Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Все задачи, запланированные на первый год работ по Проекту, решены в полном объеме. Получены следующие основные результаты: С помощью оптимизации принципа спектрально-корреляционной интерферометрии (СКИ) и методов обработки изображений с многоканальных биосенсорных чипов разработан экспериментальный образец оптической системы для исследования в режиме реального времени микро-, нано- и молекулярных биообъектов. Созданный СКИ-прототип успешно протестирован в качестве безмаркерной биосенсорной системы для диагностики аутоиммунных заболеваний путем измерения в клинических образцах сыворотки крови человека концентрации одновременно нескольких аутоантител (молекулярных объектов с размерами 0.3-10 нм). Кроме того, с помощью разработанного инструментария впервые осуществлён количественный мониторинг нативных кинетических параметров аутоантител, что позволяет оценить агрессивность аутоантител к тканям продуцирующего их организма. Разработанный прототип биосенсорной системы и метод регистрации нативной кинетики представляются весьма перспективными для развития новых критериев комплексной диагностики аутоиммунных заболеваний, основанных не только на традиционных измерениях концентрации, но и на количественной оценке агрессивности аутоантител. Помимо этого, разработанный оптический стенд испытан для эпитопной характеризации опухоль-ассоциированных экзосом (объектов с размерами 30-100 нм), выделенным как из клеточных линий, так и из сыворотки крови пациентов. Для реализации высокой производительности исследований живых клеток и бактерий (объектов микронных размеров) и их взаимодействий с адресными частицами, нацеленными антителами, разработаны математические методы и алгоритмы обработки оптических сигналов и изображений. В частности, для анализа большого потока изображений живых клеток (60 тыс. изображений в секунду по 12 оптическим каналам) разработан метод на основе свёрточной нейронной сети (англ. convolutional neural network), позволяющий проводить автоматизированный подсчет клеток, специфично провзаимодействовавших с адресно-нацеленными частицами, надежно отличая их от не связанных частиц, попавших в поле зрения. Разработанные алгоритмы обработки оптических сигналов и изображений клеток успешно продемонстрированы для исследования эффективного и селективного взаимодействия клеток рака молочной железы человека с магнитными частицами, нацеленными моноклональными антителами трастузумаб. Результаты по этой части проекта опубликованы в статье E.N. Mochalova et al. Cytometry Part A, 2019. Кроме того, осознавая высокую социальную значимость исследований по раковым клеткам, в опубликованных онлайн Дополнительных материалах к статье участники проекта выложили в свободный доступ подробные инструкции для разработанного анализа оптических данных и исходный код соответствующего программного обеспечения. Получение указанных выше основных результатов складывалось из выполнения всех конкретных задач, предусмотренных на первый год работы по проекту, а именно: Были разработаны и исследованы новые оптические схемы для создания прототипов автоматизированных комплексов для биологии и медицины на основе спектрально-фазовой интерферометрии. Оптимизированы математические алгоритмы обработки оптических сигналов и изображений. При этом, одним из основных требований к разрабатываемым оптическим схемам являлось использование в качестве двухлучевых интерферометров широкодоступных и недорогих микроскопных покровных стекол, которые, в то же время, применялись в качестве расходных биосенсорных чипов при создании экспериментальных образцов автоматизированных комплексов в рамках данного проекта. На функционализированной поверхности таких сенсорных чипов были реализованы иммунохимические реакции связывания биомолекул из контактирующего раствора. Разработан новый алгоритм обработки информации для измерения оптической толщины сенсорного чипа вследствие связывания его функционализированной поверхности с биомолекулами и нанообъектами. Разработаны и оптимизированы математические алгоритмы быстрой обработки большого массива оптических изображений микрообъектов, а именно: потока клеток, взаимодействующих с рецепторами на частицах, для автоматизации комплексов для биологии и медицины, предназначенных, в частности, для эффективного выявления раковых клеток. Проведены исследования и оптимизированы оптические методы на основе спектрально-корреляционной интерферометрии применительно к задачам мультиплексной иммунохимической диагностики in vitro. Для одновременной регистрации биохимических реакций в нескольких чувствительных зонах, корреляционные сигналы усреднялись по площади каждой зоны распознавания. Отметим, что для реализации разработанного мультиплексного СКИ-метода также использовались широкодоступные покровные микроскопные стёкла в качестве сенсорных чипов. Такие сенсорные чипы не требовали каких-либо дополнительных металлических или диэлектрических покрытий и были конкурентоспособными по стоимости для одноразовых применений, что является необходимым требованием для медицинской диагностики. Функционализация поверхности сенсорных чипов осуществлялась с целью обеспечить возможность эффективной и быстрой иммобилизации биологически активных соединений, а все ее стадии контролировались с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. Разработаны экспериментальные образцы оптических считывающих устройств на основе спектрально-корреляционной интерферометрии, которые позволяют осуществлять безмаркерную регистрацию межмолекулярных взаимодействий в режиме реального времени независимо в каждой сенсорной зоне на поверхности чипов. Разработана методика расчета кинетических констант межмолекулярного взаимодействия по динамике регистрируемых сенсограмм, т.е. зависимостей толщины биослоя на поверхности от времени. С помощью СКИ-прототипов проведены исследования опухоль-ассоциированных экзосом и иммунореагентов для измерения низких концентраций маркеров аутоиммунных заболеваний – аутоантител человека к тиреоглобулину (анти-ТГ) и к тиреопероксидазе (анти-ТПО) в сыворотке крови человека. Также проведен анализ клинических образцов сывороток крови пациентов на содержание анти-ТПО и анти-ТГ аутоантител. Получены калибровочные графики зависимостей откликов СКИ-сенсора от концентрации анти-ТПО и анти-ТГ аутоантител в сыворотке, и установлены пределы обнаружения аутоантител. Полученные величины составили 1,7 МЕ/мл для аутоантител к тиреопероксидазе и 6,7 МЕ/мл для аутоантител к тиреоглобулину, а линейный диапазон детекции равнялся, соответственно, 3 и 2,5 порядка величины концентраций. Достигнутые параметры обеспечивают количественное измерение концентраций анти-ТГ и анти-ТПО во всем диапазоне клинически значимых концентраций. Кроме того, впервые установлены кинетические константы взаимодействия аутоантител с нативными антигенами, на основе которых предложен алгоритм количественной оценки степени агрессивности аутоантител к тканям собственного организма для развития новых критериев комплексной диагностики аутоиммунных заболеваний. Для верификации полученных результатов был проведен корреляционный анализ между разработанной системой и референсным методом на основе стандартного иммуноферментного анализа (ИФА). В проведённых экспериментах использовались клинические сыворотки крови от 5 пациентов, содержащие одновременно аутоантитела анти-ТГ и анти-ТПО в различных концентрациях. Результаты, полученные в этих системах, продемонстрировали высокую степень корреляции (R2 = 0.9506). При этом разработанный в рамках проекта прототип безмаркерной биосенсорной системы обладает в 5 раз лучшим пределом детекции аутоантител и почти на порядок более широким линейным диапазоном определяемых концентраций. Кроме того, традиционные методы определения концентрации аутоантител, в том числе и ИФА, весьма продолжительны и трудоемки. Важными преимуществами разработанного в рамках данного проекта биосенсорного анализа являются малое время его проведения (25 минут), возможность наблюдения всех этапов анализа в реальном времени, недорогие и широкодоступные расходные материалы, отсутствие каких-либо меток, а также возможность мультиплексирования, реализованная в данном исследовании для одновременной детекции анти-ТГ и анти-ТГ в одном образце. Полностью выполнены публикационные обязательства по первому году работы по проекту. Опубликована статья E.N. Mochalova et al. Cytometry Part A, 2019, https://doi.org/10.1002/cyto.a.23939, в журнале, индексируемом в базах данных Web of Science и Scopus и входящим в первый квартиль Q1 согласно http://www.scimagojr.com/, что, по условиям данного конкурса РНФ, засчитывается за 2 публикации. Кроме того, полученные результаты были представлены в качестве 7 докладов на ведущих международных конференциях, из которых 5 - устные и 2 – стендовые.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработанная оптическая биосенсорная система успешно протестирована на примере высокочувствительных безмаркерных измерений концентрации аутоантител для диагностики заболеваний щитовидной железы, а соответствующие результаты опубликованы в статье Orlov et al. Biosensors & Bioelectronics, V.159, P. 112187, 2020 (Q1, импакт-фактором 10,277). Для этого были оптимизированы методы низкокогерентной интерферометрии, в том числе, с целью устранения недостатков, выявленных в ходе экспериментов в течение первого года работы по проекту. Разработаны новые алгоритмы подавления и компенсирования температурных дрейфов, спектральных сдвигов максимума распределения излучения суперлюминесцентных диодов, гистерезисных явлений пьезокерамических материалов, используемых для сканирования базы интерферометров. Выбраны оптические схемы прототипов автоматизированных комплексов для биологии и медицины, оптимальные с точки зрения дальнейшего повышения чувствительности и уменьшения шумов базовой линии за счет совершенствования алгоритмов обработки сигналов передовыми процессорами. Конструкция прототипа была оптимизирована с точки зрения достижения высокой воспроизводимости измерений, стойкости к внешним вибрациям и температурным колебаниям. Получены результаты скрининга, выбраны оптимальные иммунореагенты и развиты методики модификации сенсорных чипов для создания биосенсорных систем, предназначенных для быстрого измерения концентраций низко- и высокомолекулярных биомаркеров. Развита методика модификации поверхности для повышения качества ковалентной иммобилизации белковых конъюгатов низко- и высокомолекулярных соединений на сенсорной поверхности. С использованием разработанных прототипов и сенсорных чипов выбраны оптимальные иммунореагенты для измерения концентраций низко- и высокомолекулярных биомаркеров. Определены такие аналитические характеристики, как предел детекции, линейный и динамический диапазон определяемых концентраций. Получены результаты сравнительных экспериментальных исследований с помощью разрабатываемых экспериментальных стендов и современных референтных иммунохимических аналитических методов. Продемонстрирована специфичность биосенсорных систем в присутствии добавленных в анализируемый раствор нецелевых молекул. Исследован эффект взаимного влияния между различными протеинами, иммобилизованными на сенсорном чипе для целей одновременной регистрации различных биомаркеров в разных чувствительных зонах одного сенсорного чипа. Исследовано влияние на сигнал скорости пропускания реагентов и кислотности растворов. Проведено сравнение разработанного метода с альтернативными подходами. Разработаны и протестированы методы дальнейшего усиления сигналов и улучшения пределов детекции интерферометрических биосенсорных систем с помощью различных наночастиц. Кроме того, проведены предварительные эксперименты, продемонстрировавшие успешное применение разработанного экспериментального стенда для исследований микро-, нано- и молекулярных биообъектов, что было представлено в совместной работе с медицинскими центрами РФ и Германии – Znoyko et al. IEEE Xplore 2020. С помощью разработанных экспериментальных стендов получены предварительные результаты по оптимизации оптических методов и автоматизации быстрых алгоритмов обработки информации для увеличения эффективности исследований по воздействию на раковые клетки нацеливающими наноагентами, предназначенными как для диагностики, так и терапии заболеваний, а также по изучению внеклеточных везикул и опухоль-ассоциированных экзосом. На основе разработанных высокочувствительных методов оптических измерений и алгоритмов математической обработки сигналов проведено исследование биораспределения и фармакокинетики различных флуоресцентно меченных нано- и микрочастиц с использованием оптического биоимиджинга лабораторных животных с привитыми раковыми опухолями, представленное в работе Pushkarev et al. IEEE Xplore 2020. Полученные научные результаты представлены в качестве двух докладов на on-line конференции 6th International A.M. Prokhorov Symposium on Lasers in Medicine and Biophotonics, November 2-6, 2020, St. Petersburg, Russia. Доклад по результатом проекта принят в качестве устного на XV Worldwide Conference on optical, chemical sensors and biosensors, Europt(r)ode XV, April 05-08, 2020, Warsaw, Poland, которая передвинута на 2021 г. из-за пандемии, как и многие другие запланированные ведущие международные конференции. По результатам, полученным в ходе проекта, опубликовано 3 печатные работы в журналах, индексируемых в базах Web of Science и Scopus, из них одна – в высокоимпактном журнале Biosensors and Bioelectronics первого квартиля Q1 (с импакт-фактором 10,277, засчитываемая за две статью по правилам конкурса). Нарастающим итогом выполнены публикационные обязательства и в рамках двух лет проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На основе низкокогерентной интерферометрии разработан экспериментальный стенд, эффективно использованный для характеризации внеклеточных везикул, в том числе опухоль-ассоциированных экзосом. Проведён скрининг и выбор оптимальных антител для везикул, выделенных из клинических образцов. Разработаны прототипы многоканальных аналитических систем на основе спектрально-корреляционной интерферометрии, предназначенные для скрининга и мониторинга кинетики взаимодействия белковых биомаркеров заболеваний со множеством распознающих антител. Эффективность разработанных систем была продемонстрирована на примере выбора поли- и моноклональных антител для диагностики инфекционных заболеваний, в частности, вирусов гепатита B в клинических образцах (Bragina et al., Analytical Methods, 2021). Для этого в режиме реального времени с высокой чувствительностью измерялась усредненная по сенсорной зоне толщина образования комплексов антител с поверхностным антигеном вируса гепатита B (HBsAg). По кинетике изменения оптической толщины комплексов были вычислены константы ассоциации и диссоциации взаимодействующих молекул, а также константы равновесной диссоциации. Аналогичным образом были определены аффинные свойства взаимодействия ряда лигандов с различными распознающими молекулами, в том числе иммобилизованными на гибридных наноструктурах для задач биосенсорики и адресной доставки лекарственных препаратов к клеткам и раковым опухолям, привитым к лабораторным животным. В частности, выбранные с помощью созданных оптических аналитических систем антитела к HBsAg, характеризующиеся наиболее высокой скоростью ассоциации и медленной скоростью диссоциации с антигеном, а также низким неспецифическим связыванием, были использованы для разработки иммунохроматографического (ИХА) формата анализа на основе магнитных нанометок. В результате оптимального выбора захватывающих и трассирующих антител разработанный метод обнаружения HBsAg в сыворотке продемонстрировал рекордный предел детекции 80 пг/мл в широком диапазоне концентраций более 2,5 порядков при времени анализа менее 30 мин. Примечательно, что при этом не применялось каких-либо дополнительных процедур и усилений сигнала. Достигнутые аналитические характеристики значительно превосходят характеристики других наиболее чувствительных традиционных ИХА на основе оптических меток, а также чувствительность традиционных лабораторных методов для обнаружения HBsAg, например твердофазных иммуноферментных анализов (Bragina et al., Analytical Methods, 2021). Разработанные биоаналитические методы могут быть использованы во многих социально-значимых областях, например во внелабораторном скрининге и диагностике инфекций, вызванных вирусом гепатита В, по месту требования. Это особенно важно для труднодоступных или малонаселенных регионов. Кроме того, путем замены соответствующих распознающих антител разработанные аналитические методы могут быть успешно распространены на другие задачи. Для повышения эффективности исследований по адресной доставке лекарственных препаратов на магнитных наноносителях к клеткам в экспериментах in vitro и in vivo к раковым опухолям, привитым лабораторным животным, а также для долговременного мониторинга биодеградации таких носителей в организме после выполнения возложенных на них функций разработан новый магнитоспектральный метод (Zelepukin et al. ACS Nano. 2021). С помощью созданного на его основе оригинального экспериментального стенда впервые была неинвазивно исследована in vivo долговременная (в течение 1 года) биодеградация 17 различных типов наночастиц на основе оксидов железа. В подавляющем большинстве наночастицы скапливаются в печени и селезёнке. Установлены основные закономерности процессов биодеградации наночастиц в зависимости от таких параметров, как доза введённых частиц, гидродинамический радиус, дзета-потенциал, материал покрытия и внутренняя структура частиц. Продемонстрировано, например, что покрытие частиц 39-нм слоем полистирола замедляет время деградации частиц с 40 дней до 1 года. Показано, что биодеградация наночастиц in vivo с течением времени носит моноэкспоненциальный характер для введённых доз. Увеличение дозы наночастиц в 60 раз приводит к увеличению времени их биодеградации от 4,3 до 43 дней. При этом снижение катаболической активности нелинейно зависит от введённой дозы. Продемонстрировано, что с уменьшением гидродинамического размера частиц наблюдается тенденция к увеличению скорости биодеградации in vivo. Показано, что покрытие частиц также вносит значительный вклад в характер биотрансформации частиц. Для наночастиц с диаметром 100 нм, имеющих различные полимерные оболочки, время полуразложения в организме увеличивалось в ряду глюкуроновая кислота < хитозан < полиакриловая кислота < карбометилдекстран < полистиролсульфонат < полиэтиленгликоль. Как видно из данного ряда, частицы с покрытием из полиэтиленгликоля имеют наибольшее характерное время деградации при том, что данный материал широко применяется в наномедицине для целевой доставки лекарств. Проанализированы возможности доставки генетического материала в клетки с использованием магнитных наночастиц, контролируемых внешним магнитным полем. Установлено влияние различных физико-химических свойств наноагентов на их фагоцитоз макрофагами с целью создания высокоэффективных агентов для направленной доставки лекарственных препаратов для подавления раковых опухолей у животных (Drozdov et al., International Journal of Molecular Sciences, 2021). Результаты комплексного анализа данных показывают оптимальные стратегии повышения эффективности активно нацеливаемых лекарственных средств на основе адресных наночастиц. Все запланированные на 2021 год работы и публикационные обязательства выполнены полностью. По результатам, полученным в ходе проекта в 2021 году, опубликовано 3 печатные работы в журналах первого квартиля Q1, индексируемых в базах Scopus и Web of Science Core Collection (в том числе с импакт-факторами 15,881 и 5,924), засчитываемых за 6 статьей. Нарастающим итогом полностью выполнены публикационные обязательства и в рамках трех лет проекта. Кроме того, полученные в 2021 научные результаты были представлены научной общественности в качестве 5 приглашенных докладов, одного устного и двух стендовых докладов на ведущих международных и российских конференциях.