Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе первого года выполнения совместного проекта российской стороной от немецкого партнера были получены векторные конструкции, кодирующие бактериальный белок инкапсулин. Анализ клеток HEK 293, трансфецированных данными плазмидами показал наличие наночастиц в цитоплазме клеток, а также наличие повышенного уровня железа. Более того, методом ПЭМ с энергодисперсионным анализом удалось показать наличие атомов железа в областях, соотвествующим наночастицам. Проведенные исследования магнитных свойств показали наличие ферримагнитной компоненты в клетках, что свидетельствует о наличии упорядоченной фазы. Также МРТ исследования показали, что стволовые клетки, несущие ген инкапсулина способны контрастировать МРТ изображения в Т2 взвешенном режиме, за счет сокращения времени Т2 релаксации, а значит, потенциально, могут быть визуализированы неинвазивно в организме с помощью МРТ. Была проведена работа по выделению и харакетристике мезенхимальных стволовых клеток. Показано, что профиль экспрессии клеточных маркеров, используемых в работе клеток соответствует профилю экспрессии клеточных маркеров мезенхимальных стволовых клеток. Также показана возможность дифференцировки полученных клеток в адипоциты и остеокласты. Совокупность полученных данные позволяет однозначно отнести используемые клетки к мезенхимальным стволовым клеткам. Далее нами были реализованы два подхода по получению клеточных линий стволовых клеток, экспрессирующих инкапсулины: 1) транзиентная котрансфекция плазмидами; 2) лентивирусная трансдукция. Первый подход был успешно осуществлен, однако эффективность трансдукции была очень низкой вне зависимости от параметров и не превышала 1%. Тем не менее на полученных клетках удалось визуализировать наличие флуоресцентно меченных инкапсулинов и задетектировать изменение времени Т2 релаксации. Для реализации второго подхода был произведен редизайн представленных плазмид, что встроить их в генетическую конструкцию вируса. Отдельно была проведена трансфекция стволовых клеток лентивирусами, содержащими зеленый и красный флуоресцентные белки, что позволит визуализировать клетки после введения в организм животных.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе работ в 2020 году были проведены работы по характеристике железосодержащих наночастиц, синтезируемых внутри инкакпсулинов. Разработаны и собраны лентивирусные конструкции для получения клеточныхлиний мыши и человека стабильно экспрессирующие инкапсулины и белок переносчик железа. Показана эксперсиия генов инкапсулинов в стволовых клеткахчеловека и мыши. Основные результаты проекта за 2020 год: 1. С помощью методов электронной микроскопии и дифракции электронов было обнаружено, что железосодержащие наночастицы, образующиеся в инкапсулинах после инкубирования трансфецированных клеток с солью Мора, характеризуются аморфной структурой и обладают размерами 30+/-4 нм в случае наночастиц Qt инкапсулинов и 27+/-3 нм в случае Mx. Элементный рентгеноспектральный анализ позволил картировать сигналы различных атомов в исследованных образцах наночастиц инкапсулинов. Так, наночастицы состояли в основном из атомов железа, кислорода и фосфора. 2. Характер изменения намагниченности последних позволил сделать вывод о ферримагнитной природе наночастиц и свойственном им явлении гистерезиса. Намагниченность насыщения оказалась равной 7 emu/g, коэрцитивная сила - 10 мТ, а температура блокировки - около 200К. Значения r2 и r2* релаксивности, определенные с помощью метода МРТ, составили 8,5 мм-1с-1 и 101,2 мм-1с-1 соответственно, что в 10 раз превышает значения релаксивности для ферритина. 3. Показано, что стволовые клетки человека и мыши после трансдукции лентивирусными векторами, несущими ген инкапсулина и белка переносчика железа, не погибают при инкубации с солью Мора вплоть до концентрации 5 мМ 4. Методами окраски по Перлсу и просвечивающей электронной микроскопии получены изображения инкапсулинов,экспрессируемых в стволовых клетках человека и мыши. Показано, что инкапсулины локализаются преимущественно в цитоплазме и клеточном ядре

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проведена визуализация наночастиц внутри инкапсулинов в стволовых клетках, несущих ген инкапсулинов Mx и Qt. Средний диаметр этих структур составляет 32±4 нм для инкапсулинов, образующихся в hAD-MSCs-Qt, и 21±2 нм для инкапсулинов, образующихся в hAD-MSCs-Mx. Также показано, что экспрессия инкапсулинов снижает время Т2 релаксации клеток. Время релаксации T2 для hAD-MSCs-Mx после 24 ч инкубации с 2 мМ солью Мора составило 234 ± 18 мс, а для hAD-MSCs-Qt 115 ± 12 мс, время релаксации T2 интактных МСК после инкубации с 2 мМ солью Мора составило 545 ± 29 мс. Была проведена оценка накопления железа в клетках. Полученные микрофотографии показывают, что окраска hAD-MSCs-Qt более выражена по сравнению с hAD-MSCs-Mx: депозиты железа, окрашенные Прусским синим, регистрируются практически во всех клетках. В контрольных клетках подобная окраска не наблюдается. Полученные клетки hAD-MSCs-Qt были введены крысам стереотаксически и интраартериально, и в обоих случаях удалось обнаружить места накопления стволовых клеток методом МРТ. На МРТ изображениях мозга, полученных в режиме SWI через 30 минут после стереотаксического введения hAD-MSCs-Qt , четко различимы гиподенсивные области. Данные области по своей локализации соответствуют областям накопления депозитов железа, детектируемых при окраске срезов мозга Прусским синим, а также областям локализации флуоресцентного сигнала GFP и RFP в клетках. Было установлено, что через 7 дней после стереотаксического введения hAD-MSCs-Qt и hAD-MSCs-RFP МР сигнал, получаемый от наночастиц в инкапсулинах hAD-MSCs-Qt, по-прежнему сохранялся, в то время как на МРТ изображении, полученном после введения hAD-MSCs-RFP виден только небольшой сигнал, по всей видимости обусловленный железом эритроцитов из поврежденного капилляра. На изображениях, полученных методом конфокальной микроскопии, визуализируются hAD-MSCs-RFP с ярким флуоресцентным сигналом, однако, депозиты железа методом окраски по Перлсу, по-прежнему, не выявляются. В противоположность этому, после введения hAD-MSCs-Qt области накопления железа четко визуализируются, по своей локализации полностью соответствуют распределению МР сигнала и флуоресцентного сигнала. В случае интраартериального введения на МРТ изображениях сигнал от наночастиц инкапсулинов в hAD-MSCs-Qt точечно визуализируется и диффузно распределен в паренхиме мозга. Наличие hAD-MSCs-Qt хоть и может быть визуализировано с помощью МРТ, однако единичные гиподенсивные пиксели могут быть и артефактами изображения или локальными сосудами, несущими венозную кровь, насыщенную дезоксигемоглобином. Для подтверждения наличия именно стволовых клеток с областей, соответствующих гиподенсивным очагам, были получены срезы и проведена конфокальная микроскопия. На микрофотографии области среза можно наблюдать сигнал в канале, соответствующем флуоресценции RFP, содержащегося в стволовых клетках, а также можно отметить, что часть стволовых клеток локализована в просвете сосудов, которые были дополнительно окрашены первичными антителами против RECA-1. Кроме того, методом лентивирусной трансдукции была дополнительно получена клеточная линия карциномы молочной железы мыши 4T1-Qt со стабильной экспрессией генов, кодирующих вышеописанную инкапсулиновую систему QtEncFLAG-QtIMEF и трансмембранный переносчик бивалентных металлов Zip14. Было показано, что динамика роста опухолей из интактных и трансгенных клеток статистически достоверно не отличались между собой. Через 19 дней после имплантации клеток мышам системно вводили субстрат двухвалентного железа для достижения лучшего накопления железа в инкапсулинах. Было показано наличие хорошо различимых гиподенсивных областей в опухолях, смоделированных из трансгенных клеток, через 24 ч после введения препарата двухвалентного железа. До системного введения мышам препарата двухвалентного железа гиподенсивных областей на МРТ изображении опухоли, смоделированной из трансгенных клеток, не наблюдалось. Таким образом, можно заключить, что клетки линии 4T1-Qt не иммуногены и успешно приживаются с образованием подкожных опухолей, а наличие трансгенных последовательностей не влияет на рост клеток in vivo.