Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Связывание лекарственных препаратов с белками плазмы крови влияет на величину доли свободного препарата в плазме, которая, в свою очередь, определяет их способность проникать через физиологические барьеры. Экспериментальные данные о термодинамических константах связывания химических соединений различной структуры с альбумином необходимы для разработки эмпирических моделей, позволяющих прогнозировать аффинность к альбумину потенциальных лекарственных средств. В ходе выполнения проекта разработана методика спектрофлуориметрического титрования, позволяющая определять константы связывания с альбумином или другими белками для различных соединений в единообразных условиях. С помощью этой методики определены величины константы связывания с альбумином анионов 24 замещенных бензойных кислот и 18 лекарственных препаратов. Проанализирована зависимость аффинности от природы и положения заместителей в молекулах бензойных кислот. Показано, что распределение электронной плотности в ароматическом кольце оказывает определяющее влияние на значения констант связывания, что подтверждается их корреляцией с константами Гаммета заместителей в м- и п-положениях. Найдены количественные соотношения структура – свойство QSAR с двумя и тремя дескрипторами лиганда, позволяющие с хорошей точностью описать значения констант связывания для всех изученных лигандов. При этом не существует удовлетворительной корреляции константы связывания для всех лигандов с единственным дескриптором или экспериментально измеряемым параметром. Для изученных лекарственных препаратов наблюдается корреляция определенных спектрофлуориметрическим методом констант связывания с показателями удерживания на колонке с иммобилизованным альбумином, а также долей связанного с плазмой крови препарата в экспериментах in vivo. Разработана новая методика определения констант и стехиометрии связывания на основе данных, полученных методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Данный метод часто используется для доказательства связывания лигандов с белками на основе сдвига температуры денатурации, но редко применяется для получения количественных данных о константах связывания. Получены ДСК-термограммы процесса денатурации альбумина в присутствии ряда лекарственных препаратов с различной аффинностью и стехиометрией связывания с альбумином: напроксена, варфарина, ибупрофена и изониазида в различных концентрациях. Изучены зависимости температуры максимума и площади пика денатурации от мольного соотношения лиганд:белок, которое варьировалось от 0 до 100. С помощью численного моделирования ДСК-кривых эти зависимости также предсказаны с использованием параметров связывания, определенных в независимых экспериментах классическим методом изотермической титрационной калориметрии. Для проведения расчета разработана компьютерная программа, основанная на модели денатурации с двумя состояниями белка – нативным и денатурированным, позволяющая учитывать произвольное количество равновесий между центрами связывания белка и лигандом. Показано, что данные ДСК при относительно малых концентрациях лигандов хорошо согласуются с результатами расчетов. Отклонения от модели при высоких концентрациях лигандов в случаях напроксена и ибупрофена указывают на то, что альбумин способен связывать несколько дополнительных молекул этих препаратов центрами с низкой аффинностью. Улучшение описания экспериментальных данных было достигнуто путем учета последовательного связывания с двумя различными константами для напроксена и кооперативного связывания с двумя молекулами лиганда одновременно для ибупрофена. На основе зависимости температуры денатурации от концентрации лиганда рассчитана стехиометрия комплексов между изученными лекарственными средствами и альбумином, полностью насыщенных лигандом при его больших избытках. В случае изониазида показано очень слабое связывание с альбумином. Продемонстрировано, что с помощью метода ДСК первые константы связывания, соответствующие заполнению центров с высоким сродством, могут быть определены с точностью, сравнимой или превышающей точность измерений методом изотермической титрационной калориметрии. Помимо этого, можно получить данные о связывании с менее аффинными центрами, недоступные для других методов. Эти данные важны для исследований конкуренции между лекарственными средствами и другими субстратами или между двумя различными лекарственными средствами за центры связывания альбумина. Хорошая воспроизводимость калориметрических кривых делает метод ДСК полезным для скрининга кандидатов в лекарственные средства по сродству к альбумину, а также к другим белкам. По результатам исследования опубликованы 2 статьи в рецензируемых научных журналах: 1. Sedov I.A., Nikiforova A.A., Khaibrakhmanova D.R. Evaluation of the binding properties of drugs to albumin from DSC thermograms. International Journal of Pharmaceutics, 2020, 583, 119362.; https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119362 2. Khaibrakhmanova D.R., Nikiforova A.A., Sedov I.A. Binding Constants of Substituted Benzoic Acids with Bovine Serum Albumin. Pharmaceuticals 2020, 13(2), 30; https://doi.org/10.3390/ph13020030

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Исследования взаимодействия лигандов с центрами связывания белков важны для развития методов компьютерной разработки лекарственных соединений. Точные значения констант связывания необходимы для оптимизации или обучения используемых моделей. Лишь небольшое число экспериментальных методов может быть источником надежных данных для белков с несколькими центрами связывания. Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) используется для доказательства связывания лигандов с белками на основе наличия сдвига температуры денатурации, но редко применяется для получения количественных данных о константах связывания, поскольку простого соотношения между величиной сдвига и константами связывания не существует. Нами была разработана компьютерная программа, позволяющая моделировать ДСК-кривые и находить величины констант связывания, для которых наблюдается наилучшее соответствие экспериментальным термограммам. Мы использовали простую одностадийную модель денатурации с двумя состояниями альбумина – нативным и денатурированным, описывающую равновесие фолдинга-анфолдинга одной константой равновесия. Предполагается, что при сканировании равновесия фолдинга-анфолдинга и связывания лиганда с белком не нарушаются, что верно для достаточно медленных скоростей сканирования. Изучено влияние двух серий лигандов различной природы и аффинности – лекарственных препаратов и замещенных бензойных кислот – на процесс денатурации бычьего сывороточного альбумина (БСА). Определены величины первой и второй последовательных констант связывания с альбумином. Полученные данные показывают, что среди изученных лекарственных соединений аффинность к альбумину уменьшается в ряду фенилбутазон > мелоксикам > хлорпропамид > толбутамид >> ампициллин. При этом фенилбутазон и мелоксикам связываются с двумя центрами связывания БСА с одинаковым сродством. Толбутамид и хлорпропамид имеют более высокое сродство к одному из центров связывания. Ампициллин имеет очень низкую константу связывания с альбумином. В ряду гидроксизамещенных бензойных кислот прочность связывания с альбумином увеличивается в ряду п- < м- < о-изомер. Прочность связывания нитробензойных кислот с альбумином увеличивается от орто- к пара- и мета-изомерам. Преимуществом метода ДСК является хорошая воспроизводимость профилей денатурации белка и особенно максимальной температуры пика денатурации. Кроме того, метод ДСК может служить для скрининга аффинности лигандов при разработке и тестировании новых лекарственных соединений. В ходе выполнения проекта нами создана и опубликована в открытом доступе (http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.4723448) база данных, содержащая литературные экспериментальные значения равновесных констант связывания клинических препаратов и некоторых других органических лигандов с сывороточными альбуминами человека и млекопитающих (в основном бычьего). База данных содержит 1716 значений, собранных из 342 оригинальных литературных источников для 320 различных веществ. Данные были извлечены нами как из статей, так и из уже существующих баз данных по связыванию с белками (ChEMBL и BindingDB). При этом применялись определенные правила отбора данных, например, исключались системы, в которых помимо белка, лиганда и компонентов буфера присутствуют посторонние соединения. База данных содержит подробную информацию об экспериментальных условиях измерений, таких как температура; концентрация белка и лиганда; рН буфера, его состав и концентрация; экспериментальный метод и расчетная модель, используемые для определения константы связывания. Анализ полученных данных показывает большие расхождения между значениями, полученными в различных исследованиях, а также сильное влияние используемого метода и модели связывания. Усреднение значений по нескольким независимым измерениям из базы данных может помочь определить точные значения констант связывания. База данных может быть использована в качестве основы для разработки и валидации новых моделей для расчета констант связывания и для выбора условий в экспериментальных исследованиях связывания с альбумином. Методом молекулярного докинга проанализированы структуры и энергии комплексов альбумина с изученными лигандами. Полученные положения лиганда в центрах связывания были сопоставлены с данными из базы PDB, найдено хорошее соответствие предсказанных и экспериментальных структур комплексов. В ряде случаев метод докинга позволяет успешно предсказать наиболее аффинный центр для изученных лекарственных соединений, но не абсолютную величину энергии Гиббса связывания. Синтезированы и охарактеризованы наночастицы сшитого альбумина с четырьмя лекарствами, обладающими различной аффинностью к альбумину: ранитидином, мелоксикамом, изониазидом и ибупрофеном. Разработаны методики получения наночастиц и определения скорости высвобождения лекарственного соединения из них. Продемонстрировано, что порядок изменения скорости выделения полностью соответствует порядку изменения аффинности препаратов к альбумину. Прочно связывающиеся лекарства (ибупрофен, мелоксикам) имеют тенденцию к пролонгированному выделению из наночастиц, тогда как инкапсулирование низкоаффинных веществ (изониазид, ранитидин) может привести к быстрому выделению вещества. Время выделения половины инкапсулированного ибупрофена из наночастиц составило около 1,5 суток, что говорит о возможности существенного пролонгирования действия препарата с помощью инкапсуляции в наночастицы. По результатам исследования опубликованы статьи в рецензируемых научных журналах: Khaibrakhmanova D.R., Nikiforova A.A., Sedov I.A. Binding constants of drug-albumin complexes from DSC measurements. Thermochimica Acta 2021, 699, 178930; https://doi.org/10.1016/j.tca.2021.178930 Sedov I.A., Khaibrakhmanova D.R., Nikiforova A.A. Binding constants of clinical drugs and other organic ligands with human and mammalian serum albumins. Data 2021, in press.