Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Известно, что трансмембранный потенциал митохондрий (ΔΨmito = 150-180 mV) значительно выше потенциала других органелл и клеток (ΔΨplasma = 30-60 mV) и что особенно привлекательно, митохондриальный трансмембранный потенциал солидных опухолевых клеток (карциномы и саркомы) выше трансмембранного потенциала митохондрий здоровых клеток. Эта разница в строении и физико-химических особенностях между митохондриями злокачественно трансформированных и здоровых клеток открывает возможности для избирательности действия липофильных катионных соединений. В настоящее время липофильные делокализованные мембранопроникающие катионы активно исследуются в качестве средств избирательной доставки цитотоксических соединений в митохондрии раковых клеток. Задача исследования, рассматриваемая в рамках проекта, заключалась в синтезе и изучении молекулярных механизмов действия липофильных молекул с низкой молекулярной массой, которые могут избирательно накапливаться внутри митохондрий и применяться в качестве целевых противоопухолевых агентов, вызывая митохондриальную дисфункцию опухолевых клеток. В проекте за отчётный 2019 год, впервые были получены конъюгаты пентациклических тритепеновых кислот (бетулиновой, урсоловой, олеаноловой и глицирретовой кислот) с делокализованным липофильным катионным фрагментом F-16, представляющим собой (E)-4-(1H-индол-3-илвинил)-пиридиний бромид. Митохондриотропное соединение F-16 использовано как вектор избирательной доставки цитотоксичных тритерпеноидов в митохондрии опухолевых клеток. Следует отметить, что к настоящему времени в отличие от известных трифенилфосфоний содержащих противораковых лекарственных агентов, потенциал катионного соединения F-16 в качестве средства доставки цитотоксических молекул в митохондрии опухолевых клеток исследован всего в нескольких работах. Реализован дизайн и синтез библиотеки из 14 соединений, в которых тритепеновое ядро лупанового, урсанового, олеанового и глицирретового типа связано при С-3 и/или С-28 и С-30 атомах с катионной группой F-16 линейными полиалкановыми или полиэтиленгликолевыми спейсерами. Целевые соединения получены в 2-4 стадии из доступного растительного сырья бетулина и коммерчески доступных тритерпеновых кислот с использованием простых и дешевых реагентов. Простой в препаративном выполнении синтез позволяет получать целевые соединения в любых количествах, необходимых для научных и медицинских исследований. Разработана рациональная схема синтеза для связывания углерод-углеродной связью соединения F-16 с молекулами тритерпеновых кислот при С-2 атоме кольца А. Исходными соединениями в этой схеме послужили С-2 аллильные производные тритерпеноидов, которые были получены взаимодействием аллилбромида с енокситриэтилборатами калия, генерированными из 3-кетотерпеноидов под действием KN(SiMe3)2−Et3B, в 1,2-диметоксиэтане. Ключевые стадии схемы включали стереоселективное восстановление С-3 кетогруппы тритепеноида под действием NaBH4, в присутствии СеСl3/7H2O (метод Луше), гидроборирование двойной связи в аллильном заместителе тритерпена с использованием комплекса BH3•ТГФ с последующим окислением борорганического соединения в соответственный спирт, трансформацию спирта в мезилат и нуклеофильное замещение мезильной группы с использованием LiBr с получением целевого тритерпенового бромида. Выполнен первичный биологический скрининг новых ионных соединений и проведен анализ структура - цитотоксическая активность. При биологическом тестировании in vitro синтезированных конъюгатов, на трех видах опухолевых линий человека (U937, Jurkat, K562) все новые соединения (IC50, 0.57–4.19 микромоль, U937) независимо от структуры тритерпенового ядра существенно (≈ в 100-200 раз) превзошли по противоопухолевой активности образцы сравнения - бетулиновую кислоту (IC50, 149.29 микромоль, U937) и соединение F16 (IC50, >500 микромоль, U937). Ковалентное связывание двух цитотоксических соединений (бетулиновой кислоты и F-16) привело к значительному синергетическому эффекту в отличие от использования этих соединений в виде механической смеси.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Данный проект направлен на создание новых митохондриально-направленных противоопухолевых лекарственных средств на основе доступных природных соединений – пентациклических тритерпеноидов лупанового, урсанового и олеанового ряда. В качестве средства адресной доставки цитотоксических природных молекул к их биологической мишени – митохондриям выбран липофильный мембранопроникающий катион F16 (E-4-(1H-индол-3-илвинил)-N-метилпиридиний йодид). В отчетном году в соответствии с запланированными исследованиями были получены следующие основные результаты: 1. Разработан эффективный подход к синтезу гибридных молекул “тритерпеноид – F16”, в которых тритерпеновое ядро связано с катионным фрагментом F-16 при С-2 атоме кольца А фенилэтинильным мостиком. В качестве исходного соединения использован (E)-4-(1H-индол-3-илвинил)пиридин (нейтральный предшественник F16), который вовлекли в CuI-катализируемую реакцию сочетания по Ульману-Голдбергу с 1.4-дийодбензолом. Продукт реакции с йодфенильным заместителем в индольном фрагменте (E)-4-(1H-индол-3-илвинил)-пиридина ввели в реакцию кросс-сочетания по Соногашира с С-2 пропаргильным производным бетулоновой кислоты. Последующая кватернизация пиридинового кольца под действием CH3I дала целевой конъюгат с высоким выходом. Митохондриально нацеленный катионный фрагмент F16, связанный с тритерпеновым ядром в новом соединении, предположительно, может усилить биодоступность и противоопухолевую активность своего прототипа - нативной бетулиновой кислоты. 2. Среди природных и синтетических производных пентациклических тритерпеноидов большой интерес в медицинской химии вызывают соединения, содержащие в кольце А несколько гидроксильных групп. Полигидроксилированные производные тритерпеновых кислот известны широким спектром фармакологических свойств, включая высокую противоопухолевую активность в отношении различных типов рака. В связи с этим осуществлен синтез конъюгата коммерчески доступной азиатиковой кислоты с митохондриально направленным катионным соединением F16 и успешно реализован многостадийный синтез конъюгата F16 c тритерпеноидом лупановой структуры, содержащим полигидроксилированное кольцо А в тритерпеновом скелете. Образцы полученных новых соединений переданы для биологических исследований на противоопухолевую активность. 3. Исследован молекулярный механизм цитотоксичности конъюгатов бетулиновой кислоты с проникающим катионом F16. Проведена оценка влияния конъюгатов бетулиновой кислоты F1, F6 и F8 на выживаемость здоровых клеток тимоцитов крыс методом проточной цитометрии и оценена роль митохондрий в цитотоксическом эффекте конъюгатов на эти клетки. Исследованы также эффекты конъюгатов на ряд основных функциональных параметров митохондрий, изолированных из печени крыс. Экспериментами in vitro на тимоцитах крыс показано, что все полученные производные F16-бетулиновой кислоты проявляют более чем 10-кратную цитотоксичность по сравнению с бетулиновой кислотой и катионным соединением F16. Конъюгаты демонстрировали направленное на митохондрии действие, вызывая сверхпродукцию супероксида и снижая митохондриальный потенциал клеток. Эксперименты на изолированных митохондриях печени крысы выявили способность конъюгатов дозозависимо снижать мембранный потенциал органелл, а также интенсивность дыхания и окислительного фосфорилирования, что сопровождалось увеличением продукции в митохондриях перекиси водорода. Было показано, что такое действие F16-производных бетулиновой кислоты может быть связано с несколькими эффектами: реверсия АТФ-синтазы, изменение активности комплексов дыхательной цепи и проницаемость внутренней митохондриальной мембраны. Все исследуемые соединения также продемонстрировали способность индуцировать агрегацию изолированных митохондрий печени крысы. На модели липосом лецитина было показано, что конъюгат F6 (2 μМ) индуцирует проницаемость мембран везикул для флуоресцентного зонда сульфородамина B. Было обнаружено также, что высокие концентрации (25 μМ) производного F6 вызывают динамические процессы в липосомальных мембранах, приводящие к агрегации и/или слиянию мембран везикул. Биологические испытания проведены в Марийском Гос. Университете, г. Йошкар-Ола; Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Моск. обл.; Институте биофизики клетки РАН, Пущино, Моск.обл.