Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Сегодня миРНК являются новым классом лекарственных средств - за последние два года уже зарегистрированы два препарата и еще один будет зарегистрирован в начале 2020. Эти препараты обладают беспрецедентной продолжительностью действия - до 6-8 месяцев и очень хорошим профилем безопасности, при должной оптимизации молекулы токсичность и побочные эффекты практически отсутствуют. Так как гипоксия и, как следствие, повышенное содержание активных форм кислорода, сопровождает многие заболевания (например, увеличение АФК характерно при инсульте, инфаркте и при развитии многих солидных опухолей), то возможность селективно активировать миРНК в присутствии АФК представляется интересным подходом для терапии онкологических заболеваний. Это может позволить подавлять терапевтические мишени в клетках/тканях находящихся в условиях гипоксии при минимальном влиянии на здоровые клетки. В течение первого года выполнения проекта совместно с немецкими коллегами (группа проф. А.Мохира https://www.chemie.nat.fau.de/ak-mokhir/) нам удалось получить производные олигонуклеотидов (ДНК и РНК) у которых 5’-конец блокирован производными фенилборной кислоты или ферроцена. миРНК, содержащие такие модификации на 5’-конце антисмысловой цепи (про-миРНК), неактивны, так как для загрузке в RISC комплекс необходимо 5’-фосфорилирование. Эти производные химически стабильны в широком интервале рН, не влияют на термическую стабильность миРНК дуплексов и нетоксичны. Ранее мы предложили использовать убиквитин лигазы Ubr1-5 в качестве терапевтической мишени для гепатоцеллюлярной карциномы. Полная химическая модификация миРНК увеличивает стабильность к действию нуклеаз и уменьшает иммунный ответ in vivo, поэтому нами получены и оптимизированы химически модифицированные миРНК для подавления экспрессии мРНК eEF2, KIF11, Ubr1-5. Также была проведена оптимизация условий конъюгации РНК с N-ацетилгалактозамином и показано, что использование твердофазном синтезе носителя с иммобилизованным кластером N-ацетилгалактозамина предпочтительнее медь(I)-катализируемой реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения для синтеза миллиграмовых количеств миРНК конъюгатов. Это связано с тем, что даже при оптимальных условиях реакции клик-присоединения не менее 5-7% тиофосфатов были конвертированы в фосфодиэфиры, что затрудняет очистку конъюгата. Разработанные методики синтеза и очистки позволят применять про-миРНК in vivo как в составе липидных наночастиц, так и в виде конъюгатов с N-ацетилгалактозамином. Нами были оптимизированы условия синтеза и очистки таких про-миРНК, что позволило получить количества, необходимые для работы с животными в течение второго года выполнения проекта. Полученные нами про-миРНК могут быть активированы в клетках в присутствии АФК за счет высвобождения 5’-конца антисмысловой цепи миРНК. Определен уровень АФК в перевиваемых клеточных линиях гепатоцитов мыши и показано, что в клетках линии Hepa1-6 (карцинома) уровень АФК выше чем в клетках линии AML-12 (норма). При подавлении экспрессии убиквитин лигаз Ubr1-5 наблюдался заметный рост АФК, особенно в клетках Hepa1-6, что может быть обусловлено увеличением частоты спонтанного апоптоза. Этот факт представляет особенный интерес для нашей системы, так как подавление убиквитин лигаз Ubr1-5 будет не только приводить к терапевтическому эффекту, но и за счет увеличения уровня АФК активировать больше молекул миРНК. Отдельно нами была отработана модель повышения уровня АФК в печени здоровых мышей при интраперитональной инъекции тетрахлорида углерода. Показано, что однократной инъекция тетрахлорида углерода (100 мкл/кг) позволяет увеличить уровень АФК в 3-4 раза, а увеличение дозы до 500 мкл/кг приводит к заметной токсичности. Результаты, полученные в рамках выполнения проекта были представлены на конференциях - БИОТЕХНОЛОГИЯ - МЕДИЦИНЕ БУДУЩЕГО, VI Съезд биохимиков России и FEBS-2019. Кроме того, нами была организована конференция Chemistry Meets Biomedicine (https://cmb.skoltech.ru), в рамках которой был организован круглый стол, посвященный тематике проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году нами были масштабированы методы синтеза про-миРНК и изучена зависимость их активности в ряде линий клеток при различном уровне активных форм кислорода. На здоровых животных было показано, что при однократном введении липидных частиц с про-миРНК они не активны, а при многократном введении наблюдается статистически достоверное подавление экспрессии мишени. Биораспределение липидных частиц с про-миРНК не отличается от такового для липидных частиц с миРНК. Были определены оптимальные условия и проведено масштабирование синтеза и очистки АФК-активируемых про-миРНК с 5’-защитой на основе фенилборной кислоты. Это позволило получить про-миРНК в количествах, достаточных для проведения исследований in vivo. Таким образом были получены про-миРНК для подавления экспрессии убиквитин-лигаз Ubr1, Ubr2, Ubr4, Ubr 5 и фактора элонгации eeF2. Далее были получены липидные частицы на основе липидоидов Dlin-MC3 и С12-200 по стандартному протоколу с использованием микрофлюидного устройства NanoAssemblr. Частицы имеют оптимальный размер и индекс полидисперсности для доставки in vivo, загрузка миРНК также достаточна для эффективного подавления экспрессии целевых мРНК. В среднем размер частиц и индекс полидисперсности был выше в случае модифицированных про-миРНК, что видимо обусловлено гидрофобностью фенилборного производного. Для получения конъюгатов миРНК с N-ацетилгалактозамином нами было проведено сравнение двух подходов – проведение 1,3-диполярного присоединения азидного производного GalNAc к модифицированному олигонуклеотиду в растворе и на твердофазном носителе (V.Farzan et al, Bioconjugate Chem. 2017) и использование твердофазного носителя с иммобилизованным блокированным производным GalNAc для синтеза олигонуклеотида (V.Sharma et al, Bioconjugate Chem. 2018). Так как в первом случае наблюдалась значительная деградация модифицированного фрагмента, скорее всего в результате генерирования активных форм кислорода в присутствии ионов меди (I) или действия ионов меди (I) напрямую, то, как следствие, мы остановились на использовании второго подхода. АФК-активируемые миРНК были проверены in vitro на двух мышиных клеточных линиях: норма гепатоцитов AML12 и гепатома Hepa1-6. АФК-активируемые миРНК и контрольные миРНК к мРНК фактора трансляции eEF2 трансфецировали в клетки с использованием липофектамина. Предварительно часть клеток обрабатывали перекисью водорода с целью увеличения АФК, другую часть –раствором N-ацетилцистеина, который, наоборот уменьшает АФК. В клетках AML12 предварительная обработка перекисью водорода не приводит к появлению концентрации АФК, достаточной для активации про-миРНК. Обработка перекисью водорода раковых клеток гепатомы Hepa1-6 приводит к образованию более высокой концентрации АФК, так как в раковых клетках изначально уровень АФК выше. Как следствие, наблюдалась активация АФК-зависимых про-миРНК в клетках Hepa1-6 и снижение уровня мРНК eEF2. Также стоит отметить, что по сравнению с нормой гепатоцитов AML12 в раковых клетках Hepa1-6 изначально присутствует определенная концентрация АФК, достаточная для активации АФК-зависимых миРНК при высоких концентрациях последних. Для полученных конъюгатов с N-ацетилгалактозамином наблюдалась аналогичная картина, однако наблюдалась меньшая эффективность подавления экспрессии мишеней. Анализ эффективности про-миРНК проводился на здоровых животных линии FvB/N при однократном и многократном введении препаратов и соответствующих контролей (4 мыши в группе). В здоровых животных после однократной инъекции контрольные миРНК подавляют экспрессию мРНК Ubr4 и Ubr5 на 70±5%, тогда как АФК-активируемые миРНК не показали статистически достоверной активности. В здоровых животных после многократных длительных инъекций контрольные миРНК подавляют экспрессию мРНК Ubr4 и Ubr5 на 80±5%. Также можно наблюдать небольшую активацию АФК-зависимых миРНК (подавление мРНК Ubr4 и Ubr5 на 30±8%), что скорее всего связано с появлением небольшого количества АФК, вызванное развитием воспалительного ответа в печени в ответ на длительное воздействие липидных частиц. Была проведена оценка токсичности АФК-зависимых миРНК при однократном и многократном введении липидных наночастиц здоровым животным. Был проведен анализ крови (определены уровни АСТ, АЛТ и билирубина), а также гистологические исследования срезов печени с прокрашиванием эозином/гематоксилином. В случае многократного введения липидных частиц с миРНК или про-миРНК наблюдалось незначительное увеличение инфильтрации иммунных клеток, по-видимому, вызванное липидными частицами. Далее мы изучили биораспределение липидных частиц, содержащих свободные миРНК (1) и про-миРНК eEF2. Для этого в состав частиц был введен гидрофобный краситель Су7. Частицы (1) и (2) показали схожее распределение – через 8 и 24 часа после инъекции наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдалась в печени, некоторая флуоресценция есть в селезенке и минорная – в легких и почках. Таким образом, мы продемонстрировали, что липидные частицы с про-миРНК имеют такое же биораспределение, что и липидные частицы с обычными миРНК. На данном этапе развития проекта, с учетом полученных данных in vitro и in vivo, мы считаем, что наш подход позволит селективно подавлять экспрессию мишеней in vivo при наличии повышенного уровня активных форм кислорода.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году были проанализированы и охарактеризованы четыре животных модели, для которых по литературным данным наблюдается рост АФК: гепатоклеточная карцинома, индуцированная диэтилнитрозамином; частичная гепатэктомия; ишемии-реперфузии печени; повреждение печени, вызванное четыреххлористым углеродом. Подобраны условия протокола получения животных моделей и показано, что модели частичной гепатектомии и ишемии-реперфузии печени удовлетворяют задачам проекта. Животные модели охарактеризованы гистологическим исследованием, анализом крови на маркеры повреждения печени (АЛТ/АСТ), а также маркеры антиоксидантных систем с помощью полимеразно-цепной реакции в реальном времени. Было показано, что в обеих моделях наблюдается резкое повышение концентрации обоих ферментов уже через 4 часа, что свидетельствует о развивающихся повреждающих процессах в печени, однако в случае модели ишемии данные процессы являются обратимыми и уже через 24 часа уровень АЛТ/АСТ приближается к норме. В то время как в модели частичной гепатэктомии наблюдается продолжение повышения уровня АСТ, после 4 часов он возрастает еще больше и через 24 часа увеличивается в 2 раза по сравнению с уровнем через 4 часа после гепатэтомии. С помощью метода полимеразно-цепной реакции в реальном времени была проведена оценка активации маркеров антиоксидантных систем – пероксиредоксинов, тиоредоксинов и глутатион-пероксидазы и показано, что в обеих моделях наблюдается активация данных систем, однако в большей степени она выражена в модели ишемии. АФК-активируемые миРНК и контрольные миРНК были загружены в липидные частицы для адресной доставки в печень. На здоровых животных были подобраны активные дозы контрольных и АФК-активируемых про-миРНК, при которых контрольные миРНК эффективно ингибируют мРНК мишени, тогда как про-миРНК еще не активны. В результате для смеси ЛЧ к Ubrs (1,2,4 и 5) была выбрана доза 0,75 мг/кг, для ЛЧ к eEF2 – 0,02 мг/кг, для ЛЧ к DDX3-5 – 0,1 мг/кг и DDX3-7 – 0,2 мг/кг. Для проверки активации АФК-зависимых про-миРНК животным были внутривенно введены липидные частицы, содержащие контрольные и про-миРНК к различным мРНК мишеней в подобранной концентрации, после чего через 24 часа была проведена частичная гепатэктомия. Через 24 часа после гепатэктомии (или 48 часов после инъекции ЛЧ) анализировали активность миРНК методом ОТ-ПЦР. Для всех АФК-активируемых про-миРНК показана их активация и определена эффективность ингибирования мРНК мишеней убиквитин лигаз, фатора трансляции и хеликазы. Полученная активность про-миРНК оказалась сопоставима с контрольными миРНК, что свидетельствует о полном снятии защитной группы с 5’-конца про-миРНК в присутствии АФК. Также для АФК-активируемых про-миРНК к хеликазе DDX3 подтверждена активность в другой животной модели – ишемии-реперфузии печени, которая также характеризуется ростом АФК.