хитозановой пленки ОСУНТ, при их содержании более 2,5 мас. %. Получена зависимость удельного электросопротивления пленок хитозана от содержания ОСУНТ. Определение диэлектрической проницаемости и типа проводимости позволяет прогнозировать совместимость имплантируемой композиционной пленки и кожного покрова. Показано, что диэлектрическая проницаемость чистого хитозана в диапазоне частот от 1 до 106 Гц, составляет от 6.5 до 4.5. После добавления ОСУНТ в хитозановую матрицу, существенно повышается величина диэлектрической проницаемости во влажном состоянии до ~ 60, что должно повышать совместимость имплантируемой пленки и кожного покрова, диэлектрическая проницаемость которого составляет ~ 100 (частота 1МГц). Оптимальным для адгезии и пролиферации клеток, является наличие в среде как ионной, так и электронной составляющих проводимости. Показано, что в случае присутствия ОСУНТ в поверхностном слое образцов, содержащих 2-3 мас .% ОСУНТ, электронная составляющая проводимости в поверхностном слое выше по сравнению с образцами, содержащими 0,1-2 мас.% ОСУНТ. Полученные результаты представляют несомненный интерес для анализа адгезии и пролиферативной активности стволовых и соматических клеток на композиционных пленках. Для регенерации периферических нервов, в экспериментах in vivo, были применены трубчатые кондуиты на основе нановолокон из ПЛА, как полые, так и содержащие моноволокна хитозана, содержащие ОСУНТ ( 0,05 - 2,5 мас.%), а также полифиламентные хитозановые волокна, модифицированные полипирролом. Результаты электро-нейромиографии (ЭНМГ) показали, что через 30 суток, у животных опытных групп наблюдалось изменение нервно-мышечной проводимости задних конечностей, значительное снижении амплитуды М-ответа и увеличение латентного периода по сравнению с интактными животными. Через 120 дней наблюдения наилучшие результаты по восстановлению проводимости нервных импульсов показали полые кондуиты и содержащие моноволокна хитозана, обладающие преимущественно ионной проводимостью.