Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Вирусные родопсины были впервые обнаружены в так называемых гигантских вирусах несколько лет назад, однако до сих пор никому не удавалось изучить механизм функционирования этих белков, описать их структуру и выяснить функциональное предназначение. Гигантские вирусы (Giant Viruses) — огромные вирусы размером с бактерию. Они настолько велики, что их можно наблюдать даже с помощью обычного оптического микроскопа. Гигантские вирусы инфицируют клетки водорослей, выделяющих кислород и ответственных за поддержание экологического баланса в природной среде Мирового океана. Поэтому изучение такого рода вирусов представляет огромный интерес с точки зрения вопросов экологии. В общем и целом проект направлен на то, чтобы проанализировать функцию и механизм работы белков, представляющих это семейство. А затем с помощью методов молекулярной динамики и мутагенезе, основанном на структурных данных, предложить такие формы белков, которые бы нашли применение в оптогенетике, технологии по манипуляции нервными клетками с помощью света. Весь комплекс работ на три года разбит на ключевые модули. В 2019 году проходила работа над характеризацией белков дикого типа, представляющих семейство. По проекту выполнены работы по наложению последовательностей группы вирусных родопсинов, произведено клонирование в плазмиды, позволяющие экспрессировать целевые белки в клетках Escherichia coli. После оптимизации процедуры экспрессии произведена очистка белка. После отработки протоколов очистки было увеличено количество производимой биомассы, и белок начал нарабатываться в препаративных масштабах. Произведены спектроскопические и структурные исследования белков. Для решения структуры белок кристаллизовался (производился подбор условий, дающих кристаллы наилучшего качества), и с кристаллов снималась рентгеновская дифракция. По полученным дифракционным изображениям создавалась модель структуры белка (получена с разрешением не хуже 3А). Также с целевыми белками проведены функциональные тесты, как в клетках Escherichia coli, так и в чистых системах (белково-липидных везикулах). Электрофизиологические измерения проведены методом локальной фиксации потенциала, а также регистрацией токов на оптически черной мембране. Основными результатами этапа проекта следует считать отработанные протоколы экспрессии и очистки целевых белков, дающие хороший выход функционального белка, определенные спектросокпические параметры (включая параметры переходных состояний фотоцикла). По результатам структурного анализа определены ключевые аминокислоты, которые являются кандидатами на мутагенез для следующих этапов проекта. Результаты электрофизиологических экспериментов показывают, что для тестов в клеточных линиях млекопитающих генетическая конструкция для экспрессии требует дополнительной оптимизации, с целью доставки исследуемых белков на плазматическую мембрану клетки в бОльшем количестве. Аггрегированные результаты сведены в публикацию Unique structure and function of viral rhodopsins, опубликованную в журнале Nature Communications. Поставленные задачи первого года проекта выполнены полностью.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
При анализе структуры OLPVRII, полученной в ходе работ за 2019 год были выявлены ключевые аминокислоты для функции белка, а именно E42, D75, R29, F24, L28, E26, R36, W203, N40, D124, R183. Для изучения влияния этих аминокислот на функцию белка были получены нуклеотидные конструкции, кодирующие мутанты E42Q, D75N, R29E, F24A/L28A, E25A/W203A/R36A, N40A, N40L, D124N, D124N/R183Q белка OLPVRII. Мутанты E42Q, D75N, R29E, F24A/L28A, E25A/W203A/R36A были экспрессированы и очищены. Проведена оптимизация протокола очистки белков OLPVRII и OLPVR1. Проведена спектроскопическая характеризация мутантов OLPVRII E42Q и D75N, измерены их спектры поглощения и динамика фотоцикла. Для спектроскопической характеризации мутантов OLPVRII E42Q и D75N, были измерены спектры поглощения препаратов в диапазоне от 250 до 750 нм. Спектр поглощения дикого типа белка OLPVRII имел максимум поглощения на 515 нм, спектр мутанта E42Q практически не отличался от спектра белка дикого типа, тогда как для мутанта D75N наблюдалось значительное смещение поглощения ретиналя в красную сторону. В экспериментах по флеш-фотолизу была измерена динамика поглощения белками после облучения их вспышкой лазера на характерных длинах волн 410, 510 и 560 нм. Для мутанта D75N было продемонстрировано отсутствие М-состояния с характерным поглощением на 410 нм, подтверждая то, что D75 является контрионом Шиффова основания и акцептором протонов в процессе фотоцикла. Для мутанта E42Q было обнаружено замедление распада M-состояния, что неопровержимо свидетельствует о том, что аминокислота E42 является донором протона для Шиффова основания в процессе фотоцикла. Дополнительные функциональные тесты с белками OLPVRII и OLPVR1 подтвердили отсутствие помповой активности данных белков. Был проведен тщательный анализ структуры вирусного родопсина OLPVRII. Белок формирует пентамер посредством аминокислот E26, R36, W203 и связанных с ними молекул воды. В результате, между мономерами белка в пентамере образуется центральная пора, гидрофобная поверхность которой выстлана аминокислотами F24 и L28, а барьер для ионов образует пять симметричных аргининов R29. Плотная цепь водородных связей между мономерами в пентамере идет от аминокислоты N40 вплоть до R29, а находящийся поблизости донор протона E42 обеспечивает связь с Шиффовым основанием. Акцептором протона является аминокислота D75, а выходит протон из белка с аминокислот D124, R183. С помощью наложения аминокислотных последовательностей вирусных родопсинов группы II было показано, что все аминокислоты E42, D75, R29, F24, L28, E26, R36, W203, N40 обладают высокой степенью консервативности, а значит наличие пентамера и центральной поры является функционально значимым. Был выдвинута гипотеза относительно механизма функционирования OLPVRII. А именно, после поглощения кванта света и переформирования сети водородных связей может происходить изменение конформации боковой группы акцептора протона E42, что приводит к изменению положения аминокислоты N40 и, впоследствии, всей сети водородных связей, соединяющих пентамер и обеспечивающих закрытие поры R29. При изменении конформации последних пора может открываться, обеспечивая прохождение анионов через центральную пору. С помощью экспериментов по кросс-линкингу, гель-фильтрации и кристаллизации мутанта E26A/W203A/R36A было убедительно доказано, что мультимеры OLPVRII являются пентамерами, как и в кристалле, а их образование является функционально значимым. Мутант E26A/W203A/R36A содержит мутации аминокислот, которые играют наиболее заметную роль в формировании пентамера OLPVRII. Эксперименты по экспрессии белков вирусных родопсинов OLPVRII и OLPVR1 показали низкую степень локализации белков в плазматической мембране, однако дополнительные эксперименты с одним из гомологов белка OLPVR1, Tara146 позволили функционально охарактеризовать группу 1 вирусных родопсинов. В частности, было показано, что вирусные родопсины из группы 1 являются катионными канальными родопсинами, что позволяет говорить о потенциале данных белков в оптогенетических приложениях.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В соответствии с заявленным планом работы на 2021 год мы детально проанализировали структуру OLPVR1 и аминокислотные последовательности OLPVR1 и гомологичного белка VirChR1 (Tara146) с целью селекции мутаций для оптогенетических исследований. В частности, мы выбрали 23 мутации (D80N, D80S, E47A, E47D, E47N, E47Q, E47T, E54Q, F95A, F95R, I61E, L194Q, L194Y, M144A, M144T, R77Q, S228N, S91N, T85C, V193T, V197T, Y58K, Y201F), каждая из которых была получена в генетической конструкции методом ПЦР, а затем протестирована с помощью метода локального потенциала (patch clamp). Данные эксперименты позволили нам выявить ряд мутаций, которые заметно улучшают фототок белка VirChR1 (E47D, V193T, V197T, S91N), и при этом практически не отличаются по кинетике и потенциалу реверсии, что свидетельствует о высокой вероятности сохранения целевых свойств (кинетики и селективности) в ходе мутаций. Данные мутации крайне важны для оптогенетических приложений вирусных родопсинов. Кроме того, на основе имеющихся протоколов экспрессии вирусных родопсинов нами был предложен протокол по экспрессии и очистке белка VirChR1 в E. coli, что потребовало использование белка партнера BRIL (термостабилизированный цитохром b562 из E. coli), который был добавлен на N-конец белка, и после очистки удален с помощью протеазы Тромбин. Очищенный белок VirChR1 был использован для спектроскопической характеризации белка и ряда новых экспериментов. В частности, нашей команде удалось установить кинетический механизм ингибирования VirChR1 ионами кальция, который был ранее показан в электрофизиологических экспериментах с белком. Было показано, что фотоцикл белка имеет 6 кальций-независимых состояний и одно кальций-зависимое состояние, которое меняет время жизни и спектр поглощения при добавлении ионов кальция в раствор. Таким образом нами было показано, что белок VirChR1 может связывать ион кальция в непосредственной близости от кофактора ретиналя. В соответствии с заявленным планом работ, мы продолжили работу над оптимизацией кристаллизации белков OLPVRII и OLPVR1, а также белка VirChR1. В ходе работ по кристаллизации OLPVRII мы сосредоточили работу по разработке протокол эффективной и воспроизводимой кристаллизации мутанта OLPVRII E42Q, который необходим разработки протокола накопления и фиксации промежуточных состояний в кристалле и получения их структур высокого разрешения. Нам удалось определить структуру мутанта E42Q белка OLPVRII с разрешением 2.5 ангстрема. Мутация E42Q, в частности, способствует удлинению жизни М состояния белка, так как репротонирование основания Шиффа, происходящее именно при распаде М формы, затруднено в мутанте. Это позволит накапливать значительную фракцию М состояния в белковых кристаллах, что является важнейшим фактором для определения его атомарной структуры. Также мы продолжили работу по определению промежуточных состояний белков вирусных родопсинов. В частности, мы использовали метод криотрепинга, в котором замороженный кристалл белка на пару секунд размораживают и засвечивают лазером (в нашем случае мощностью 10мВт и длиной волны 532нм), после чего замораживают обратно. В результате такой операции в кристалле накапливается самый медленный интермедиат фотоцикла, который можно разрешить с помощью рентгеновской дифракции. Апробация метода на кристаллах OLPVRII дикого типа показала, что фотоцикл действительно запускается, однако это приводит к деградации кристаллов вероятно из-за больших перестроек в белковой структуре. Для белка OLPVR1 мы использовали аналогичный протокол, по которому белок, вероятно, был захвачен в K-состоянии. Следует отметить, что после отжига кристаллы вернулись в основное состояние, а это означает, что необратимых изменений при освещении не произошло. Полученные результаты являются пионерской работой в определении механизма канальной активности фотоактивных белком, что крайне важно как с фундаментальной точки зрения, так и для различных практических приложений, в частности для оптогенетики.