Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За отчетный период в проекте проведен большой объем синтетических работ по получению различных по структуре гетеростильбеновых производных. Варьирование структуры позволяет проанализировать протекание фотохимических трансформаций, определить продукты фотохимических реакций, получить важные соединения, которые имеют потенциал медицинского применения. По направлению синтез гетеростильбеновых производных были наработаны ранее описанные нами 2-стирилзамещенные бензотиазол, пиридин, индол, хинолин, изохинолин, пиразин. Была синтезирована серия 2-стирилхинолиновых и 2-стирилхиноксалиновых производных для исследования направления фотохимических превращений. Синтетические работы были связаны также с получением новых стирилбензотиазолов. Эти исследования можно условно разделить на две части: получение производного cтирилбензотиазола c вариацией заместителя в гетероциклическом фрагменте и варьирование заместителя при двойной С=С-связи. Был разработан и осуществлен синтез стириловых красителей, содержащих бензилиденовый фрагмент в арильной части молекулы. Проведен синтез серии бисстириловых производных, в структуре которых содержится по два фрагмента стирилгетероцикла, связанных достаточно длинными алкильным или поли(оксиалкильным) спейсерами, позволяющими минимизировать взаимное влияние двух стириловых фрагментов друг на друга. Проведенные фотохимические исследования серии 2-стирилхинолиновых и 2-стирилхиноксалиновых производных показали, что для селективного протекания фотоиндуцированной электроциклической реакции необходимым условием является наличие С=С связи в орто-положении к атому азота гетероциклического фрагмента, а также наличие донорных заместителей в фенильном ядре. Введение второго атома азота в гетероциклический фрагмент увеличивает дипольность гетеростильбена, его димеризацию в растворе и, как следствие, вызывает при облучении протекание региоселективного процесса фотоциклоприсоединения. Без донорных заместителей в фенильном ядре гетеростильбены участвуют только в реакции E-Z-фотоизомеризации. Таким образом, небольшие структурные изменения могут быть использованы для управления направлением фототрансформации стириловых производных. Другим примером управления фотохимическим поведением соединения являются результаты исследования фотохимии стириловых красителей, содержащих бензилиденовый фрагмент в арильной части молекулы. Такая вариация структуры привела к тому, что соединения не участвуют в фотореакциях. Первоначальные исследования фотохимической реакции электроциклизации бисстириловых производных, проведенные совместно с партнерами из Германии, показали образование бисэлектроциклических продуктов. В ходе проведенных экспериментов был подобран оптимальный, безопасный для клеток in vitro, режим освещения УФ-лампой LC-8 (мощность 10%, расстояние от источника света до клеток 25 см, время освещения - 3 раунда облучения в течение 1 мин каждый с паузами 30 мин) для фотоактивации стирилазагетероциклов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Научный отчет по проекту РНФ №19-43-04127 - Описание выполненных в отчетном 2020 году работ и полученных научных результатов для публикации на сайте РНФ Продолжая исследования свойств стирилгетероциклов, для серии новых производных 2-(3,4-диметокистирил)бензотиазола 7-11 (Схема 1) изучена возможность протекания реакции фотоциклизации и взаимодействие продуктов фотореакции с ДНК. Схема 1. Производные 2-стирилбензотиазола 7-11 были получены с хорошими выходами. При этом выход 2-стирил-5-аминобензотиазола 11 почти в 1.5 раза ниже выхода своего структурного аналога – 2-стирил-6-аминобензотиазола 10. Видимо, электронодонорные заместители, находясь в 6-ом положении, не влияют существенным образом на электронную плотность гетероароматического кольца. Электронодонорный заместитель в 5-ом положении более эффективно дезактивирует акцепторную способность гетероатома, что приводит к уменьшению кислотности протонов метильной группы во 2-положении и снижению выхода продукта конденсации. Также с хорошими выходами были получены производные стирилбензотиазола 12, 13, имеющие амидный заместитель в гетероциклическом фрагменте (Схема 2). Схема 2. Все синтезированные производные 2-стирибензотиазола 7-13 были выделены в виде Е-изомеров, что однозначно следовало из констант спин-спинового взаимодействия олефиновых протонов (около 16 Гц) в 1Н ЯМР спектрах. Фотохимические реакции новой серии производных 2-стирилбензотиазола. Фотолиз произодных 2-стирилбензотиазола проводили в условиях, разработанных нами на предыдущем этапе выполнения данного проекта: воздушно-насыщенные ацетонитрильные растворы соединений 7, 9 и 13 облучали нефильтрованным светом ртутной лампы высокого давления. Продукты фотоциклизации 7ec, 9ec и 13ec были выделены в виде перхлоратов.(Схема 3). Схема 3. Структуры полученных продуктов были установлены по данным ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Во всех случаях наблюдалось образование исключительно продуктов С-N фотоциклизации. Фотолиз в аналогичных условиях 2-стирил-5-аминобензотиазола 11 приводил к деградации субстрата, образования продукта фотоциклизации не наблюдалось. Изучение комплексообразования гетероароматических катионов 7ec, 9ec и 13ec с ДНК. Способность соединений 7ec, 9ec и 13ec образовывать комплексы с ДНК была доказана методами оптической спектроскопии на примере взаимодействия исследуемых лигандов с ДНК тимуса теленка. Добавление ДНК тимуса теленка к растворам 7ec, 9ec и 13ec в фосфатном буфере приводило к батохромному сдвигу максимумов длинноволновых полос поглощения исходных лигандов. Такие изменения свидетельствуют о выраженном взаимодействии с ДНК. По результатам спектрофотометрического титрования были рассчитаны константы связывания лигандов 7ec, 9ec и 13ec с ДНК (Табл. 1). Высокие значения полученных констант связывания исследуемых лигандов хорошо соотносятся с литературными данными для ДНК-интеркаляторов похожей структуры и размера (плоских гетероциклических хромофоров). Таблица 1. Оптические характеристики свободных и связанных с ДНК лигандов 7ec, 9ec и 13ес и константы устойчивости их комплексов с ДНК в буфере BPE (pH = 7.0)с добавлением ДМСО (2% объемных для лигандов 7ec, 9ec и 13ес), 20°С. λпогл, нм λфл, нм K, M-1 свободный связанный cвободный cвязанный 7ec 396 409 446 450 3.3•105 9ec 402 415 451 455 1.3•105 13ec 412 429 475 477 6.3•105 Исследование спектров КД показало, что в присутствии ДНК тимуса теленка для ахиральных лигандов 7ec, 9ec и 13ec наблюдаются сигналы ИКД отрицательного знака. Это говорит о том, что данные лиганды образуют комплексы с ДНК. Взаимодействие гетероароматических катионов, полученных в результате фотоциклизации производных стирилбензотиазола, с ДНК было изучено методом ЯМР-спектроскопии. Характерное исчезновение сигналов протонов гетероциклических фрагментов ДНК в области слабых полей (12.5-14 м.д.), наблюдаемое при добавлении к раствору ДНК гетероароматического катиона 7ес, свидетельствует о взаимодействии образца с ДНК посредством интеркаляции. Таким образом, данные оптической, КД и ЯМР спектроскопии, полученные для комплексов исследуемых поликонденсированных ароматических катионов с ДНК, согласуются между собой и подтверждают факт интеркаляционного типа связывания в данных комплексах. Следующим типом разрабатываемых соединений являются производные 2-(3,4-диметокистирил)бензотиазола, имеющие заместители при двойной связи C=C. Для получения серии производных с заместителями при двойной С=С связи была использована реакция альдольно-кротоновой конденсации, целевые продукты 14, 15 были получены с выходами до 90 % (Схема 4). Схема 4. По данным ЯМР спектроскопии все полученные cтириловые производные были выделены в виде Е-изомеров. Фотохимические реакции серии производных 2-стирилбензотиазола, замещенных по С=С связи. Спектральные изменения, наблюдаемые при облучении нефильтрованным светом ртутной лампы растворов соединений 14-16, были аналогичны изменениям, описанным нами для их структурных аналогов 7, 9, 13, что свидетельствует о возможном протекании внутримолекулярной фотоциклизации с образованием конденсированных гетерокатионов. Был выделен в виде перхлората гетероароматический катион 14ес, строение которого было установлено с использованием ЯМР спектроскопии (Схема 5). Схема 5. Доказана возможность интеркаляции синтезированного гетероароматического катиона 14ес с ДНК тимуса теленка. В данной работе предложен дизайн новых, несимметричных бисстириловых производных, в которых два различных фрагмента стирилгетероциклов соединены оксиэтиленовым спейсером. Для получения алкенов была использована реакция олефинирования формильной группы фосфонатами (реакция Хорнера-Вадсворта-Эммонса). Полученные несимметричные бисстириловые производные 21 или 22, имели E-конфигурацию (Схема 6). Схема 6 Важной особенностью предлагаемого подхода является то, что структура несимметричных бисстириловых красителей состоит из блоков моностириловых производных, которые можно легко варьировать, меняя, таким образом, возможность и модель связывания с ДНК. Было изучено влияние длины волны возбуждения и природы растворителя на протекание реакции фотоциклизации N-ортостирилзамещенных гетероциклов. На примере соединения 27 мы изучили эффективность протекания процесса окислительной электроциклизации до полиароматического фотопродукта 27ec при облучении светом с разными длинами волн. Электроциклизация протекает при всех условиях возбуждения, однако чем мягче условия фотолиза, тем в меньшей степени разрушаются фотопродукты. Что касается природы растворителя, то было установлено, что при проведении фотореакции в ацетонитриле образуется исключительно электроцикл 27ec, а в воде меняется направление реакции и образуется производное циклобутана 28. Вероятно, в водном растворе происходит димеризация молекул соединения 27, что может способствовать протеканию реакции [2+2]-фотоциклоприсоединения (Схема 7). Схема 7. Изучение кинетики фотоциклизации стирилгетероциклов показало, что процесс образования электроцикла 27ес при облучении светом с длиной волны 365 нм является автокаталитическим с длительным индукционным периодом. Мы предположили, что увеличение скорости образования продукта окислительной электроциклизации 27ec при увеличении его концентрации в реакционной смеси может быть связано с тем, что само соединение 27ec при облучении способно к генерации синглетного кислорода или иных активных форм кислорода, облегчающих окисление фотопродукта до 27ec. Предположение об образовании синглетного кислорода в ходе реакции фотоциклизации было проверено и подтверждено методом, основанном на использовании «химических ловушек». Была проведена оценка цитотоксичности моностириловых производных N-гетероциклов серии A и продуктов их фотоциклизации В (Схема 8) in vitro. Схема 8. При оценке биологических свойств моностириловых производных N-гетероциклов выявлено, что производное 2-стрилхинолина в концентрации 20 мкМ при воздействии светом проявляло большую активность, чем без облучения (ингибирование пролиферации без воздействия светом составляло 38%, при облучении – 61%).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. На третьем, заключительном, этапе проекта было продолжено изучение фототрансформаций производных 2-стирилбензотиазола. Наибольшее внимание было уделено получению и подробному изучению фототрансформаций производных 2-стирилбензотиазола, имеющих амидные заместители в гетероциклическом фрагменте. Наличие амидных заместителей в гетероциклическом фрагменте обеспечивает появление дополнительных взаимодействий продуктов фотоциклизации с молекулами ДНК и РНК за счет образования водородных связей. В результате реакции окислительной фотоциклизации производных стирилбензотиазола, содержащих амидные заместители в бензольном ядре бензотиазолиевого фрагмента, были получены соответствующие продукты циклизации. Строение новых соединений доказано методами ЯМР-спектроскопии, подтвердившими образование гетероароматических катионов. Во всех случаях наблюдалось образование исключительно продуктов С-N-электроциклизации. При изучении электроциклических превращений с участием гетеростильбенов, содержащих различные типы гетероциклических остатков, установлено, что механизм отрыва гидрид-иона является общим для фотохимической электроциклизации гетеростильбенов через образование новой связи C-N. Для продуктов циклизации с использованием спектральных методов (спектроскопия поглощения, кругового дихроизма, флуоресценция, ЯМР-спектроскопия) и метода молекулярного докинга на поверхности ДНК (программа ICM-Pro 3.8.6) установлены параметры их взаимодействия с ДНК тимуса теленка (тт-ДНК) и додекамера Дикерсона (ДД). Полученные данные указывают на способность лигандов встраиваться в спираль ДНК, изменяя конформацию ее двойной спирали. Анализ результатов докинга показал, что все исследованные лиганды в процессе связывания с ДНК первоначально локализуются в малой бороздке таким образом, что метоксигруппы оказываются внутри бороздки, а затем - интеркалируют. 2. Проведен синтез новых производных 2-(3,4-диметокистирил)бензотиазола, имеющих заместители при двойной связи C=C. Их строение доказано методами ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа. Однако реакция фотоциклизации была обнаружена только для двух соединений. Соответствующие продукты фотоциклизации были выделены с выходами до 20%, а их строение было установлено с использованием методов ЯМР спектроскопии. Изучение комплексообразования полученных гетероароматических катионов с тимуса теленка (тт-ДНК) позволило установить, что данные соединения являются ДНК-интеркаляторами несмотря на наличие дополнительных заместителей при двойной связи C=C в данных соединениях, что теоретически могло бы изменить способ связывания с ДНК. 3. Было продолжено изучение фотохимических свойств серии бисстириловых красителей, имеющих в своем составе полиоксиалкильный спейсер. Методами ВЭЖХ установлено, что в бисстириловых производных фотоизомеризация происходит последовательно: из E,E- образуется E,Z- и далее - Z,Z- форма соединений. Также было установлено, что фотоциклизация бисстириловых производных с оксиэтиленовым спейсером протекает с участием обоих стирилгетероциклических фрагментов, при этом образуются симметричные гетероароматические дикатионы. Нами было показано, что бисстирилзамещенные азагетероциклы способны вступать в региоселективную реакцию фотоциклизации с образованием новой С-N связи. Бис(стирилизохинолин) при облучении подвергается двойной фотоциклизации с участием обоих стирилгетероциклических фрагментов и образует симметричный гетероароматический дикатион. Анализ спектральных данных поглощения и кругового дихроизма, полученных при изучении взаимодействия данного соединения с тт-ДНК, показал, что дикатион интеркалирует с ДНК, но при этом процесс интеркаляции не приводит к раскручиванию спирали ДНК. 4. Проведена оценка цитотоксичности моностириловых красителей и их фотопродуктов с помощью MTТ-теста на клеточных линиях аденокарциномы простаты человека (PC-3) и меланомы мыши (B16-F10) без облучения или при облучении светом in vitro. Предварительно был подобран оптимальный режим облучения клеток in vitro УФ-лампой (мощность, расстояние от источника света до клеток, время освещения) для фотоактивации моностириловых красителей. Установлено, что все исследованные моностириловые красители без облучения не проявляют цитотоксических свойств, а при их фотолизе в подобранных условиях облучения с концентрацией вещества в клетках 2×10-5 М проявляют хорошие цитотоксические свойства на клетках линий аденокарциномы простаты человека (PC-3) и меланомы мыши (B16-F10) в экспериментах in vitro после инкубации в течение 48 ч. При облучении в тех же условиях, но без добавления исследуемых соединений, гибели клеток не наблюдается, что делает данный метод перспективным для проведения фотореакций in vivo.