Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения первого этапа проекта разработаны ключевые элементы электроаналитических платформ на основе нанозимов: синтезированы нанозимы на основе берлинской лазури с функциональными группами для конъюгации с биомолекулами, созданы электрохимические интерфейсы для иммобилизации наночастиц берлинской лазури (на основе алмазных электродов) или конъюгатов нанозим-биомолекула (на основе проводящих полимеров). 1. На основе нанокристаллических покрытий допированного бором алмаза (ДБА) созданы электрохимические интерфейсы с улучшенными характеристиками сигнал/фон. В том числе: - разработан дизайн электродных структур для их интеграции в проточные ячейки типа wall-jet; - оптимизированы условия пробоподготовки алмазной поверхности электрода с целью достижения улучшенной кинетики электродных процессов; - изучена кинетика электродных реакций на поверхности ДБА с поверхностными функциональными группами H-, N-, O- методами циклической вольтамперометрии и спектроскопии электрохимического импеданса; - проведено всестороннее физико-химическое исследование наноструктурированных ДБА электродов методами электронной микроскопии, рамановской спектроскопии, спектроскопии электрического импеданса. Разработанные интерфейсы могут быть использованы как самостоятельно (для регистрации окислительно-восстановительных реакций), так и в качестве основы для электрохимических сенсоров и биосенсоров. Стандартная константа скорости реакции с участием наиболее используемого редокс-медиатора (пара ферри-/ферроцианид) в нейтральных средах для таких интерфейсов всего в 2 раза ниже, чем для традиционно применяемых углеродных электродных материалов. В то же время низкие фоновые сигналы алмазоподобных электродов (в том числе восстановления растворенного кислорода воздуха) и широкие диапазоны рабочих потенциалов в водных электролитах (до 2.5 В) позволяют значительно увеличить соотношение сигнал/фон для соответствующих (био)сенсоров. 2. Предложен способ модификации поверхности углеродных электродов проводящими полимерами на основе ЭДОТа и его производных для создания электрохимических интерфейсов с улучшенной кинетикой электродных реакций. В том числе: - определены оптимальные условия для электрохимической полимеризации проводящего азидометил-этилендиокситиофена в водных электролитах; - проведено всестороннее физико-химическое исследование полимерных покрытий на основе этилендиокситиофена методами электронной микроскопии, рамановской спектроскопии, электрохимическими методами; - исследована кинетика электродных реакций на поверхности модифицированных полимером электродов, определены кинетические константы скорости; - выявлены структурно-функциональные зависимости для полимерных покрытий, позволившие создать электрохимические интерфейсы с улучшенной, по сравнению с немодифицированными электродами, кинетикой электродных реакций. Синтез в водной среде предпочтителен для дальнейшей биоконъюгации молекул с функциональными группами полимера (в том числе азидо-функциональностями), так как позволяет снизить эффекты инактивации биомолекул органическими растворителями. Для покрытия, синтезированного в оптимальных условиях, стандартная константа скорости при рН 7.0 составила 3∙10-2 см∙с-1, что более чем на два порядка величины превосходит таковую для немодифицированных графитовых электродов. С одной стороны, сверхбыстрая кинетика редокс-реакций на разработанных интерфейсах позволит эффективно детектировать редокс-/электрокаталитические метки с помощью соответствующих электрохимических биосенсоров. С другой стороны, эффект увеличения стандартной константы скорости на несколько порядков может быть независимо использован для улучшения электрохимических свойств графитовых электродов. 3. Синтезированы функционализированные нанозимы-метки с пероксидазной активностью на основе композита берлинская лазурь/проводящий полимер (полианилин/политиофен/их производные): - осуществлен синтез, аналогичный каталитическому, наночастиц берлинской лазури с функциональностями -NH2, -B(OH)2, -N=N=N; - для нанозимов с различными функциональными группами установлен фазовый, химический, гранулометрический состав; - показана возможность контроля размера и каталитической активности нанозимов на стадии их синтеза; - продемонстрирована высокая каталитическая активность нанозимов в физиологических рН, а также отсутствие оксидазной активности в присутствии восстанавливающих субстратов пирогаллола, катехола, гваякола, орто-дианизидина и тетраметилбензидина; - показана принципиальная возможность получения конъюгатов нанозимов с олигонуклеотидными последовательностями по «клик»-механизму. Каталитический синтез берлинской лазури обеспечивает высокую пероксидазную активность результирующих нанозимов, превосходящую таковую для природного фермента в идентичных условиях (каталитическая константа – более 1500 с-1). Использование замещенных проводящих полимеров в составе нанозимов, с одной стороны, обеспечивает стабилизацию катализатора без снижения его активности, с другой стороны, - функционализацию поверхности для конъюгации меток с биомолекулами на стадии синтеза. Простота выделения, стабильность, высокая каталитическая активность в физиологических растворах, отсутствие оксидазной активности позволяют рассматривать синтезированные нанозимы в качестве более надежной метки для электрохимических (био)сенсорных платформ.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения второго этапа Проекта проведено всестороннее исследование редокс и электрокаталитической активности нанозимов «искусственная пероксидаза» на различных интерфейсах: допированном бором алмазе, графитовых электродах, в составе композитных покрытий берлинская лазурь/углеродные наноматериалы, а также в составе коньюгатов с олигонуклеотидными цепочками. Разработаны прототипы электроаналитических (био)сенсорных платформ на основе электрокаталитических меток-нанозимов «искусственная пероксидаза» для детекции широкого круга аналитов: активных форм кислорода, метаболитов углеводного обмена, носителей генетической информации. 1. С целью создания высокоэффективных электрохимических биосенсоров осуществлено всестороннее исследование электроактивности и (электро)каталитической активности нанозимов «искусственная пероксидаза». С использованием проточных ячеек типа wall-jet проведено исследование кинетики реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами, установлены вклады кинетически- и диффузионно-контролируемых компонент регистрируемого тока. Установлено, что электрохимические константы для каталитически синтезированных нанозимов (1.1 10-2 cм·с-1) не уступают или даже незначительно превосходят таковые для каталитически синтезированных наноразмерных покрытий. Исследована селективность наноразмерных катализаторов на основе берлинской лазури. Показано, что селективность восстановления пероксида водорода в присутствии прочих гидропероксидов (пероксида мочевины, пероксида метилэтилкетона, трет-бутилгидропероксида, гидропероксида кумола) не уступает или незначительно уступает таковой для пероксидазы из корней хрена (в условиях гомогенного катализа). Полученные результаты свидетельствуют о ферментативной специфичности нанозимов «искусственная пероксидаза». Разработан сенсор на пероксид водорода с рекордной чувствительностью на основе каталитически синтезированных нанозимов «искусственная пероксидаза» и углеродной сажи. Методом спектроскопии электрохимического импеданса установлено, что совместная иммобилизация нанозимов с углеродными наноматериалами позволяет улучшить транспорт электронов в чувствительном слое. Коэффициент чувствительности для полученных сенсоров составляет более 1.1 А∙М-1∙см-2, что на 30% выше, чем для отдельно иммобилизованных нанозимов, и на 70% выше, чем для каталитически синтезированных покрытий. Разработаны электрохимические сенсоры энзим-нанозим на основе ферментов оксидаз (глюкозооксидазы или лактатоксидазы) и наночастиц берлинской лазури, совместно иммобилизованных в полимерные матрицы полимеров Нафион или γ-аминопропилтриэтоксисилана. Предложенные протоколы иммобилизации фермента и трансдьюсера в один шаг могут быть адаптированы для технологических циклов массового производства биосенсоров по технологии drop-casting. Для глюкозных биосенсоров энзим-нанозим, изготовленных с применением сажи, соотношение коэффициентов чувствительности к глюкозе и пероксиду водорода в 5 раз выше, чем для подобных биосенсоров на основе сплошных покрытий берлинской лазури. Это позволяет достичь рекордных коэффициентов чувствительности биосенсора – до 0.32 ± 0.02 А∙М-1∙см-2. На основе биосенсоров энзим-нанозим разработаны амперометрические тест-полоски для низкопотенциального определения глюкозы в микролитровых объемах (до 2 мкл). Показана применимость тест-полосок для низкопотенциальной детекции глюкозы в сложных биологических матрицах на примере сыворотки крови человека. 2. В рамках создания платформ для электрохимических и спектроэлектрохимических исследований разработаны высокоэффективные пероксидные сенсоры на основе допированного бором алмаза (ДБА) и берлинской лазури с улучшенным соотношением сигнал/фон. Реализованы различные подходы к модификации поверхности ДБА-Н электродов электрокатализатором: электрохимического осаждения, химического синтеза при потенциале разомкнутой цепи и адсорбции наночастиц берлинской лазури. Линейный диапазон определяемых концентраций H2O2 для ДБА-Н электродов, модифицированных различными способами, охватывает четыре порядка величины: от 1∙10-7 до 1∙10-3 М. При этом наибольший коэффициент чувствительности достигается для покрытий с максимальной электрохимической константой в реакции восстановления пероксида водорода (0.7 10-2 cм·с-1): для интерфейса ДБАǀнанозимы коэффициент чувствительности в режиме проточно-инжекционного анализа составляет 0.14 A∙M-1∙см-2. С опорой на возможность селективного низкопотенциального определения Н2О2 в присутствии кислорода на поверхности берлинской лазури и высокие перенапряжения фоновых реакций на ДБА, разработан сенсор с улучшенным соотношение сигнал/фон. Интерфейсы ДБА-Нǀнанозимы обеспечивают двадцатикратное снижение токов восстановления кислорода, что приводит к десятикратному увеличению отношения сигнал/фон соответствующих модифицированных электродов, по сравнению с датчиками на основе графитовых электродов. Предложен метод стабилизации наночастиц берлинской лазури на поверхности допированного бором алмаза гексацианоферратом никеля. Сенсор на основе стабилизированного покрытия сохраняет до 80% первоначального оклика на 50 мкМ Н2О2 в режиме проточно-инжекционного анализа после 350 измерений (около 10.5 часов), то есть в 5-6 раз дольше, чем сенсор на основе нестабилизированных наночастиц. 3. Разработан прототип безреагентного электрохимического ДНК/РНК-сенсора с использованием электрокаталитических меток на основе нанозимов «искусственная пероксидаза». С целью создания универсальной основы для электрохимических ДНК-сенсоров разработаны интерфейсы на основе проводящих полимерных покрытий азидометил-ПЭДОТа, обеспечивающие возможность ковалентной пришивки заданных олигонуклеотидных последовательностей клик-реакцией, а также эффективную регистрацию электрохимического сигнала. Установлено, что модификация электродов азидометил-ПЭДОТом способствует повышению электроактивности редокс-медиаторов в нейтральных рН до 2000 (k0 для [Fe(CN)6]3-/4- при рН 7.0 составила 2.3∙10-2 см∙с-1). Чувствительность определения нанозимов «искусственная пероксидаза» на основе берлинской лазури на разработанных инерфейсах в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии улучшена до 200 раз. Исследована электроактивность нанозимов (композитных наночастиц берлинская лазурь/азидометил-ПЭДОТ) и конъюгатов нанозим-олигонуклеотид. Установлено, что доля электроактивной берлинской лазури в составе иммобилизованных наночастиц с азидо-группами достигает 50 %, а для иммобилизованных биоконъюгатов фракция электроактивной берлинской лазури – не более 15%. Методами циклической вольтамперометрии и квадратно-волновой вольтамперометрии установлено, что удаленность нанозима-метки от 5′ конца незначительно влияет на электроактивность конъюгата. Клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения осуществлена конъюгация олигонуклеотидных последовательностей, комплементарных HULC (High Up-regulated in Liver Cancer), с азидо-функциональностями полимера на поверхности электродов. \Установлено, что применение покрытий на основе замещенного ПЭДОТа, помимо возможности конъюгации по клик-механизму, за счет π-сопряженной электронной системы основной цепи обеспечивает отталкивание отрицательно заряженных олигонуклеотидных цепочек и препятствует адсорбции и неспецифическому связыванию, тем самым повышая селективность сенсора. Исследованы аналитические характеристики ДНК-сенсоров для низкопотенциальной (0 В) детекции олигонуклеотидов HULC, меченных электрокаталитическими метками-нанозимами «искусственная пероксидаза». Установлено, что минимальная детектируемая концентрация конъюгатов ДНК-нанозим в растворе – 0.1 нМ. Результаты работы по созданию прототипов ДНК-сенсоров освещены в СМИ (https://nauka.tass.ru/nauka/11315137, https://indicator.ru/chemistry-and-materials/novaya-osnova-povysila-effektivnost-raspoznavaniya-raka-biosensorami-06-05-2021.html; https://rg.ru/2021/05/06/osnova-dlia-raspoznavaniia-raka.html).