Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведен скрининг фаговых пептидных библиотек Ph.D.-7 и Ph.D.-12 в системах in vitro и in vivo на клетках глиобластомы человека U-87MG и на опухоли U-87 MG в модели-ксенографтов. Получены опухоль-адресующие пептиды, обеспечивающие специфическое связывание и/или интернализацию фаговых частиц, экспонирующих эти пептиды, в клетки U-87 MG. Последовательности отобранных опухоль-адресующих пептидов определены секвенированием фрагментов генома фагов. Анализ последовательностей опухоль-адресующих пептидов для дальнейшего изучения специфичности их связывания с опухолевыми клетками проведен с помощью программного обеспечения «MEGA X» и алгоритма UPGMA. Отобраны опухоль-адресующие пептиды с наибольшей частотой встречаемости - (№№19, 20 - NHTTPRH, №№26,36 – SWTFGVQFALQH, №49 – EQAYQYS, №83 – PVSNKMS, №92 – HPSSGSA). Бактериофаги, экспонирующие полученные опухоль-адресующие пептиды, наработаны и очищены для дальнейших экспериментов. Проведен сравнительный анализ специфичности связывания бактериофагов, экспонирующих отобранные пептиды, с клетками глиобластомы человека U-87MG и здоровыми клетками мозга человека ДКМ–5. Методами проточной цитометрии и иммуноферментного анализа выявлены бактериофаги, экспонирующие опухоль-адресующие пептиды, обеспечивающие наибольшую специфичность и селективность связывания фаговых частиц с клетками U-87 MG – №№ 19, 20, 26, 36 и 49. Согласно результатам ИФА бактериофаги, экспонирующие полученные опухоль-адресующие пептиды, как и бактериофаг без вставки не связывались со здоровыми клетками мозга эмбриона человека ДКМ-5. Методом флуоресцентной микроскопии показано, что полученные опухоль-адресующие пептиды способны обеспечить эффективное специфическое связывание и/или интернализацию фаговых частиц клетками глиобластомы. Показано специфическое связывание отобранных опухоль-адресующих пептидов с клетками первичных культур глиом человека AS2 и MG1.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основной целью второго года работы по проекту являлся выбор опухоль-адресующих пептидов с наилучшими опухоль-связывающими характеристиками для реализации таргетного подхода. Было проведено исследование избирательного накопления бактериофагов, экспонирующих отобранные опухоль-адресующие пептиды, в опухолевой ткани глиобластомы U-87 MG в модели-ксенографтов в сравнении с их накоплением в тканях контрольных органов (мозга, легких, печени и почек). Бактериофаги №№26 и 92, полученный при скрининге фаговых пептидных библиотек в системах in vitro и in vivo, соответственно, показали наибольшую эффективность связывания с клетками глиобластомы человека на предыдущих этапах работы с использованием проточной цитометрии и иммуноцитохимического анализа, а также наибольшую селективность связывания с клетками глиобластомы U-87MG по сравнению со здоровыми клетками мозга человека ДКМ-5. Показано, что бактериофаг №92, экспонирующий пептид HPSSGSA, в наибольшей степени накапливался в опухолевой ткани по сравнению с контрольными органами: титр бактериофага в опухоли превосходил титр в почках больше чем в 5,5 раз, и титр в мозге, печени и легких – более, чем в 11 раз. С помощью двухфакторного дисперсионного анализа показана статистически достоверная разница в накоплении бактериофага №92 в опухоли по сравнению фагом №26 и контрольным фагом, экспонирующим рандомную аминокислотную последовательность. Бактериофаг №26, экспонирующий пептид SWTFGVQFALQH, также специфически накапливался в опухолевой ткани, но в меньшей степени по сравнению с бактериофагом №92. Полученный результат, возможно, обусловлен системой отбора исследуемых бактериофагов: бактериофаг №92, был получен в системе in vivo, в то время как бактериофаг №26 - в системе in vitro. Второй задачей данного этапа являлось исследование способности отобранных пептидов обеспечивать проникновение фаговых частиц (№№ 19, 26, 42, 92) в клетки U-87 MG. Методом конфокальной микроскопии было показано специфическое связывание и интернализация отобранных опухоль-адресующих бактериофагов в клетки U-87 MG. Согласно полученным данным было обнаружено существенное различие в уровне связывания бактериофагов с клетками: бактериофаги №№26 и 49, экспонирующие пептиды SWTFGVQFALQH и EQAYQYS, обладали наибольшей эффективностью взаимодействия с клетками U-87 MG. По результатам всех проведенных исследований для последующей конъюгации с ингибиторами Pak1 киназы были выбраны опухоль-адресующие пептиды HPSSGSA и SWTFGVQFALQH, экспонируемые бактериофагами №92 и №26, обеспечивающие максимально эффективное взаимодействие фаговых частиц с опухолевыми клетками. Аминокислотные последовательности выбранных опухоль-адресующих пептидов будут переданы индийской команде для конъюгации с ингибиторами Pak1. Таким образом все работы, запланированные на 2020 год выполнены полностью.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основной целью третьего года работы по проекту являлась проверка цитотоксической и противоопухолевой активности полученных опухоль-адресующих пептидов, конъюгированных с ингибитором Pak1, in vitro на культурах клеток глиобластом человека и in vivo на опухолевых моделях глиобластомы. В конце 2020 года аминокислотные последовательности отобранных нами опухоль-адресующих пептидов были переданы индийской команде для конъюгации с ингибиторами Pak1. Однако, из-за локдауна в Индии работы индийской команды по конъюгации ингибиторов Pak1 с выбранными опухоль-адресующими пептидами были полностью приостановлены. Российская команда решила самостоятельно заказать пептиды и ингибиторы Pak1, провести конъюгацию для продолжения работ по проекту. В течение времени ожидания доставки данных реагентов российской командой были выполнены следующие исследования в рамках проекта: 1. Сравнительный анализ in silico аминокислотных последовательностей отобранных нами опухоль-адресующих пептидов (https://doi.org/10.1134/S0003683821090027, doi: 10.3390/ijms22010314) с последовательностями пептидов и белков из доступных баз данных с помощью программы PepBank. - Установлено, что последовательность пептида №19 имеет высокий уровень гомологии с предшественником антигена CAMPATH-1; пептида №19С - с аполипопротеином A-I. Пептид №18С содержал сайты связывания CR2, а пептид №92 - мотивы связывания авидина и стрептавидина. Для остальных пептидов гомологии с уже известными пептидами обнаружено не было. - С помощью программы MEGA-X показано, что большинство проанализированных пептидов принадлежало двум большим разветвленным кластерам на филогенетическом древе, построенном с использованием метода максимальной парсимонии, что говорит о наличии двух мажорных мотивов для пептидов, отобранных на клетках глиобластомы человека. - Найден общий мотив последовательностей отобранных пептидов. Несмотря на значительный полиморфизм в последовательности пептидного мотива, можно выделить мотив: R (A, P, S) P (Q, W) TR (L, S) GG (P) P (R, S, W). Оба отобранных нами пептида (№92 (HPSSGSA) и №26 (SWTFGVQFALQH)), наиболее эффективно связывающихся с клетками глиобластомы в экспериментах in vivo и in vitro, частично содержали данный мотив. Результаты работы были опубликованы в FEBS OPEN BIO (https://doi.org/10.1002/2211-5463.13205). 2. Исследование способности модифицированных опухоль-адресующих бактериофагов проникать в опухолевые клетки; - Проведена модификация свободных аминогрупп белков оболочки фагов флуоресцентным красителем FAM-NHS. - Показано, что с увеличением концентрации модифицирующего агента (флуорофора FAM–NHS) наблюдается снижение титра модифицированного фага М13, что в дальнейшем необходимо учитывать при разработке препаратов на основе модифицированных бактериофагов. - Установлено, что максимальная степень модификации (FAM/фаг) наблюдается при концентрации флуорофора в реакционной смеси – 4 мМ и составляет 804 молекулы красителя на одну фаговую частицу. При больших концентрациях модифицирующего агента (8 мМ) происходит снижение степени модификации до 726 молекул FAM/фаг. -проведен анализ эффективности связывания модифицированных бактериофагов с опухолевыми клетками MDA-MB-231 методом проточной цитометрии. Показано, что максимальная доля окрашенных клеток наблюдалась для 4 и 8 мМ FAM-NHS (98 и 89%, соответственно). Таким образом, показано, что модификация опухоль-адресующих бактериофагов флуоресцентным красителем сохраняет способность бактериофагов связываться с опухолевыми клетками, а также подтверждает возможность использования M13-FAM в качестве диагностического средства. - Проведена оценка количества опухоль-адресующих бактериофагов, как модифицированных FAM-NHS, так и немодифицированных, связывающихся с клетками MDA-MB-23. Исследование проводили при избытке количества бактериофагов относительно количества клеток. Показано, что максимальное число фагов, проникших в одну клетку, наблюдалось при избытке бактериофагов в сто тысяч раз: 476 фагов/клетку для немодифицированных бактериофагов и 96 фагов/клетку для бактериофагов, модифицированных FAM-NHS. Таким образом, установлено, что с увеличением концентрации фагов, с которыми инкубируются опухолевые клетки, увеличивается и количество связавшихся с клетками бактериофагов. При этом модификация опухоль-адресующих бактериофагов флуоресцентным красителем значительно уменьшает количество фагов, способных связываться с целевыми опухолевыми клетками, что необходимо учитывать при подборе терапевтической дозы препаратов на основе модифицированных бактериофагов. - Исследована способность модифицированного бактериофага М13-FAM проникать в опухолевые клетки и показано, что бактериофаги сохраняют способность проникать в клетки-мишени даже при высоких степенях модификации флуоресцентным красителем. Результаты работы опубликованы в журнале Molecules (https://doi.org/10.3390/molecules26216564) 3. Модификация опухоль-адресующих пептидов флуоресцентных красителем Cy5. - Проведена конъюгация опухоль-адресующего пептида с флуоресцентным красителем Cy5 и очистка полученного конъюгата. Работы по оценке цитотоксической и противоопухолевой активности конъюгатов опухоль-адресующих пептидов с ингибитором Pak1, запланированные на 2021 год, не выполнены из-за продолжительного локдауна в Индии.